高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑及製備方法
2023-10-04 03:42:29 2
專利名稱：高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑及製備方法
技術領域：
本發明涉及一種測定血清成分試劑的製備方法及試劑，特別是測定血清中的高密度脂蛋白中膽固醇試劑的製備方法與試劑，可廣泛應用在醫學及生物化學技術領域。
背景技術：
心腦血管疾病的發生率與血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)呈負相關已經流行病學和相關臨床證實，檢測高密度脂蛋白膽固醇還可廣泛應用於相關的臨床診治，並作為脂類代謝異常的危險性指標之一。因此高密度脂蛋白膽固醇的準確測定至關重要，特別是在高密度脂蛋白膽固醇下限，極小的誤差可能造成相對較大的影響，而且高密度脂蛋白膽固醇的結果直接影響低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的計算值。目前，對高密度脂蛋白膽固醇的測定方法有已知的超速離心法和電泳法以及中華人民共和國衛生部醫政司編制的《全國臨床檢驗操作規程》第二版279頁所推薦的沉澱法。超速離心法是根據脂蛋白的比重不同，用超速離心器把脂蛋白進行分類，再對膽固醇進行測定。該方法過程分超速離心和膽固醇檢測兩步，費用高、耗時大。電泳法需要藉助一些如瓊脂糖凝膠等做為載體分離，操作極其繁雜。沉澱法是使用多聚陰離子和二價金屬離子試劑沉澱大顆粒的脂蛋白，然後離心，用其上清液測定其含量。該方法雖簡便，但不適用於全自動、大批量樣本檢測，而且對高甘油三酯血症患者，會使高密度脂蛋白膽固醇結果偏高，當高甘油三酯大於5mmol/L時會使計算LDL-C的Friedwald公式受其限制。上述這些已知的方法由於都不能在全自動上直接檢測，近幾年，直接在全自動上進行檢測HDL-C試劑也相繼出現，如中國專利(申請號99116565.9)他們利用聚陰離子複合物與血清中LDL(低密度脂蛋白)、VLDL(極低密度脂蛋白)、CM(乳糜微粒)反應，生成不溶於水的複合物，而HDL-C仍以溶液狀態存在，在膽固醇試劑的存在下進行其測定，本方法中添加了膽酸鈉，可能是為了提高專一性。在本發明中不僅僅HDL起反應，LDL、VLDL等也緩慢地起反應，所以要想得到完全的HDL的反應終點是不可能的。並且特異性也不一定好。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服上述現有技術的不足，提供一種測定高密度脂蛋白中膽固醇的試劑的製備方法及試劑的改進，用該方法所製得的試劑應特異性好、檢測簡便、測試準確率高，並能夠在各種型號的全自動生化分析儀上對高密度脂蛋白中膽固醇進行檢測。
本發明採用了以下技術方案高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑，包括適量防腐劑、穩定劑和色原，該試劑還包括以下成分A、高親合性酶化合物，該酶化合物，由酶和化合物反應而得，其中化合物是甾類糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白質、蛋白質毒素和多烯抗菌素等化合物中的一種或任意比例混合的多種與活化劑混合、活化後的活化物，化合物的濃度為1-50毫克/毫升；酶是1、膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，二者比例10∶1-1∶10、2、脂蛋白脂酶和膽固醇氧化酶，二者比例10∶1-1∶10中的任一組與緩衝液混合、溶解後的溶解物，緩衝液的PH值為5-9，緩衝液的摩爾配比是50-200mmol/L，所述的緩衝液是GOOD』S緩衝液或磷酸鹽緩衝液或三羥甲基氨基甲烷緩衝液或檸檬酸緩衝液或硼酸鹽緩衝液；上述化合物與酶二種成分反應時的摩爾配合比為1∶1-20∶1；B、表面活性劑，其混合比例與A成分的重量百分比是0.003-30，所述的表面活性劑是陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑和非離子表面活性劑中的一種或任意比例混合的多種。
所述的酶優先選擇膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶。
該試劑還包括適量催化劑。
所述的表面活性劑的混合比例為0.01-10重量百分比。
該試劑中還有適量抗幹擾物質。
所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑的製備方法包括以下步驟一、化合物活化選擇所述的甾類糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白質、蛋白質毒素和多烯抗菌素等化合物中的一種或任意比例混合的多種，在水介質中用公知的疊氮法或碳化二亞胺法或丁二醯亞胺法或高碘酸鹽氧化法進行活化，活化條件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶1-1∶10，溫度0-25℃，PH在4-11範圍內，時間0.1-24小時。
