沙冬青的焦磷酸酶及其編碼基因與應用的製作方法

2023-10-04 11:51:54

專利名稱：沙冬青的焦磷酸酶及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物基因工程技術領域，具體涉及一種液泡膜焦磷酸酶及其編碼基 因與應用，特別是涉及沙冬青的焦磷酸酶及其編碼基因與應用。
背景技術：
鹽害和乾旱是限制農作物生長的兩大限制因子。中國的乾旱區面積佔全國總面 積的1/3，鹽鹼土廣泛分布於其中，乾旱與鹽漬並存嚴重限制了我國農作物產量的提高和 農業發展。因此，了解和研究植物耐鹽鹼抗乾旱脅迫的機制；從我國特有的資源生物中 克隆抗鹽耐乾旱基因，獲得寶貴的基因資源；培育耐乾旱耐鹽鹼農作物具有重要的現實 和戰略意義。植物在長期進化過程中，形成了一系列抵抗乾旱和鹽漬脅迫的適應機制。如在 細胞中積累無害的可溶性小分子物質；通過Na+外排途徑將Na+排出細胞以及提高下遊抵 抗氧化傷害的抗氧化酶的活性等等。其中通過Na7H+反向轉運蛋白在液泡中積累Na+— 方面可以降低Na+在細胞質的含量，降低Na+的毒害性；另一方面還可以降低細胞水勢， 能夠讓植物在高鹽溶液中獲得和保持更多的水分[Cixin He等(2005)，Plant Cell Physiol. 46(11):1848—1854]。NHX基因家族是植物中Na+區隔化至液泡的關鍵基因，而液泡膜焦磷酸酶 則為Na+區隔化過程提供質子電化向學梯度[Gao F等，Cloning of an H+-PPase gene from Thellungiella halophila and its heterologous expression to improve tobacco salt tolerance. Journal of Experimental Botany 57:3259-3270 (2006)]。迄今為止，人們已經從擬南芥、小 麥、鹽芥等植物中分離得到了液泡膜焦磷酸酶基因[GaxiolaRA等(2001) Drought- and salt-tolerant plants result from overexpression of the AVPl H+-pump. P Natl Acad Sci USA 98:11444-11449; Brini F 等(2007) Overexpression of wheat Na+/H+ antiporter TNHXl and H+-pyrophosphatase TVPl improve salt- and drought-stress tolerance in Arabidopsis thaliana plants. Journal of Experimental Botany 58:301-308 ； Gao F 等(2006), Cloning of an H+-PPase gene from Thellungiella halophila and its heterologous expression to improve tobacco salt tolerance. Journal of Experimental Botany 57:3259-3270]。人們已經對焦磷酸酶基因的結 構功能已研究得較為詳細。目前，研究人員已經對焦磷酸酶基因進行了酶學性質、分子 結構、表達調控、酵母突變體的功能互補以及過量表達等多方面的研究。焦磷酸酶基因 對於植物的耐鹽性、體內離子動態平衡以及整個的植物發育過程，都起到非常重要的作 用。焦磷酸酶基因是迄今為之，單個基因改良植物耐鹽抗旱性狀最有效的基因之 一。在擬南芥，番茄，苜蓿，剪股穎，棉花等植物中過量表達焦磷酸酶基因均能夠有 效提高植物耐鹽性甚至抗旱性(Gaxiola RA 等(2001) Drought- and salt-tolerant plants result from overexpression of the AVPl H+-pump. P Natl Acad Sci USA 98:11444-11449; Park S 等(2005) Up-regulation of a H+-pyrophosphatase (H+-PPase) as a strategy toengineer drought-resistant crop plants. P Natl Acad Sci USA 102:18830-18835 ； Bao AK 等 (2009) Overexpression of the Arabidopsis