使用工程誘殺蛋白的液相生物淘選方法

2023-10-04 06:04:44 3

專利名稱：：使用工程誘殺蛋白的液相生物淘選方法
技術領域：
：本發明涉及到通過使用組合抗體噬菌體展示文庫來選擇結合於所選表位上的抗體的方法。本發明也涉及通過這種方法製備的抗體。相關技術後基因組時代中的藥物研發工作，現在已集中於尋找能特異性阻斷關鍵蛋白的功能方法，之前已通過如微陣列技術分析疾病狀態下mRNA的表達水平來鑑別這種關鍵蛋白。蛋白質組學是一門新的學科，包括在協同途徑中並作為結合配偶體來看待蛋白分子間的相互作用方式。蛋白質的構效關係包括常規結構域作圖和鑑別功能相關的三維(3D)構象信息。認識蛋白三維(3D)結構信息的方法也已經常規化。例如NCBI維護的公開使用的工具，名為VAST，結構相似性搜索服務。它將新確定蛋白的三維結構與大分子結構資料庫(molecularmodelingdatabase(MMDB))和蛋白數4居庫(PDB)進行比較。噬菌體展示技術是一種體外選擇技術，它將多核香酸序列編碼的肽或蛋白與噬菌體的一種外殼蛋白進行遺傳上的融合，使融合蛋白展示於噬菌體病毒粒子的外部，而編碼融合蛋白的DNA位於病毒體內。這種展示蛋白與其編碼DNA之間的物質聯繫使得能夠通過一種稱為"生物淘選(biopanning)"的簡單的體外選擇方法來篩選大量的變異蛋白，這些變異蛋白的每個都與其相應的DNA序列相聯4系。噬菌體、核糖體、酵母和細菌展示文庫都是大量篩選蛋白或肽的工具。核糖體展示方法是將mRNA翻譯為其相應蛋白，同時保持蛋白附著於RNA。通過RT-PCR得到核苷酸編碼序列(Mattheakis,L.C.etal.1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,9022)。酵母展示是基於構建與膜相聯的a-凝集素酵母結合受體融合蛋白，agal和aga2，以及部分接合型(matetype)系統(Broder,etal.1997.NatureBiotechnology,15:553-7)。細菌展示是基於構建靶蛋白與細菌輸出蛋白(與細胞膜或細l包壁相關)的融合蛋白(ChenandGeorgiou.2002.BiotechnolBioeng，79:496-503)。與雜交瘤技術相比，噬菌體和其它抗體展示技術提供了在體外針對抗原進行操作選擇的可能性，而無對抗原的宿主效應的潛在限制，反之亦然。體外選擇的一個特有優勢在於能夠選擇得到結合在耙蛋白多樣性位點上的抗體。儘管噬菌體文庫簡化了功能屬性相關的遺傳物質的回收，但仍需要多級淘選的策略以從文庫中純化出最優的候選分子。另一方面，在已知多肽配體功能域的結構信息時，就需要有能夠選擇結合於配體特定結構域上的抗體或其它結合配偶體(如肽或蛋白)的方法。結構域或表位定向淘選已成為選擇結合於靶蛋白的抗體的常規方法。這種選擇主要是使用已知的多種方法，如選擇性淘選、淘汰淘選(de-selectivepanning)、配體捕捉、消減淘選或引導選擇(pathfinderselection),來實現抗體的逐步選擇(上文Hoogenboom，H.R.等(2000))。在消減淘選中，具有重疊區域(overlapping)但結合位點不完全相同的靶分子，可被用來淘汰不需要的結合體(binders)。這種方法已被用來鑑別與未知抗原結合的結合體，例如用在正常細胞中淘汰與癌細胞結合的結合體。也可選用包含一些共同結構域或結構的天然蛋白進行連續或竟爭性選擇，以獲得與相關抗原中相異或共有位點結合的抗體。典型的這種研究使用與生物化學運動性或與H-ras蛋白相關的天然蛋白(Horn,I.R.etal.1999,FEBSLett.463:115-120)。配體捕捉定向淘選與ELISA夾心法類似，都使用無關和非鄰近表位的固定抗體來捕捉靶配體並使其呈現優選結合面，以進行^菌體淘選(US6376170)。其他研究者使用竟爭性抗體來選擇性掩飾非目的靼結構域上的抗原(Tsui，P.etal.2002.J.Immunol.Meth.263:123-132)。引導選擇方法使用單抗和多抗，也使用與辣根過氧化物酶(HRP)直接或間接偶聯的天然配體。在酪胺生物素存在時這些分子催化與靶抗原緊密結合的噬菌體發生生物素醯化，從而可以使用鏈黴抗生物素蛋白從全部噬菌體中特異性回收"標記"虔菌體。這種方法選擇性回收了結合於耙分子本身或其鄰近部位的嗟菌體(Osborn，J.K.etal.1998.Immunotechnol.3:293-302)。使用單克隆抗體定向結合於交替位點也被稱為"表位步查"(epitopewalking)(上文Osbom，J.K.etal.1998)。這些方法的缺陷在於，在進行得到與目的結構域結合的結合配偶體的工作之前，必須先進行大量工作以得到並鑑定非目的結合配偶體，缺陷還在於沒有對特異表位進行靶定位。本發明提供了通過在淘選步驟中使用雜合竟爭性蛋白，得到結合於選定表位的抗體或配體結合配偶體的新型方法。發明概述本發明提供了通過在淘選步驟中使用工程誘殺配體，來選擇結合於預定結構域上的配體-結合配偶體的新型方法。設計誘殺配體，使其與靶蛋白僅在預定的結構域上不同，而該結構域構成公認的結合位點。可根據實際測量的結構數據(如X射線晶體衍射數據)或計算數據(來自三維結構模型的電腦計算)來設計誘殺蛋白。當得到結構信息後，誘殺蛋白的設計就簡單了。如果沒有結構信息或者信息不全，可根據天然變異蛋白(如種同源蛋白)來修飾序列的關鍵區域以製備誘殺物。本發明進一步涉及到編碼誘殺蛋白的核酸，它可用於在宿主細胞或生物中表達誘殺蛋白。如果對宿主細胞進行轉染，那麼誘殺蛋白可以在細胞表面表達，或者誘殺蛋白是宿主的分泌型游離蛋白並可以從細胞培養基中回收。誘殺蛋白可以在異源環境(如細胞表面)進行純化或使用。在生物淘選步驟中，維持靶分子與誘殺蛋白的摩爾比以淘汰非特異性和低親和結合體，而僅回收與靶分子結合的結合體。在這種方法中，根據特異性結合靶蛋白結合位點(此位點在誘殺蛋白中發生變化，因此已知與目的結構域相互作用)的能力，從文庫中選出與其同源遺傳物質融合的蛋白結合配偶體。另一方面，本發明選擇結合預定表位的抗體的方法可用來將在一個物種(如動物模型)中證明有效的治療性靶抗體或配體結合體的所需特性，直接轉移至類似的生物治療藥以有效治療其它物種。可將人類生物藥物方便的轉化為其同源物，用來在該動物屬或種中以類似的作用機制治療其它目的哺乳動物，如牛、豬、家禽、狗、貓或其它農業重要動物或家養動物。在本發明的一個實施方案中，此方法被用來選擇與具有相同三維結構域的同源蛋白相互作用的抗體，此抗體被作為參考抗體。這一點在已知一種可與人抗原特定區域結合的單抗，並想重新得到與相同表位結合的結合配體(如人抗原的抗體)時特別有用。在另一實施方案中，當已有結合於人抗原表位的抗體，需要有在其它目的動物(如小鼠)中與相應蛋白的相同表位作用的代替抗體用於研究時，這種方法是有效的。在這種方式下，可得到與原始抗人抗體性質相似的抗鼠抗體。因此，一方面本發明提供了從文庫中選擇封閉多肽配體結合配偶體的方法，其中待結合配體的特異功能域被預先確定，該方法步驟包括a)確定待封閉蛋白的功能域，b)分析該配體的一種或多種物種同源物或功能同源物與該配體間的共同結構特徵，c)構建參入有配體及所選同源物的所述共同結構特徵的誘殺物，其中該誘殺物具有待封閉功能域以外區域的共同結構特徵d)使用所述誘殺物(使用量大於該配體結合配偶體)以選擇優先結合於待封閉功能域的結合體。另一方面，本發明提供了鑑別可結合於靶蛋白預定表位上的多肽的方法，其步驟包括a)建立一個在其表面表達多肽的噬菌體顆粒文庫，b)製備誘殺蛋白，其相應於靶蛋白預定表位的胺基酸序列發生了變化，c)將噬菌體顆粒文庫與靶蛋白一起溫育以選擇表面多肽與靶蛋白結合的噬菌體，d)加入過量摩爾濃度的誘殺蛋白作為竟爭劑，以負選擇特異於預定表位的噬菌體顆粒，e)將結合於靶蛋白的噬菌體從結合於誘殺蛋白的噬菌體中分離出，f)回收結合於靶蛋白的噬菌體顆粒。附圖簡述圖l是本發明方法的示意圖。圖2是結合mTF的重要候選Fab的CDR序列和構架排布。圖3表示本發明方法所選的抗體與靶蛋白(mTF，實線)和誘殺蛋白(hu/mTF(改變了預定表位中兩胺基酸)，虛線)的結合作用的濃度依賴性。圖4是選出的兩種與mTF結合的Fab的濃度-相對螢光單位曲線。圖5是來自不同物種的IL-13蛋白的多序列比對。