H+-PPase enhanced resistance to salt and drought stress in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.). Plant Sci 176:232-240 ； Li ZG 等(2010) Heterologous expression of Arabidopsis H plus -pyrophosphatase enhances salt tolerance in transgenic creeping bentgrass (Agrostis stolonifera L.). Plant Cell Environ 33:272-289 ； Lv S 等(2008) Overexpression of an H+-PPase gene from Thellungiella halophila in cotton enhances salt tolerance and improves growth and photosynthetic performance. Plant Cell Physiol 49:1150-1164 ； Lv SL 等(2009) Overexpression of Thellungiella halophila H+-PPase (TsVP) in cotton enhances drought stress resistance of plants. Planta 229:899-910)。沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus (Maximl)Cheng Fl)又名蒙古沙冬青、蒙 古黃花木，是古老的第三紀殘遺種，也是迄今為止我國溫帶荒漠的惟一珍貴常綠灌木，是 阿拉善荒漠區所特有的建群植物(郭生祥，甘肅林業科技，第30卷第4期，2005年12 月)。沙冬青不僅具有極強的抗乾旱性，抗高溫，耐低溫以及抗風蝕沙埋還具有很強的 抗鹽性，種子能夠在含有200mm NaCl的MS培養平板上正常生長。目前對沙冬青的耐 逆性研究僅停留在生理生化階段，從遺傳上闡述沙冬青的抗逆性機制是一片空白。因此 藉助擬南芥模式生物，挖掘沙冬青重要的抗逆性基因資源，並應用到農作物抗逆性狀改 良上具有重要的意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種沙冬青焦磷酸酶及其編碼基因與應用。本發明所提供的沙冬青焦磷酸酶，是具有SEQ ID N0.2胺基酸殘基序列的蛋白 質或者是將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加具 有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。沙冬青焦磷酸酶的編碼基因，是下列核苷酸之一 1) SEQ ID NO. 1所示的DNA序列。2)編碼SEQ ID N0.2所示胺基酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO. 1由2875個鹼基組成，該基因的讀碼框為自5，端第353位至第2668 位鹼基；SEQ IDN0.2由771個胺基酸殘基組成。含有本發明基因的表達載體和細胞系均屬於本發明的保護範圍。本發明的基因 將在沙冬青耐鹽耐旱分子機制研究，植物耐鹽耐旱性狀改良中發揮重要作用。


圖1為RACE-PCR電泳圖譜。圖2為AmVPl同幾種重要物種焦磷酸酶的多重序列比對。圖3為RT-PCR鑑定轉基因植株XmWV表達水平電泳圖。圖4為轉基因植株的抗旱性。圖5為轉基因植株的抗鹽性。
具體實施例方式實施例1、沙冬青焦磷酸酶基因的獲得。1.1沙冬青鹽脅迫處理
沙冬青種子用0.01% HgCl2表面滅菌15 min,無菌水衝洗5次,37°C無菌水浸泡過夜 後移至1/2 MS + 1.5%蔗糖+ 1.0%瓊脂+200mmNaCl鹽脅迫培養基上。在16h L/8h D 光照，24°C條件下培養一周。1.2 RNA 提取
取經過鹽脅迫處理的沙冬青幼根材料約O.lg。液氮充分研磨後，轉移到1.5ml離心 管，加ImlTRΙζοΙΦ (invitrogen公司)，混勻後，室溫放置
15 min,加0.2ml氯仿異戊醇(24:1)，劇烈搖動15 s後室溫放置5 min，13000rpm, 4°C 離心15 min。取上清液並加入等體積異丙醇，小心混勻，室溫放置15min，13000rpm, 41離心151^11。70%乙醇洗滌沉澱，室溫乾燥15 min。溶解於適量的經0.1% DEPC處 理過的ddH20水中，貯存於-80°C備用。1.3 cDNA第一鏈合成和反轉錄PCR