圖6A&6B是來自hlL-4晶體學數據的能量和面積大小(areadimension)。圖7A&7B根據IL-4晶體學數據計算的hIL-13的能量和面積大小。縮寫Abs:抗體，多克隆或單克隆bFGF:^喊性成纖維細胞生長因子GM-CSF:粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子IL:白細胞介素Mab:單克隆抗體TF:組織因子FIIV:第IIV因子(無活性)FIIVa:第nVa因子(活化)FX:第X因子(無活性)Fxa:第Xa因子(活化)發明詳述概念定義"抗體"指免疫球蛋白或者來源於免疫球蛋白的結合片段。雖然不是所有免疫球蛋白都與抗原結合，但已知抗體片段可以結合抗原、靶多肽或蛋白以及其它分子。因此這裡所用的"抗原結合片段"包括但不僅限於(i)Fab片段，它由抗體重鏈(H)和輕鏈(L)的可變區(V)連同各自恆定區(C)組成(VL-CL和VH-CH1區)；(ii)Fd片段，它由VH和CHI區組成；(iii)Fv片段，它由單鏈抗體的VL和VH區組成；(iv)dAb片,殳(Ward,E.S.etal.，Nature341:544-546(1989)),它由VH區組成；(v)分離的CDR區；(vi)F(ab，)2片段；(vii)單鏈Fv分子(scFV),其中VH區和VL區由多肽接頭連接，從而使兩個區域結合形成抗原結合位點；(viii)雙特異單鏈Fv二聚物；(ix)包含上述蛋白的重組蛋白和融合蛋白，包括但不限於雙抗體、多價或多特異性片段，或其它能結合粑多肽並包含免疫球蛋白衍生片段的工程構建體。"嵌合體"或"嵌合蛋白"指含有一種或多種同源蛋白的殘基或結構域的蛋白。例如嵌合抗體，它包含的可變區典型來源於鼠科mAb,並與人免疫球蛋白的恆定區融合。"誘殺物"或"誘殺蛋白"是一種設計的多肽，參入有預定或工程結構域，用以從潛在耙結合體文庫中負選擇或正選擇耙配體結9合配偶體。"表位"定義為靶配體的三維區域，代表與單鏈抗體結合的結構單位。表位通常由胺基酸或糖側鏈等分子的化學活性表面基團組成，並且通常具有特異的三維結構性質和特異的電荷性質。構象和非構象表位的區別在於，與前者的結合在失活溶劑中會解離，而後者不會。表位可包含上述功能單位或結構特徵性蛋白結構域(例如受體結合域或纖連蛋白樣結構域)，或者存在於其中。因此當一種表位是蛋白的功能域並與選定的結合配偶體結合時，會引起該靶配體的功能發生目的性修飾，這種修飾是對靶配體的功能起拮抗或激動作用。"替代"指具有類似的生物學功能。替代抗體發揮類似功能，它在與原抗體異種的環境或動物中激動或拮抗耙配體的活性。"人類"或其它任何種類的抗體(如人抗體)，包括那些含有從人類或其它種系免疫球蛋白序列衍生的(或極為相似的)可變區、或可變區和恆定區的抗體。本發明的抗體可包含不被免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如但不限於由體外隨機突變或定點誘變引入的突變，或在體內進行的體細胞突變)。因此這裡所用的"人抗體"所指抗體蛋白的每個部分(如CDR、構架、Q、Ch區(如Ch1、Ch2、CH3、C4)、鉸鏈區(VL、VH))都與人種系抗體基本相似。根據其胺基酸序列相似性，已將人抗體分類，見如http:〃people.cryst.bbk.ac.uk/-ubcg07s/。因此使用序列相似性搜索工具，可以選擇具有相似線性序列的抗體作為模板製作"人抗體"。已知鼠種系序列，也可以類似方式對其進行應用。當收集並索引其它物種的種系免疫球蛋白相關數據後，也可以類似方式應用這種序列通過本領域已知方法從噬菌體展示文庫或抗原結合片段的其它集合體製備本發明的非人類抗體。一方面，本發明涉及到噬菌體展示和組合肽文庫的使用。噬菌體展示和組合肽文庫已發展成為探索肽和蛋白間相互作用的有力且適宜的工具。可通過插入隨機寡核苷酸文庫或插入包含目的序列(如來自免疫化動物或人體的B細胞)的多核苷酸文庫來製備噬菌體文庫(Smith,G.P.1985.Science228:1315-1317)。抗體喧菌體文庫在一個噬菌體中包含重鏈(H)和輕鏈(L)的可變區對，使得可表達單鏈Fv或Fab片段(Hoogenboom,etal.2000.Immunol.Today21(8)371-8)。可對噬菌粒文庫的多樣性進行操縱以提高和/或改變文庫中單抗的免疫特異性，以產生並隨後鑑別額外和所需的人單抗。例如可將重鏈(H)和輕鏈(L)免疫球蛋白分子的編碼基因隨機混合(改組)，以在裝配免疫球蛋白分子的過程中製得新的HL對。另外，可對重鏈(H)和/或輕鏈(L)編碼基因的免疫球蛋白可變區的互補決定區(CDR)進行誘變，並隨後篩選所需親合力和中和(neutralization)能力。也可通過選擇一個或多個人類架構序列並引進衍生自人類抗體所有組分的CDR盒集合或者通過設計的可變區來合成4元體文庫(KretzschmarandvonRuden2000,CurrentOpinioninBiotechnology,13:598-602)。引起多樣性的位置不限於CDR區，也可包括可變區的架構段。其它用於本發明的文庫包括來自非人類動物抗體或工程抗體文庫的噬菌體展示文庫。前者的例子包括使用來自駱駝科(camelid)物種的免疫球蛋白，它天然缺乏輕鏈(Hamers-Castermanetal.,1993,Nature363:446-448;Gahroudietal.,1997，FEBSLett)，後者的例子如使用來自重鏈或輕鏈的具有結合能力的單結構域抗體(見如美國專利No.6248516)。此外多種噬菌體或其它展示系統，如核糖體、酵母、細菌或動物細胞均可與肽(或抗體)噬菌體文庫以多種方式組合使用，以進行生物學探索或尋找新型藥物或藥物靶點。例如可使用肽噬菌體展示文庫來搜索抗體噬菌體展示文庫。可聯合使用底物噬菌體展示和底物消減方法，通過排除法來尋找密切相關的酶之間的特異性差異，這種信息可被用於製備高選擇性抑制劑(Ke，S-H,etal.1997.J.Biol.Chem.272(26):16603-16609)。配體和受體(如抗體和抗原)間的結合依賴於氬鍵、疏水性作用、靜電力和範德華力。這些結合作用都是非共價性的弱鍵，但是已知抗原和抗體間的結合是最強的天然結合作用之一。通過相同表位的多拷貝或通過被多種抗體識別的多種表位的存在，如同抗體一樣抗原也可能是多價體。涉及到多價性的相互作用可以產生更牢固的複合體，但多價性也會引起空間位阻從而降低結合的可能性。所有的抗原-抗體結合作用都是可逆的，但都遵循任何可逆生物分子相互作用的基本熱力學定律^^M"々]其中KA是親合常數，Ab和Ag分別是抗體或抗原上未被佔用的結合位點的摩爾濃度，Ab-Ag是抗體-抗原複合體的摩爾濃度。已知正向反應為"結合速率"(onmte)，解離或逆反應為"解離速率"(offrate)。為了使抗原和抗體間相互作用有效進行，表位必須易於結合。因為抗原分子存在於空間中，被抗體識別的表位可依賴於抗原的特異性三維構象(如由兩個天然蛋白亞基相互作用形成的特殊位點)，或者表位可相當於簡單的初級(primary)序列區域。這種表位分別被稱為"構象型"(conformational)和"線性型，，(linear)。發明方法我們設計了通過使用工程竟爭性蛋白來定向選擇展示在噬菌體上的抗體，以此來分離結合於預定表位上的抗體或其它結合配體的方法(圖1)。該方法依賴於靶蛋白的結構信息，此信息被用於設計合適的誘殺蛋白。這種誘殺蛋白在抗體噬菌體展示中被用作竟爭劑，以分離具有所需表位-特異性的抗體(圖1)。通過傳統免疫動物方法所得抗體的結合特異性由動物的免疫系統和抗原蛋白來聯合決定。因此來自免疫作用的抗體經常與"優勢免疫，，表位相互作用，而這種表位與所需靶表位間存在差異。現有的使用抗體噬菌體展示文庫的選擇方法不能準確的定向選擇目的表位。這裡公開的方法其優勢在於，能夠非常精確並高效的定向選擇特異於靶表位的抗體。選擇結合預定表位的抗體的方法可被用於將在一種物種(例如動物模型)中證明有效的一種治療性耙抗體或配體結合體(生物治療藥)的所需性質，直接轉化至類似生物治療藥以有效治療其它物種。可將人類生物藥物方便的轉化為類似藥物，從而可有效治療其它哺乳動物，如牛、豬、家禽、狗、貓或其它農業重要的家養動物，或者稀有動物或瀕臨滅絕的物種。在最常見的影響伴估(companion)動物(狗、貓和馬)的15種疾病中，許多與激素分泌相關，包括犬科和貓科動物的糖尿病，甲狀腺失調，犬科動物的甲狀腺機能減退，貓科動物的曱狀腺機能亢進，犬科動物的阿狄森氏病和庫欣氏病。伴侶動物和其它動物的其它常見病包括骨關節炎和多種癌症。因此有可能將有效的人類生物治療藥(如抗癌和抗炎抗體治療藥)轉化為其它物種特異性類似藥物。例如，可與人a-TNF上的特殊表位結合的英夫利西單抗藥物(REMICADE),可使用本發明的方法將起轉化為治療有效藥物，以有效應用於治療伴侶動物中常見的由a-TNF失調介導的疾病。耙位點結合的選擇每個淋巴細胞產生的抗體都不是特異於某種抗原，而是特異於某種表位。抗原是外源細胞、顆粒、蛋白或分子的一部分，被免疫系統所識別並作為抗體和/或細胞毒素T細胞的耙子，表位也是相應於蛋白上抗原決定簇的結合位點。多肽、脂質、核酸和許多其它物質也可用作抗原。一些小分子物質如果與大"載體蛋白，，(如牛血清白蛋白或藍蛋白，或其它人工基質)化學偶連，則也可能會發生針對它們的免疫反應，這類物質稱作"半抗原"。半抗原可以是多種分13子，例如藥物、簡單糖類、胺基酸、小肽、磷脂或甘油三酸酯。負fe引起強烈免疫反應的抗原被稱作"強免疫原"。經驗證明引起克隆性免疫反應的抗原決定簇可以小至1-8個胺基酸或者1-6個單糖。實際工作中被來自克隆的免疫球蛋白(單克隆抗體)所識別的表位，可以在蛋白表面包含更大的非鄰接(non-contiguous)序列。當表位存在於蛋白的功能性區域內時，抗體的結合對該蛋白的作用將會中和由該區域結構特徵所賦予該蛋白的功能。整個觀點已被證實是單抗發揮治療作用的基礎。因此可再現性選擇特異結合抗原或蛋白結構域的抗體或其它結合體的能力可以代表蛋白治療領域的進展。抗體-表位作圖(Antibodyepitopemapping)是一種鑑別功能i或的方法。根據對象不同可以用高或低表位作圖的解析度。低解析度作圖包括使一套單抗與天然蛋白的表面序列作用。重點在於覆蓋整個靶表面並鑑別哪個序列是重要的功能序列。與主導候選mAb不同，在表位作圖中所用的抗體可以是低親合力的，並應包括中和和非中和mAb,同時這種方法中並不總是需要精確確定表位。一旦在特定所需解析度下鑑別出表位，則可使用與抗體(它發揮所需作用，通常是中和靶蛋白的功能)的竟爭性試驗來鑑別其它結合於此區域結合體，例如人抗體能夠與鼠抗體竟爭結合人類靶蛋白。可通過其它方法使用結合靶蛋白的多套抗體來鑑別表位。例如，可使用蛋白酶消化抗原並使用ELISA或質語分析來確定消化所得片段與抗體的結合。可用蛋白酶消化抗原-抗體複合物並用質語分析蛋白消化片段。在這種情況下，抗體對蛋白水解位點的覆蓋鑑別出表位。也有其它鑑別抗體的表位的方法。可合成相應於整個抗原序列重疊片段的肽，並用ELISA或表面等離子共振譜(SurfacePlasmonResonancespectroscopy)確定抗體與這些肽的結合。4吏用同位素標記抗原的NMR研究也可鑑別在抗體結合時哪些胺基酸的磁環境發生了變化。另一方法是測量熱熔解轉移溫度(thermalmeltingtransitiontemperature)。也可確定抗原-抗體複合物的晶體結構並用以鑑別表位。在這些方法中晶體法是最具權威性的，其次是NMR法。在ELISA法中，檢測之前先用洗滌步驟除去未結合物質。在表位是線性(抗體僅識別一個單鏈線性胺基酸序列)的情況下，抗體對包含表位的抗原的親合力可高至足以對結合作用進行檢測。當表位是構象型，由蛋白內的兩個或更多的非鄰接胺基酸序列組成時，每個單獨序列對抗體的親合力可能就很低並且不足以被檢測到。使用表面等離子共振語也可能檢測不到與構成構象型表位的肽的結合作用，因為對表位中的每個肽的親合力可能太低。如果肽的解離速率高，結合作用也可能檢測不到。也可使用核磁共振(NMR)來鑑別蛋白上的表位。申請人的待審申請(美國專利申請Ser.No.10/393926)中提出了根據局部環境，通過鑑別特異原子(通常是H1、C13和N15)並由此鑑別胺基酸殘基的方法。如果有足夠的時間並且足夠高的設備解析度，則可為大分子蛋白進行大多數或所有共振的完整排布。這種方法的基礎在於，人們發現當抗體結合於抗原上時，一些胺基酸的局部環境發生了變化。那些變化最劇烈的胺基酸就是那些與抗體作用最相關的胺基酸。理論上可以通過對結合與未結合狀態下的抗體和抗原進行所有NMR排布分析，並確定哪個胺基酸發生了原子移動，來鑑別表位。抗原-抗體複合物NMR譜的複雜性使得這種分析極為困難，因而不能成為常規的表位鑑別方法。但是上文專利的申請者們使用富含C13和N15原子的胺基酸的蛋白質(其中不是總需要精確的NMR信號鑑別)通過此法鑑別出蛋白表位。當不同胺基酸的共振差異度足夠大時，可以對相同蛋白的兩個或多個不同胺基酸進行多重標記。例如可以將a-N15丙氨酸和s-N15賴氨酸包含進同一蛋白，也可將s-N15組氨酸和a-N15亮氨酸包含進同一蛋白。表位可以是抗體或者配體的結合區域。另外，預測蛋白表面暴露序列的分子模型或計算15可有助於表位鑑別。在未進行靶分子結構物理測量的情況下，表位可以根據把分子一級氨基^列進行設計。例如約5-15個M酸殘基線性片段內部的約5-10個殘基可加以改變，以製得變異誘殺物或嵌合耙蛋白，並測量結合作用以確定表位。蛋白同源性的基礎是基因的鹼基序列的相似性或蛋白質的胺基酸序列的相似性，它表示共同的進化起源。通常共同進化起源會導致蛋白具有相似的結構和功能。但並不總是如此，趨異進化和突變可能會引起具有相似結構的蛋白卻具有不同的功能，或者結構不同的蛋白具有相似的功能，這分別稱為直系同源和旁系同源。同源性掃描誘變是一種廣為人知的蛋白受體結合作用的鑑別方法，它將同源蛋白的相似區域進行替換以維持原蛋白的三維結構(例如用豬生長素、人泌乳刺激素或人胎盤催乳激素中的區域替換人生長素的相應區域)，然後確定構建體的結合常數。這些天然結構變異體可^皮用來確定可用於構建本發明中合適的誘殺蛋白的結構域或結構域中的表位。誘殺物的構建這裡所用的"誘殺蛋白"所指的蛋白，與靶蛋白相比在特異結構域上有一處或多處結構特徵差異，該特異結構域包含著待結合的位點或區域。因此，誘殺蛋白可以是嵌合靶蛋白或者是天然蛋白，例如種同源物。而靶配體可以是工程序列，包含預定的結合結構域。在本發明的方法中，誘殺物結合低親合力和非特異性的結合體，則那些與保留著的靶分子複合結合體就被選出。一方面，具有合適結構並可以作為接受靶表位的骨架結構的相似物可以是靶蛋白的直系同源物。結構同源物也可以是多基因家族的其它成員。伴隨著X射線晶體衍射、NMR和其它l支術的進步，以及這些技術帶來的關於三維結構信息的大量積累，可以方便的獲取蛋白結構信息，也可以從多種途徑得到真實結構信息。格拉斯哥大學(UniversityofGlasgow)的生物信息學研究中心(BioinformaticsResearchCenter)使用蛋白結構拓樸學(TopologyofProteinStructure(TOPS))軟體建立了描述和比較蛋白結構的網絡站點(TPFlores，DSossandJMThornton.1994.ProteinEngineering,7:31-37)。可以以PDB類似文檔的格式向該伺服器提交蛋白坐標(coordinates)。蛋白結構被轉化以簡單的卡通表示，稱作拓樸表示。然後與所有已知結構的非冗餘(redundant)亞組進行比較。所得結果以分類列表形式表示，顯示comperssion值、結構鑑別紀錄，以及為一對相同結構賦值1,為無相同特徵賦值0所得的結構相似性結果。MASS(多重二級結構比較，MultipleAlignmentbySecondaryStructures)技術的基礎是使用二級結構和原子表示法的兩個水平的比較。該技術的基本原理是蛋白固有的由二級結構元件(SSEs)組成。這些元件是蛋白內部的區域，為蛋白提供了穩定的骨架，而功能位點即附著在該骨架上。因此SSE是高度進化保守的，而突變經常發生在柔性環上，這種柔性環更加難以進行比較。MASS是進行多個蛋白分子結構比較和檢測共同結構基元的高效工具。使用二級結構信息有助於過濾掉幹擾信息，並有助於提高效率節省精力。MASS的優點是不依賴於序列順序，因此能夠在多重比較或多亞組中檢測到非拓樸結構基元。使用MASS可以操縱蛋白-蛋白停靠(docking),而操縱蛋白停靠是一個相當困難的問題。MASS可以從以下站點免費獲得。