採用上海申能博彩生物技術公司(SHBC)的cDNA第一鏈合成試劑盒，按照操作 指南將總RNA反轉錄成cDNA。反應體系和反應條件分別為2 μ g製備的總RNA， 0.5 μ 1 Rnase inhibitor,力口 DEPC 處理過的去離子水至 8.5 μ 1, 2 μ 1 的 Oligo (dT) 18 primer. 65°C ,5min,室溫放置 lOmin，13000rpm 簡短離心 5s。再依次加入 4 μ 1 5 XFirst-Strand buffer, 0.5 μ 1 RNase Inhibitor, 2 μ 1 IOOmM DTT, 2 μ 1 dNTP, 1 μ 1 MMLV Reverse Transcriptase。小心混勻；37°C反轉錄1小時，90°C 5分鐘；冰上冷卻；13000rpm短暫 離心5秒鐘，存放於-20°C待用。1.4 RT-PCR擴增AmVP 1基因中間片斷
根據以往在其他植物中克隆到的Na7H+轉運蛋白基因的保守序列，設計了兩條同源 兼併弓丨物 AmNHXlCF (5'GCCTATAATATTCAATGCAGGGTTTCA 3』)禾口 AmNHXlCR (5'GTCCAGGGCATCCATACCAACATA 3』) (SEQ ID N0.3)作為 PCR 反應的引物。 PCR反應體系為50 μ 1，反應條件為94°C預變性5min，94°C變性40s，55°C復性40s， 72°C延伸60s，循環35次。72°C充分延伸lOmin。將所得的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠 電泳分離獲得一段約900bp的片斷。回收並且通過TA克隆至TAKARA pMD_19_T載體 後，由上海英駿公司測序，獲得乂m^V的中間序列。1.5 RACE法擴增Am KW基因的3 』末端序列
AmVP 1基因的3 』末端序列擴增使用Clontech公司的BD-SMARTTMRACE試劑盒。 根據已經獲得的保守序列設計了兩個特異性引物進行巢式PCR反應。AmVPlV RACEF 5' CTGGGCTGGACTTATTATTGGGTTTGTG 3' AmVPlV RACENF 5』 GATGTTGCTGATTCCTGCCG 3』
(SEQ ID N0.4) 反應條件分別為
第一輪PCR反應94°C預變性5min，94°C變性40s，53°C復性40s，72°C延伸90s， 循環35次。72°C充分延伸lOmin。第二輪PCR 反應94°C預變性 5min，94°C變性 40s，56°C 復性 40s，72°C延伸90s，循環35次。72°C充分延伸lOmin。第二輪PCR反應結束後，電泳檢測，獲得約1200bp的片段，割膠回收並克 隆至克隆載體進行測序，獲得3』末端序列。1.65，RACE法擴增Am VPl基因的末端序列
按照Takara5』 FULL-RACE (Code D6122)方法，依次經過cDNA第一鏈的合 成，Hybrid RNA的分解，連接反應(單鏈cDNA環化或形成首尾連接物)，以及兩輪 PCR反應，再經瓊脂糖凝膠電泳分離獲得約600bp的PCR片斷。最後經割膠回收，克隆 至克隆載體，測序，最終獲得AmVPl基因的5』末端序列。Am VPl5，末端 P 標記反轉錄弓丨物5』 ACAGACAAGAATGCC 3』 (SEQ ID N0.5) 1st PCR Al: 5』 TGGGGTCTGATCTTTTTGGT 3』
1st PCR Si: 5』 CAGATCAGCACCGACATCAG 3』 (SEQ ID N0.6)
2nd PCR A2: 5』 TCAACCATGATTTCACTGCC 3』
2nd PCR S2: 5』 GATACCACCACCGACTCTCC 3』 (SEQ ID N0.7)。第一輪PCR反應條件94°C預變性5min，94°C變性40s，60°C復性40s，72°C延 伸60s，循環35次。72°C充分延伸lOmin。第二輪PCR反應條件94°C預變性5min，94°C變性40s，57°C復性40s，72°C延 伸60s，循環35次。72°C充分延伸lOmin。全長基因的克隆