(http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/MASS/(Dror，O.etal.ProteinScience(2003),12:2492-250))本發明的方法聯合使用結構信息和大容量的蛋白-編碼核酸表達系統文庫，來選擇結合特殊表位的抗體。例如可以將鼠源人組織因子(TF)同源物上的複雜特異表位作為靶子。本領域現有的抗體不能抑制mTF功能，也不是結合於TF的X因子的特異性竟爭抑制劑。而本文公開的抗體具有這些功能，因此可代表以前沒有的可評^介抗TF抗體(通過抑制FX的活化來抑制TF活力)的治療潛力的工具。另外，這些抗體也是研究TF在正常狀態下及在致病性血栓炎症、血管形成、腫瘤轉化發展過程中的作用的有利試劑。表位-定向的抗體或其它結合配體的純化本發明提供了三種通用的表位-定向的抗體或其它結合配體的分離方法(1)使用抗體或其它可能的結合配體的展示文庫進行竟爭性選擇；(2)使用展示文庫，再對差別結合活性進行篩選，從而進行非竟爭性選擇；(3)免疫動物，再篩選差別結合活性。使用誘殺蛋白進行的竟爭性選擇時，在誘殺蛋白的存在下(其摩爾濃度超過靶蛋白)i^^^示文庫中與靶蛋白的結合作用。回收的抗體或結合配體的選擇性通過ilii分離的與乾蛋白結合而不與誘殺物結合的抗體或結合配體來確認。因此在本發明的一個實施例中，提供了鑑別可結合於把蛋白上預定表位的多肽的方法，其步驟包括(a)提供一個在表面表達多肽噬菌體顆粒文庫，(b)製備誘殺蛋白，其相應於靶蛋白的預定表位的胺基酸序列發生了變化，(c)將噬菌體顆粒文庫與靶蛋白一起溫育，以選出具有能夠結合於靶蛋白的多肽的噬菌體顆粒，(d)加入誘殺蛋白(其摩爾濃度超過靶蛋白)作為竟爭劑，以負選擇出特異於預選定表位的噬菌體顆粒，(e)將結合於靶蛋白的噬菌體顆粒與結合於誘殺蛋白的噬菌體顆粒分開，(0回收結合於靶蛋白的噬菌體顆粒(而不是結合於誘殺蛋白的噬菌體顆粒)。次優選的方法是使用天然蛋白作為"誘殺物"，以選擇與嵌合或突變蛋白的結合。在這種方法中，使用包含原始骨架蛋白的蛋白的摩爾濃度大於嵌合或突變蛋白。回收抗體或結合配體的選擇性通過篩選與誘殺蛋白和靶蛋白結合而不與骨架蛋白結合的分離的抗體或結合配體來確認。在使用誘殺蛋白進行兩步選擇的過程中，根據靶蛋白對展示文庫進行選擇。再篩選(通常單獨進行)回收的選擇性結合靶蛋白而不與誘殺蛋白結合的抗體或其它結合配體。為了使用誘殺蛋白的免疫化作用，使用靶蛋白對適合進行穩定雜交瘤單抗純化的動物進行免疫。製備雜交瘤並進行篩選，尋找表達有能結合於靶蛋白而不結合於誘殺蛋白的抗體的雜交瘤。免疫方法可與上述任意展示方法聯合使用。因此來自免疫細胞(如脾或外周血淋巴細胞)的mRNA可被用來產生抗體文庫，此文庫然後可按照上文任何展示方法使用。這種方法並不僅限於只在那些適合純化穩定雜交瘤的動物上應用。可以才艮據本文詳述的方法來設計肽文庫，也可以4艮據本領i或的一般方法進4亍(見如RAPIDLIB1orGRABLIB',DGIBioTechnologies,Inc.,Edison,NJ;Ph.D.C7CDisulfideConstrainedPeptideLibrary,NewEnglandBiolabs)。可以從如CambridgeAntibodyTechnology、Morphosys、AffymaxResearchInstitute,PaloAlto,CA等來源獲得抗體文庫。已有許多方法來選擇可用的為進一步分析和親合力成熟(maturation)結合體亞組。這些方法包括通過竟爭性淘汰(deselection)封閉優勢免疫表^f立，使用表位-掩蔽技術來獲得更寬範圍的抗體特異性，捕獲轉移(capturelift)篩選，4吏用三明治-捕獲(capture-sandwich)ELISA的抗體引導選擇，接近嚮導(proximity-guides)(ProxiMol)的抗體選擇，4吏用小鼠單抗引導的選擇進行人單抗純化，使用磁分類技術選擇結合於細胞表面抗原的抗體，純化人腫瘤相關細胞的表面抗原-結合單鏈抗體，使用組織片段消減純化單鏈抗體，根據抗體結合動力學特性選擇抗體，根據化合價選擇功能性抗體(抗體噬菌體展示方法和步驟，AntibodyPhageDisplay.MethodsandProtocols,IN:DavidW.J.Coomber,Ed.MethodsinMolecularBiology.HumanaPress.Vol.178,December2001pps.133-145)。提高親合力是根據靶結合體的低解離速度進行的。低解離速度通常預示著高親合力。在這些提高親合力的例子中，靶噬菌體和靶-結合體噬菌體的繼續溫育在飽和量的已知耙結合配偶體的存在下進行，或者通過提高溫育溶液的體積來實現。在每種情況下，裂解的靶-結合體噬菌體的再結合都被阻止，在更長的時間內，高親合力的靶-結合體噬菌體^c回收。對每種目的靶-結合體均優化預溫育時間和預溫育條件。為了監測條件變化對親合力提高的影響，進行預實驗(pilotexperiment)淘選。靶和靶-結合體噬菌體一起溫育並轉化宿主細胞後，將宿主細胞鋪在選擇性平板培養基上並計數。確定存活克隆數目的變化為確定親合力提高水平提供了有力的評價工具。存活克隆數目減少時，保留下的弱結合體數目顯著減少，留下更少的高親合力靶結合體。例如，存活克隆數目的減少至僅1%、0.1%、0.001%，表明提高結合高親合力靶的靶結合體數量的最優條件。在一些條件下，存活克隆的數目可被限制在約100個，用於測序分析。依賴所用靶結合體文庫類型的多樣性，具有高親合力的輩巴結合體的數目可低到小於10。上述親合力提高技術可在進行提高的同時不需要進行額外的淘選。當然如果必要本發明也可使用多輪淘選以提高親合力。引用本文引用的所用公開文獻和專利均通過引用完全結合於且/或者提供了關於本發明的說明和授權。^^開文獻指任何科學或專利公開說明，或者任何其它媒體形式的任何可用信息，包括所有錄音、電子文檔或印刷品。以下參考文獻通過引用結合於本文Ausubel,etal,，ed.,分子生物學通用方法，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons，Inc.,NY,NY(1987-2004);Sambrook,etal.，分子克隆實馬全室指南，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition,ColdSpringHarbor,NY(1989);HarlowandLane,抗體實馬全室指南，antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NY(1989);Colligan,etal,,eds.，免疫學通用方法,CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY(1994-2004);Colliganetal.，蛋白研究通20用方法CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY，NY'(1997-2004)。上文已從整體上描述了本發明，下面通過實例來進一步公開本發明的實施方案。實施例l:A/鼠嵌合組織因子蛋白的設計和製備名為TF8-5G9的Mab識別並結合於人組織因子，並阻止X因子與TF或與TF/VIIa因子複合物的結合(Ruf，W.andEdgington,T.S.1991.Thromb.Haemost.66:529-539)。根據對複合了人TF的TF8-5G9Fab的晶體結構的分析，所有形成被Fab識別的表位的殘基均在人TF的149-204號殘基之間。這個蛋白區域在TF與Gla-結構域FX間的相互作用中也發揮了重要作用(Rufetal1992)。huTF的149-204號殘基間的15個特異殘基的合適定位，對結合有重要的能量貢獻(Huang，etal./M/.腺275,873-894)。如同下文的序列比對所揭示的，當人(GenPeptAccessionNo.NP_001984)和鼠TF(GenPeptAccessionNo.NP—034301)的胞外結構域序列，進行人EC結構域的149-204號殘基和鼠EC結構域的152-207號殘基比較時，15個重要殘基中有7個相同(人類殘基K149、K165、K166、T167、T170、171、Q190),另有8個不同(人類殘基被如下替換Y156T、K169I、V192M、P194F、V198T、R200Q、K201N、D204G)。用粗體表示的殘基對TF8-5G9:huTF複合物的穩定性有重要作用，這些殘基有5結合自由能，為l-4kcal/mol或更高。人"sKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKPNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIJPSRTVNRKSTIhM鼠根據這個分析，按照序列比對將鼠TF序列中單一TF8-5G9接觸殘基突變為huTF中的相應殘基，可從鼠TF編碼序列構建嵌合誘殺蛋白。雖然在人、鼠TF間還有其它位點存在胺基酸殘基差異，但在考慮粑表位時，這些殘基可認為對蛋白總體功能或結構沒有作用。使用mTF基因作為模板構建一個含有突變的嵌合蛋白,將mTF的8個單一TF8-5G9接觸殘基突變為huTF中的相應殘基(SEQIDNO.l)。刪除跨膜區域使得僅有TF的可溶性胞外結構域被表達，並在羧基末端加上His標籤以方便純化。可溶性鼠TF和嵌合蛋白在HEK293E細胞中表達並純化。用SDS-PAGE分析純化的蛋白，結果得到預期大小的條帶(Hu/mTF(40kDa),mTF(35Kda))。使用生物素醯化的mTF蛋白對HuCAL噬菌體展示文庫(Morphosys,Martinsreid,Germany)進行液相淘選。添力口嵌合hu/mTF蛋白作為誘殺物，其摩爾添加量過量10倍以淘汰所有特異於mTF靶表位之外的表位的噬菌體。用包被在磁性珠子上的鏈黴抗生物素來捕獲回收結合於生物素醯化mTF上的噬菌體。測序從這輪淘選中得到的所有結合體，得到23個單一Fab:在試驗濃度下，9個只識別mTF，3個相對hu/mTF優先識別mTF,11個對兩種蛋白的識別度相似(表1)。進行沒有嵌合蛋白竟爭劑的mTF淘選，以確認所選的Fab是表位定向選擇的結果，而不是mTF上熱點定向選擇的結果。除了竟爭抗原不同，兩次淘選條件完全相同。測序所得結合體，得到7個單一Fab。只有1個分離的Fab在沒有竟爭劑的淘選中特異性結合mTF，這說明添加竟爭抗原使得Fab選擇特異性識別mTF，而不特異識別在TF8-5G9表位有變化的hu/mTF(表1)。表ltableseeoriginaldocumentpage22通過親合色譜純化人抗鼠TF特異Fab，並用ELISA評估其結合mTF或hu/mTF的能力。圖2中列出類這些Fab的CDR序列；對比形態變化HuCAL手冊制定構架排布。構架區序列在圖2下方列出。所有9個mTF特異Fab與mTF的結合都表現出劑量依賴性，對hu/mTF有最小交叉反應活性(圖3)。在Fab形式中，PHD127有最高的mTF結合親合力，PHD127則最低。根據其對mTF的親合力選出5個Fab(PHD103、104、126、127、130)製備全長免疫球蛋白。這5個Fab的可變區(PHD103、104、126、127、130)列於圖2,SEQIDNOS:2-11的序列被克隆到載體中，以在HEK293細胞中表達mlgG2a分子。抗凝血使用鼠腦提取物作為mTF來源，評估所選抗mTF的替代Fab抑制人血漿凝固的能力。根據以上試驗，預測結合於mTF上TF8-5G9表位的Fab可幹擾凝血途徑並延遲血塊的形成。在這個實驗中，測量人血漿血纖蛋白凝塊形成的抑制作用。進行測試的8個Fab中有4個在體外延遲或抑制了人血漿的凝固PHD103、PHD104、PHD126、PHD127。PHD126和127具有更強的抗人血凝固的能力。才艮據血塊形成時間-Fab濃度曲線，可測的E50值在0.2叫/ml-63嗎/ml之間。表2FabEC50濃度，(Mg/ml)PHD102>200PHD10363.3PHD10423.8PHD109>200PHD1260.23PHD1270.82PHD128>200PHD129>200X因子抑制在鼠腦提取物作為mTF來源的情況下，測量上文抗凝血的抗mTFFab的X因子抑制作用。提取物與FVIIa—起溫育，在FX存在下加入抗mTF替代Mab，測量抑制FX轉化為FXa的能力。PHD103、1M和127Fab抑制X因子活化(裂解)為Xa因子。然後使用全長抗mTFIgG再次測量抑制X因子活化的能力。發現PHD103、126和127有良好的抑制作用，而PHD104則沒有抑制作用。FACS分析作為最有吸引力的候選抗體PHD126和127，評估其結合於B6F10黑素瘤細胞(高水平表達mTF)的能力。PHD126和127以劑量依賴性方式結合連有mTF的細胞，其EC50值分別為37.8nM和4.35nM(圖4)。PHD126和127重鏈和輕鏈的完整可變區序列分別在圖2相應區域中列出(SEQIDNOS:6-9)。概要上述實驗闡明使用工程竟爭蛋白對噬菌體展示的抗體進行表位定向選擇的方法是可行的。該方法根據靶蛋白的結構信息來設計合適的竟爭劑。另外，這個方法可以選擇對目的蛋白上表位有反應活性的抗體。現有的使用噬菌體展示的抗體文庫進行抗體選擇的方法，不能準確定向目的表位。這裡公開的方法具有可高效精確的選擇特異於靶表位的抗體這一優勢。我們已經使用該法選擇到了抗mTF上單一表位的抗體。TF是一個複雜的分子，其既可作為受體也可作為配體，能夠與FVIIa和FX形成特殊的複合物。因此，阻止這種相互作用的Mab必須作用於TF分子上的單一區域。本領域現有的抗體不能抑制mTF功能，或者不是結合於TF的X因子的特異性竟爭抑制劑。這裡公開的抗體則具有這些功能，並因此可代表以前沒有的可評價抗TF抗體(通過抑制FX的活化來抑制TF活性)的治療潛力的工具。另夕卜，這些抗體也是研究TF在正常狀態下及在致病性血栓炎症、血管形成、腫瘤轉化發展過程中的作用的有價值的試劑。實施例2:構建嵌合誘殺蛋白用以選擇結合於能夠活化不同受體亞24單位的共同結構域的結合體白介素-13(IL-13)是一種細胞因子，在哮喘病人呼吸道中發現其含量水平提高。IL-13由活化的CD4+T細胞產生，並在哮喘病人的B細胞增殖和IgE產生，以及杯狀細胞增生和黏液高分泌，嗜酸粒細胞性支氣管炎，氣道高反應性中都發揮重要作用。已發現IL-13在轉基因小鼠中的過表達會引起哮喘樣表型，而使用拮抗劑抑制IL-13則會減輕哮喘反應。IL-13至少與兩種受體結合，其中之一可以在除T細胞外的大多數細胞上發現，而另一種受體可發揮誘殺蛋白的作用。牽連到促炎症反應的受體與IL-4受體相同，它由兩個亞單位組成，IL4Ral和IL13R(31。IL-13是短鏈細胞因子家族的成員，該家族還包括IL-4、IL-2、IL-3和GM-CSF。這些蛋白具有一個4-螺旋束結構並包含兩個或三個二硫鍵。IL-13的溶液結構已被確定，證明它與家族其它成員間具有相似性(Eise露sser,E.Z.,etal.J.Mol,Biol.(2001)310:231-241;Moy,F丄,etal"J.Mol.Biol.(2001)310:219-230)。儘管IL-13與IL-4隻有25%的序列相同，但兩者的整體結構相似，因而預測IL-13與其受體間的相互作用應該和IL-4與其受體間的作用(最近確定)相似。事實上，考慮到兩個細胞因子的受體有一個共同亞單位，那麼IL-13和IL-4與IL4Rcc1相互作用的結構可能是相似的。通過對IL-13的三維結構和突變研究表明，該細胞因子有兩個表面在它和受體的相互作用中發揮了重要作用。該模型提出，由螺旋A和螺旋C組成的蛋白表面與受體的IL4Ral亞單位發生相互作用，而螺旋A和螺旋D的界面與受體的IL13Ral亞單位發生相互作用。根據IL-13結構和受體相互作用模型預測，封閉A、D螺旋與IL13Ral間作用的抗體，或者封閉A-C表面與IL4Rocl間作用的抗體可能是具有抗IL-13治療作用的優秀候選抗體。在選擇結合於IL-13的受體相互作用部位上的抗體時，我們計劃製備嵌合細胞因子分子。在這種嵌合蛋白中，連接C、D螺旋的環將被待免疫動物的相應序列取代。在受體作用模型中，C-D間的環構成分子暴露部分的大部分表面，並且不與IL-13受體發生相互作用。另外，此環在溶液結構中表現出良好的柔韌性，因此可能可以忍受不破壞蛋白整體結構的突變。在所得嵌合蛋白中，分子的一部分與宿主本身非常相似，從而不大可能誘導顯著的免疫反應。