根據已經獲得的乂末端序列和5』末端序列以及中間序列拼接獲得了 AmVPl的全長序列，並設計了如下一對引物擴增XfflW^編碼區。AmVPlELF 5』 TTTTTTTCTGGCGAGGATGG 3』 AmVPlELR 5』 CAGATCAGCACCGACATCAG 3』 (SEQ ID N0.8)
PCR反應條件如下94°C預變性5min，94 °C變性40s，52 °C復性40s，72°C延伸 150s，循環35次。72°C充分延伸lOmin。1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑑定，獲得了約2.2kb的片段，並克隆測序。實施例2 沙冬青焦磷酸酶基因功能分析。2.1序列比較分析
多序列比對使用Genedoc軟體，ORF (Opening Reading Frame )查找使用分子分 析軟體Lasergene6.0進行。ORF翻譯使用Primer5軟體。多重序列比對表明，AmVPl 與擬南芥，菸草，水稻，玉米，大麥，高粱等不同植物來源的焦磷酸酶蛋白序列具有很 高的同源性，如附圖2所示。各蛋白基因登錄號如下AtVPl,擬南芥液泡膜焦磷酸酶 (NP_173021) ； NtVPl，菸草液泡膜焦磷酸酶(CAA58701) ； OsVPl，水稻液泡膜焦磷 酸酶(BAA31523) ； ZmVPl,玉米液泡膜焦磷酸酶(CAG29370 ) ； HvVPl,大麥液泡膜 焦磷酸酶(Q06572 ) ； TaVPl,高粱液泡膜焦磷酸酶(ABX10014)。2.2擬南芥轉基因分析。2.2.1植物表達載體構建
利用引物 AmVPlP (￡mri5nTTnTOGGOGAGGATGG3,ie^gGAGArCAGCAOOGACmAG3) (SBQIDM).9)擴增出如奶^^馬區，並克隆至pMDlFTM (Bkaa)，測序後。分別M BamBJl, Sail鵬切，回僻屯化目的片斷，並餓到紐同樣兩^SW切，純化的pRZPY122載體上。
2.2.2農桿菌轉化。2.2.2.1 LBA4404農桿菌感受態細胞製備
1)在含利福黴素40μ g/ml,鏈黴素100 μ g/ml的YEB固體培養基上劃線，28°C培養 48h-72h ；
2)挑單菌落到含利福黴素40μ g/ml,鏈黴素100 μ g/ml的YEB液體培養基中28°C培 養至 OD600 0.5 ；
3)冰上冷卻菌液，5000rpm,4 °C 10分鐘收集菌體；
4)ImM Hepes pH 7.0洗滌3次，再用10%甘油洗滌一次；
5)懸浮菌體於3ml10%甘油中，分裝到1.5ml離心管中，每管40ul。2.2.2農桿菌轉化
1)200ng質粒DNA，加40ul農桿菌感受態細胞混勻後按以下條件進行電轉化 U 1.8 KV
R 200 W C 25 UF ；
2)電擊後添加800μ 1 SOC液體培養基，28°C培養Ih ；
3)4000rpm, 10分鐘收集菌體，懸浮於200 μ 1 SOC中，塗在含12 μ g/ml氯黴素， 利福平40 μ g/ml,鏈黴素100 μ g/ml YEB固體培養基上，28°C倒置培養48h_72h。2.2.3農桿菌介導的擬南芥轉化。2.2.3.1擬南芥基質培養
基質組分蛭石黑土 珍珠巖9 3 0.5 營養液組分
權利要求
1.一種沙冬青焦磷酸酶，其特徵在於為具有SEQ ID N0.2所示胺基酸殘基序列的蛋白質。
2.沙冬青焦磷酸酶編碼基因，其特徵在於DNA序列為SEQID N0.1所示序列，或為 編碼SEQ ID N0.2所示胺基酸序列的多核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述的沙冬青焦磷酸酶編碼基因，其特徵在於該基因的編碼框 為自5，端第353位到第2668位鹼基的DNA序列。
4.含有權利要求2或3所述沙冬青焦磷酸酶的編碼基因的表達載體。
5.含有權利要求2或3所述沙冬青焦磷酸酶的編碼基因的細胞系。
6.如權利要求2或3所述沙冬青焦磷酸酶的編碼基因在植物耐鹽耐旱性狀改良中的應
全文摘要
本發明屬於植物基因工程技術領域，具體為一種沙冬青的焦磷酸酶及其編碼基因與應用。本發明所提供的焦磷酸酶基因，來源於沙冬青，名稱為AmVP1,其胺基酸序列如SEQIDNO.2所示。沙冬青焦磷酸酶的編碼基因，是下列核苷酸序列之一SEQIDNO.1；SEQIDNO.2胺基酸序列的多核苷酸。本發明的基因可用於沙冬青抗鹽耐旱分子機制研究，用於改良植物抗鹽耐旱性狀。
文檔編號C12N15/63GK102002485SQ201010519920
公開日2011年4月6日 申請日期2010年10月26日 優先權日2010年10月26日
發明者梁寧菁, 蒯本科, 郭玉娟, 魏強 申請人:復旦大學