但是，分子中保留全長人序列的部分對宿主會表現外源性，可能會引起免疫反應。預測從嵌合免疫原所選擇的抗體會在實驗中表現出中和人受體活性的功能。需要有強效IL-13拮抗劑來評價IL-13抑制在人類疾病(尤其是哞喘)中的作用，並由此將此拮抗劑作為治療劑。這裡描述的新型IL-13變異體可用作免疫原以提高拮抗抗體的產生，也可用作篩選或選擇劑以筌別中和抗體，或者直接用作天然IL-13的拮抗劑。另外，研發新型強效IL-13激動劑也可有助於靶定位某些在其細胞表面過表達IL-13受體的癌細胞(Hussain,S.R，andPuri，R.K.，Blood(2000)95:3506-351)。構建新型IL-13類似物。這些化合物可被視為人IL-13和其它物種IL-13的嵌合體，因為它們使用多個物種IL-13的部分序列。可通過將其它物種的序列上不同的區域參入到人IL-13序列中，而合理設計這些突變體。根據兩個細胞因子的結構同源性，提出一個IL-13:IL-13R1複合體模型。使用IL-13(坐標文件(coordinatefile):1GA3)的NMR模型和IL-13序列構建IL-13類似物，它應具有人IL-13激動劑、人IL-13拮抗劑的功能，或可用作產生抗人IL-13抗體的免疫原，或者作為產生抗人IL-13抗體的淘選元件。坐才示文〗牛1GA3可/人http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov"尋到，它含有IL-13的20個NMR結構的覆蓋圖。對結構的觀察表明，儘管4個螺旋是高度保守的，但N-末端和C-末端及C、D間的環具有高度柔韌性，許多構象都證明這一點。該文件的第一個結構被用來分析設計的IL-13突變體，該突變體應保持結構和活性。在C、D螺旋間有一個大環，它靠近幾乎埋在分子內部的B螺旋。這個環可以容忍突變，因為它與A、C、D螺旋的距離都遠。B環由Met"到Asn53的絲酸限定，CD環由Cys71到Thr88的胺基酸限定。環的末端難以定位，但D螺旋開始處的環末端明確是Glu91。在大多數結構中參與B螺旋和CD環間相互作用的胺基酸是B螺旋Cys45、Leu48、GIu49、Leu51,(可能)Asn"和Val54C/D環、Cys71、Vd75、(可能)Lys74、Val85、(可能)Arg86、lie90另外，這區域中沒有氫鍵。Pro"沒有參與但對轉角來說必須，Trp35和Arg86與Lys89間的環殘基有重要的相互作用。B螺旋上與C/D環相互作用的殘基是Leu48、Leu51、Vai54。Ala"位於一個口袋中，可能可以被替換。C/D環和B螺旋間沒有氫鍵。B螺旋上與A/B環相互作用的殘基是Met43、Ala47、Ser50。在NCBI中進行Blast搜索以鑑別其它種類IL-13,結果如下(http:〃www.ncbi.nlm.nih,gov/entrez/query.fcgidb=Protein):人1L-13GPVPPSTALREL工EE畫ITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSA豬GPVPPHSTALKEL工EEIi麗TQNQKTP固GSMVWSVN:LTTSMQYCAA:LESLIN工SDCSAIQKTQRMLSALCSHKPPSEQVPGKHIRDTK工EVAQFVKDLLKHLRM工FRHG牛PVPS感LKEL工EE頭ITQNQKV:PLCNGSMVWStiNLTSSMyCAALDS;LIS工SNCSVIQRTKKMLNALC2HKPSAKQVSSEYVRDTK:CEVAQPLKDLLRHSRIVF鵬RFN犬PVTPSPTLKEIi工弧VN工TQNQASIjCNGSMVWSVNLTAG跳AAIjESL工NVSDCSA工QRTQRMLKALCSQKPAAGQ工SSERSRDTK工EV工QLVKNIXTYVRGVYRHGNF大鼠GPVRRSTSPPVALRELIEELSM工TQDQKTSLCNSSMVWSVDLTA(3GFCAALESIiTliriSSCNAIHRTQR工LNGIiCNQKASDVASSPPDTK工EVAQFISKLLNYSKQKFRYG小鼠GPVPRSVSLPLTIjKELIEELSNITQDQTPLCNGS畫SVDLAAGGFCVALDSLTN工SNCNAIYRTQRILHGLCNRKAPTTVSSLPDTKIEVAHFITKLIjSyTKQLFRHGPF使用ClustalW算法和VectorNTiSuite(InforMax,Inc.,Bethesda，MD)比對了人、牛、豬、狗、大鼠和小鼠IL-13的序列(圖5)。下面給出B螺41序列，其中與人不同的胺基酸用下劃線標出。預測參與B螺旋和C/D環相互作用的殘基用星號標出。(表3)表3tableseeoriginaldocumentpage28這些比對提示人IL-13B螺旋和C/D環上的一些胺基酸殘基可用其它物種的IL-13相應殘基替換，並保持結構完整和受體結合活性。使用B螺旋和C/D環上預測發生相互作用的殘基，設計一個嵌合蛋白，其中人蛋白C/D環殘基被來自其它物種的相似殘基所替換。為保持蛋白穩定性，需要替換同一來源的B螺旋上相應的相互作用的殘基。如果用牛、豬或小鼠IL-13，則優選的實施方案僅必須替換一個胺基酸，即Val54替換為Ile54，因為這些IL-13上其它的相互作用殘基都與人蛋白相同。另外的實施方案是對來自小鼠蛋白的B螺旋進行兩處替換，Glu49~>Asp49、Ala46—Val46。Tyr41也可替換為Phe,Leu51也可替換為Val。但是上文最後的替換靠近C螺旋，並且幹擾其結構。表4列出了6種蛋白的C/D環序列，其中預測與B環相互作用的殘基在最後一行用星號標出。(表4)表4人CPHKVSAGGFSSIiHVRDTKI牛CPHKPSAKQVSSEYVRDTKI豬CSHKPPSEQVPGKHIRDTKI狗CSQKPAAGQISSERSRDTia大鼠CNQKASDVASSPPDTK工小鼠CNRKAPTTVSSliPDTK工相互作用殘基根據同源性可在C/D環上進行許多優選變化。這些替換中許多不大可能影響環的整體構象，但是大鼠和小鼠11-13蛋白中Arg"替換為Pro對C/D環的結構產生重大影響，在大鼠和小鼠蛋白中刪除3個胺基酸也同樣如此。類似的，在牛、豬和狗蛋白中Arg^突變為Pro也導致重大的構象重排。該區域中另外的設計方案包括在小鼠蛋白B螺旋上觀察到的Ala46—Val、Glu49~>Asp突變，以及C/D環上的Val85—Leu突變。用不同物種的B螺旋和C/D環的胺基酸替換人類蛋白中的相應胺基酸，使用高優化InsighUI為每個突變蛋白建立模型，也可使用其它建模工具進行。狗模型:所有構建的5個模型的能量相似。對模型的檢驗表明它們的CD環和其它結構都^M目似。因此將犬科IL-13B螺旋和CD環的殘基替換為人類蛋白相應殘基後，預測將得到合適的嵌合蛋白。牛模型:所有5個模型的能量相似。在所有3個才莫型的81-85側鏈中的位置上有較大的差異，但是這種差異不比在20NMR模型中觀察到的差異更大。在CD環上添加額外的脯氨酸沒有顯著改變構象。因此這些替換預測會產生可用的嵌合體。豬模型:所有5個模型的能量相似。如同牛模型，在環側鏈的29一些胺基酸位置上存在差異，但在骨架上沒有顯著差異。在B螺旋開始處添加胺基酸取得良好效果，因此預測該變異體將是可用的嵌合體。小鼠糹莫型:在環上刪除3個胺基酸後，所有5個模型的環構象都與人模型產生了顯著差異。所有模型都具有低能量，根據絕對能量比較，這些模型是所有嵌合體中能量最低的。4個螺旋的整體結構幾乎沒有變化，預測該變異體將是合適的嵌合體。所有這些嵌合體都具有可用的構象，並且在A、C和D螺旋都具有相似結構。推薦的嵌合體序列如下人天然蛋白GPVPPSTALREMEELWITQNQKAPIiCNGSMVWSINI/TAGMYCAALES1j人-牛(SEQIDNO:12)GPVPPSTALREL工EELVN工TQNQKAPLCNGSMVWS工NLTAGMYCAALESL人陽豬SEQIDNO:13)GPVPPSTALRELIEEIjVNITQNQKAPLCNGSMVWS工NLTAGMgYCAALESL人-狗(SEQIDNO:14)GPVFPSTALRELIEELVN工TQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESL人-小鼠(SEQIDNO:15)GPVPPSTALREL工EELVN工T,KAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESL人天然蛋白工NVSGCSAIEKTQRMLSGFC'PHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLL人-牛INJSGCSA工EKTQRMLSGFCPHK￡SA￡Q3[SSg^VRDTK工EVAQFVKDLLL人_豬工n王SGCSAIEKTQRMIjSGFCSHKPPSEQVPqKHIRDTK工EVAQFVKDIiLli人-狗INVSGCSA工EKTQRMLSGFCSQKjfA^GQj,SSER3RDTK工EVAQFVKDMiL人-鼠INJSGCSAIBKTQRMLSGFCMRK&yrTVS_SL￡_pTK工BVAQFVKDLIjLHuinanHLKKIiFREGRFN人HLKKLFRBGRFN人_牛HLKKIiFREGRFN人_豬HLKKLFREGRFN人_鼠HLKKLFREGRFN列出了嵌合體誘殺蛋白序列SEQIDNO:12(人-牛)、SEQIDNO:13(人-豬)、SEQIDNO:14(人-狗)、SEQIDNO:15(人-鼠)。這些嵌合蛋白的用途之一是選擇可功能性中和人IL-13活性的抗體。可通過抗體文庫篩選/選擇技術例如抗體噬菌體展示來回收得到抗體。另一方面，這些嵌合IL-13蛋白可用於篩選和/或選擇具有中和作用的抗體。在一個實施方案中，用IL-13或一個(或多個)這些嵌合蛋白免疫動物並回收雜交瘤，可根據這些雜交瘤與未用於免疫的嵌合體間的結合來對雜交瘤進行選擇，從而避免抗體識別C/D環。在另一實施方案中，可以不同方式聯合使用這些嵌合蛋白以選擇和篩選組合抗體文庫，尤其是噬菌體展示文庫。根據這裡描述的設計思路，選擇或篩選過程會抑制抗體識別C/D環。因此，以上兩種實施方案都可有助於分離具有中和作用的抗體，尤其是那些識別A、C和D螺旋(這些結構在物種變異體和構建的嵌合蛋白中都是完全保守的)的抗體。這些突變體的第二種應用是作為人IL-13的拮抗劑。已知IL-13結合兩個受體亞單位。在該分子兩個區域內引入非人類胺基酸所引起的人IL-13結構微小變化，會對它與兩個受體亞單位間的結合產生變構影響。通過選擇性抑制受體亞單位結合作用，可得到竟爭性拮抗劑。實施例3:使用NMR數據進行工程誘殺蛋白計算本發明描述了使用核磁共振技術(NMR)來鑑別蛋白表位的新型方法。NMR技術根據原子局部環境鑑別特定原子(一般是H1、C13、N15)，從而鑑別胺基酸。碳和氮NMR譜的複雜度小於質子NMR鐠，而所需原子核的天然豐度會限制敏感性。對大蛋白來說，相似環境中原子間會存在較大數目的語重疊。如果時間足夠並且設備解析度足夠高，可以完成大蛋白的大多數或全部共振的完整排布。當抗體結合於抗原上時，一些胺基酸的局部環境就發生變化。那些變化最大的胺基酸就是那些參與到抗體接觸程度最大的胺基酸。鑑別表位的策略是，對結合和未結合狀態下的抗原和抗體進行完整NMR排布，來確定哪個胺基酸發生了原子移動。如果沒有今天的設備和方法，那麼抗原-抗體複合物NMRi普的複雜度就會使這種分析極端困難，並且無法應用於常規表位鑑別。可使用包含富C13或N15胺基酸的蛋白進行蛋白表位鑑別，而這其中並不總是需要精確的NMR信號鑑別。這些表位可以是抗體的結合區域，也可以是受體的結合區域。使用重組技術表達修飾蛋白，其某個胺基酸被替換為含有N15或C13標記的同種胺基酸。所得蛋白與未修飾蛋白具有相同結構和活性。然後分別在該修飾蛋白的結合抗體存在和未存在情況下，對該蛋白進行N15或C13NMR譜分析。未標記胺基酸中共振原子核的天然豐度低，這將簡化NMR語，從而使去耦NMR譜根據胺基酸被均一標記還是被特異標記，顯示N15譜的單峰和C13的單峰或其簡單圖式(simplepatterns)。當標記胺基酸參與結合抗體時，將觀察到共振移動(shift)。例如一個長200胺基酸並含有10個N15標記丙氨酸的蛋白，在其N15NMR譜中將看到IO個單峰。如果在結合抗體後這些單峰中有兩個發生移動，那就是由局部環境變化所引起的，從中可以推斷它們在表位中的位置。而那兩個丙氨酸在序列中的位置不能這個單峰鐠中得到。當上述程序重複20次，並且每次標記胺基酸都不同後，就可以知道表位的組成。因為蛋白是通過重組得到的，所以其序列是已知的。根據表位組成和蛋白序列就可以確定表位位置。預測蛋白表面暴露序列的分子模型或算法可有助於表位鑑別。不需要製備20個標記蛋白。在足以分辨不同胺基酸的共振時，可使用多重標記(在同一蛋白中標記2個或多個不同胺基酸)。例如，可在同一蛋白中參入a-N15丙氨酸和e-N15賴氨酸，或者3-N15組氨酸和a-N15亮氨酸。該方法比現有的表位鑑別方法更加優越。那些^f吏用合成肽的鑑別方法(聚乙烯大頭針(pin)肽合成技術、固相(spot)合成技術或液相合成技術與ELISA或竟爭法(competition)聯合使用)或使用噬菌體的鑑別方法可能遺漏構象型表位。而這種NMR方法由於使用完整蛋白，所以可方便的同時檢測到線性型表位和構象型表位。據稱固相(spot)合成變異法(如肽基質(matrix))可更好的鑑別構象型表位，但所需肽的數量使得蛋白中胺基酸的數量發生指數性增長，簡單的說就是一個分子量為40kD的蛋白需要約2百萬個肽。蛋白水解與質譜法聯用可以鑑別一些構象型表位，但這種方法會石皮壞蛋白，同時當蛋白分子變大時需要有更大數量的蛋白用於質鐠。而NMR法對蛋白沒有破壞性。如果標記蛋白量少，那麼可以在每次實驗後回收它並在其它抗體做圖時重複使用。蛋白點突變或"丙氨酸掃描"可有效鑑別線性型表位和構象型表位，但其困難在於每個蛋白都需要有其DNA以進行表達，同時不是所有點突變體都是分泌蛋白，並且還需要確定每個點突變蛋白是否都正確摺疊。而這種NMR法對所有標記蛋白都使用相同DNA，並且標記蛋白與未標記蛋白的分泌和摺疊情況相同。晶體學法是表位鑑別的"金標準"(goldstandard)。它的缺點在於需要大量的時間，可能需要大量蛋白，同時衍射級別的晶體生長困難，並且事實上同一抗原的每個抗體都需要有新蛋白和新晶體。實施例4:用晶體結構構建嵌合誘殺蛋白根據IL-4及其近緣類似物IL-13的晶體結構，選擇一個特殊受體結合域作為抗體靶點。設計並製備一個嵌合蛋白，用以選擇結合33於兩個蛋白的該區域上的結合體。已經得到了IL-4的晶體結構。IL-13的晶體結構尚未被確定，但已構建出一個理論模型。由於其生物學功能，IL-4和IL-13都是重要的治療蛋白。已報導IL-4能夠抑制自身免疫疾病，而IL-4和IL-13都有提高抗腫瘤免疫反應的能力。另一方面，因為這兩種細胞因子都參與過敏疾病的發病機制，所以對它們的拮抗作用將有利於治療過敏和過敏性哞喘。已有文獻描述了一些突變蛋白(如，(IL-4Y124D拮抗劑和IL-13R112D激動劑)theIL-4Y124DantagonistandtheIL-13R112Dagonist,J.Biol.Chem(2000),275，14375-14380)。使用分子模型設計了以下新型IL-4和IL-13激動突變體。因為據預測這些突變體比天然蛋白更加穩定，所以預期它們是與細胞因子受體的結合的生物上更強效的結合體，並具有抗腫瘤藥物的潛力。另外，這些蛋白可被作為天然細胞因子的穩定類似物用在液相淘選方法中，或者用於尋找域選擇性結合劑，如一個受體結合結構域拮抗劑。使用BrookhavenCrystallographicDatabase資料庫中IL-4的分子模型和晶體結構及IL-13的理論模型，檢驗IL-4和IL-13的結構。鑑別出分子結構內部的一些胺基酸，可對這些胺基酸進行替換，並且預計替換不會對結構造成負面影響。事實上，能量計算表明這些替換後的結構比天然序列更加穩定。這些替換是，IL-4:Thr13=〉Ser13、Th產〉Ser22、Phe55=>Tyr55、Phe55=>Tyr55,IL-13:Ile48=>Val48、Gln90=〉Glu90、Leu95=〉lle95、Leu96=>Ile%、Leu99=>Ile99、Phe103=>Tyr103。建立了一個IL-4資料庫(圖6A&6B)，內容包括對暴露胺基酸的計算。第一列僅包括側鏈數據，第二列包括側鏈數據和骨架數據。表面暴露程度很少和不暴露的胺基酸用粗體/藍色和標出。表中去掉了埋藏於分子內部的殘基和半胱氨酸，因為替換它們會影響結構。計算可能的替換，結果如下formulaseeoriginaldocumentpage35通過100個共軛梯度循環，介電值(dielecrtic)100，所有氫用Tripos力場和Kollman-Uni場作用確定，將IL-4的結構範圍最小化。然後進行上文建議的單個變化並計算能量。根據這些計算，最佳替換是Ser換Thr13，Ser換Thr22,Tyr換Phe45,Tyr換Phe55。檢索IL-4晶體結構，計算結構未最小化之前的能量，計算進行上述4個替換後的能量，結果如下:天然晶體結構鍵伸縮能231.645角彎曲能298.910扭轉能453.633面外彎曲能46.674範德華力能386.851範德華力能1134.1991-4靜電能30細靜電能1043.112總能量3612.126kcals/mo1扭轉能、1-4範德華力和範德華力能都降低了。根據能量計算，預測這個結構比天然序列更加穩定。被修飾的胺基酸埋藏於分子內部，但由於評估了替換後認為其不影響對二級結構，所以表面結構沒有變化因而其功能活性也沒有變化。對IL-13構建類似表格(圖7A&7B)。其晶體結構尚未發表但已有理論模型。對原始結構和修飾結構均進行10輪最小化。內部殘基也可淨皮修飾。總戰s匕:3625.巧TkcaTs/mo1幽匕匕匕匕匕匕匕匕匕匕匕匕匕匕233.378299.147449.60546,468384,3341125.51230.6771043細Ser13、Ser23、Tyr45、Tyr55到縮曲轉曲力力電電伸彎扭彎華華靜靜鍵角外德德4面範範btableseeoriginaldocumentpage37儘管用Tyr替換Phe"後能量更高，但其看起來像是一個良好替換。更高的能量來自更高的羥基間範德華力。PheM和His^相互作用(7t-7t)，兩者都必須保持其芳香性。lie替換Val92帶來更高的能量，但少量的最小化(minimization)大大降低了該值。這個替換很可能可用。Tyr替換Phel03增加了一個與His69的額外氫鍵，可能是一個良好替換。檢索IL-13結構，計算能量，進行替換並計算替換後的能量，結果如下起始模型結構鍵伸縮能:290.14角彎曲能:390.042扭轉能:388.721面外彎曲能:30.2171-4範德華力能:286.329範德華力能210.3841-4靜電能:27.906靜電能,-1.547sw備Ht裡r扱IB￡ca1s/molVal48、Glu9Q、lie95、Ile96、Tyr^結構鍵伸縮能288.604角彎曲能383.273扭轉能384.452面外彎曲能-29.8891-4範德華力能284.920範德華力能228觀1-4靜電能27.989靜電能-1.594總能量1626.342kcals/mol鍵伸縮能、角彎曲能、1-4範德華力和範德華力能降低，而扭轉能和鍵伸縮能提高。後者可通過復位新放置的Ile側鏈得以降低。修飾結構能量RMS力max力相互作用EvalCPU時間keals/molkcals/molAkeals/molA計數《十數時間tableseeoriginaldocumentpage39警告已達到最大迭代(iterations)數(10)。IL-13模型1(理論模型)的分子能量鍵伸縮能49.661角彎曲能297.149扭轉能328.222面外彎曲能8.7441-4範德華力能189.249範德華力能8.1391-4靜電能28.271靜電能-1.556總能量，.9-08[cals/一m。r範德華力+靜電對的平均數量=56771-4範德華力+靜電對的平均數量=3415標準(scaled)範德華力+靜電對的平均數量=248tableseeoriginaldocumentpage40範德華力+靜電對的平均數量=57171-4範德華力+靜電對的平均數量=3426標準範德華力+靜電對的平均數量=247tableseeoriginaldocumentpage41使用BrookhavenCrystallographicDatabase資料庫中IL-4的分子模型和晶體結構及IL-13的理論模型，檢驗IL-4和IL-13的結構。鑑別出分子結構內部的一些胺基酸，可對這些胺基酸進行替換，並且預計替換不會對結構造成負面影響。事實上能量計算表明這些替換後的結構比天然序列更加穩定。這些替換是，IL-4:Thr13=>Ser13、Th產〉Ser22、Phe45=〉Tyr45、Phe55=>Tyr55，IL-13:Ile48=>Val48、Gln90=>Glu9、Leu95=>Ile95、Leu96=>Ile%、Leu99=>Ile99、Phe13->Tyr103。完整序列為IL-4構建體(SEQIDNO:16)HKCraTLQE工IK^LNSWEQK互LCTEI(TVTDIfAASKWTTEKET^CRAATVLRQpSHHEKDTRCLGATAQQFhRHKQL工RLKRLDRNtjWGLAGLNSCPVKEA^QSTLENFliE^LiKTIMIL-13構建體(SEQIDNO:17)PPSTALRELi:EEIA/NITQNQKAPLCNGSMVWS工NLTAGMYCAALESLVNVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAgFVKDJ^LH;KKLXREGR^下劃線所示為替換胺基酸。少數最小化後修飾結構的能量更低，這表明這個結構比原始序列更加穩定。這些構建體和通過其它類似方式製備的構建體可用於本發明方法中。權利要求1.一種從文庫中選擇封閉多肽配體結合配偶體的方法，其中待結合配體的特異功能域被預先確定，該方法的步驟包括(a)確定待封閉蛋白的功能域，(b)分析該配體與該配體的一種或多種物種同源物或功能同源物間的共同結構特徵，(c)構建參入有該配體與所選同源物的所述共同結構特徵，但其結構特徵不同於待封閉功能域的誘殺物，(d)建立推定的封閉多肽結合配偶體的文庫，(e)使用過量於該配體結合配偶體的所述誘殺物以選擇優先結合於待封閉配體功能域的結合配偶體。2.權利要求1的方法，其中誘殺物和配體結合配偶體在從文庫進行選擇的過程中同時存在。3.權利要求1的方法，其中誘殺物;故用來從文庫選擇結合體的亞組進行測試，然後淘汰與配體結合配偶體的結合。4.權利要求1的方法，其中靶配體被用來從文庫中選擇結合體的亞組，然後淘汰那些結合於誘殺物的結合體。5.權利要求1的方法，其中結合配偶體是抗體。6.權利要求5的方法，其中的抗體可在雜交瘤上清液中檢測到。7.權利要求6的方法，其中雜交瘤得自用包含想要結合的結構域的待封閉配體或其片段進行免疫處理的動物。8.權利要求6的方法，其中雜交瘤得自用包含想要結合的結構域的誘殺蛋白或其片段進行免疫處理的動物。9.權利要求5的方法，其中的結合配偶體是抗體片段Fab、Fab，或F(ab，)2,或者是這些片段的衍生物。10.權利要求5的方法，其中單克隆抗體是替代抗體，其結合類似表位或鼠組織因子，如同鼠抗人組織因子TF8-5G9。11.一種鑑別能夠結合於靶蛋白的預選定表位的多肽的方法，其步驟包括(a)建立將多肽表達於噬菌體顆粒表面的噬菌體顆粒文庫，(b)製備誘殺蛋白，該蛋白與靶蛋白的預選定表位相比，其胺基酸序列發生了變化，(c)將噬菌體顆粒文庫與靶蛋白一起溫育，以選出具有能夠結合於靶蛋白的多肽的噬菌體顆粒，(d)加入摩爾濃度過量的誘殺蛋白作為竟爭劑，以負選擇出特異於預選定表位的噬菌體顆粒，(e)將結合於靶蛋白的噬菌體顆粒與結合於誘殺蛋白的噬菌體顆粒分離，(f)回收結合於耙蛋白的噬菌體顆粒。12.按權利要求1-11中任一項的方法製得的抗體。全文摘要本發明涉及定向選擇可與靶生物分子中特異性功能域結合的生物治療分子的方法。通過使用以下緊密相關的分子來進行定向選擇，其中之一是誘殺物分子，另一個則含有靶域或表位。本發明根據物理數據，並結合導出數據，來確定誘殺物分子與靶分子間僅存在發生定向結合的特異性功能域或表位的差異。文檔編號C07K16/00GK101426526SQ200580021020公開日2009年5月6日申請日期2005年4月22日優先權日2004年4月26日發明者G·赫夫納,K·奧奈爾,R·斯維特申請人:森託科爾公司