二、酶溶解選擇所述的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，或脂蛋白脂酶和膽固醇氧化酶中的任一組，溶解在緩衝液中；三、混合反應活化後的化合物與溶解後的酶混合，該溶液在0-25℃的溫度下反應18-24小時；四、配置反應後的酶化合物與表面活性劑混合，並加入防腐劑、穩定劑、用於顯色測定的色原和催化劑。
所述的甾類糖苷、三萜烯糖苷或多烯抗生素預先置於以下有機溶劑混合物中溶解二甲亞碸或甲醯替二甲胺或六甲醇與甲苯按2∶1混合的混合物，或者，甲醯替二甲胺與乙醇按2∶1混合的混合物；化合物與有機溶劑混合物的重量比例為1∶30-1∶0.01。
該試劑中還加入抗幹擾劑物質。
本發明所提供的高密度脂蛋白中膽固醇測定試劑的製備方法及試劑，能夠直接在各種型號的全自動生化分析儀上對高密度脂蛋白中膽固醇進行檢測，省卻了樣本離心、沉澱等繁雜步驟，大幅度減輕了檢測工作量、減少了檢測時間、降低了檢測成本；而且試劑的特異性好，檢測的準確率較高，與國家推薦的沉澱法的檢測效果比較，相關性達到0.98以上。
圖1至圖3分別是本發明的實施例1至實施例3的測得值與沉澱法(《全國臨床檢驗操作規程》第二版279頁所推薦)的測得值的相關性示意圖。
具體實施例方式
經研究發現用經製備的高親合性膽固醇酯酶化合物和高親合性膽固醇氧化酶化合物及對高密度脂蛋白中膽固醇具有較強作用的表面活性劑配製的試劑用來測定經超速離心分離出的HDL、LDL、VLDL及CM各組份脂蛋白時，上述各組份脂蛋白膽固醇的反應性顯示出不同，且不同組份的選擇性和反應性為HDL＞LDL＞VLDL＞CM。當表面活性劑濃度達一定時，LDL、VLDL、CM在很長時間內不參加測定HDL的反應。
由此，本發明提供的試劑及其製備方法是一、選用高親合性酶化合物該酶化合物，由酶和化合物製備而得，其中1、化合物選自甾類糖苷，該甾類糖苷在其結構中具有作為配基的呋甾烷醇或螺甾烷醇的甾環酶，以及具有含3-10個線狀或分支結構單糖的低聚糖酶。或者選自三萜烯糖苷，該三萜烯糖苷在其結構中具有α-或β-胡椒烷、羊毛脂甾烷等的配基，以及具有由2-8個分支或線狀結構基構成的低聚糖，或者選自能夠有選擇地與膽固醇形成複合物的疏水蛋白質，或者選自能夠有選擇地與膽固醇形成複合物的蛋白質毒素，或者選自能夠有選擇地與膽固醇形成複合物的多烯抗菌素。上述化合物可以單獨使用也可以兩種或幾種混合使用，沒有特別的限制，只要製得的酶化合物及對高密度脂蛋白中膽固醇具有較強作用的表面活性劑配製的試劑對高密度脂蛋白中膽固醇的反應比其它脂蛋白膽固醇的反應性強。
本發明中使用的甾類糖苷實例有脫糖毛地黃皂苷、天門冬苷、龍舌苷、羊毛蠟苷等等。
三萜烯糖苷的實例有七葉素、茶皂苷等。
疏水蛋白質實例有脂蛋白的脫水蛋白質、溶酶體的蛋白質等等。
蛋白質毒素可由細菌、海洋微生物等獲得，作為實例有鏈球菌溶血素O、腦酮溶細胞素等。
多烯抗菌素實例有菲律賓菌等。
2、酶選用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，或脂蛋白脂酶和膽固醇氧化酶中任意一組。當然也可以選用其它的酶，只要製得的高親合性酶化合物及對高密度脂蛋白中膽固醇具有較強作用的表面活性劑配成的試劑對高密度脂蛋白中膽固醇的反應比其它脂蛋白膽固醇的反應性強。為了提高檢測的專一性，本發明中優先使用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶的來源不作具體限制。
二、高親合膽固醇酶化合物的製備1、將上述化合物中的一種或幾種混合物在水介質中進行活化將上述化合物中的一種或幾種混合物在水介質中用公知的疊氮法、碳化二亞胺法、丁二醯亞胺法或高碘酸鹽氧化法進行活化，選用的方法最好能夠最大地保持製備的酶化合物的活性。活化條件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶1-1∶10，化合物的濃度為1-50毫克/毫升，溫度0-25℃，PH在4-11範圍內，時間0.1-24小時。眾所周知，其中的活化劑，在疊氮法、碳化二亞胺法、丁二醯亞胺法或高碘酸鹽氧化法中分別是疊氮化物、對環己基-2-(4-嗎啉)乙基-碳化二亞胺-甲基-對甲苯磺酸鹽、N-羥基琥珀醯亞胺以及高碘酸鈉。上面所描述的某些化合物，如甾類糖苷、三萜烯糖苷或多烯抗生素較難溶於水，為使它們完全溶解可預先置於以下不給出質子的極性有機溶劑混合物中溶解二甲亞碸或甲醯替二甲胺或六甲醇與甲苯按2∶1混合的混合物、甲醯替二甲胺與乙醇按2∶1混合的混合物。化合物與有機溶劑混合物的重量比例為1∶30-1∶0.01。
2、所述的膽固醇酯酶或膽固醇氧化酶溶解在PH為5-9範圍的緩衝液中膽固醇酯酶或膽固醇氧化酶溶解在PH為5-9範圍的緩衝液中。為了提高膽固醇酶化合物的親合性，還可向溶液中加入能改變膽固醇酯酶或膽固醇氧化酶化合物中的氨基的高分子聚合物。檢測其活性後直接使用。
3、混合反應活化後的化合物與溶解後的酶按1∶1-20∶1(摩爾比)的比例混合，該溶液在0-25℃的溫度下反應18-24小時；三、配置在製得的酶化合物中加入表面活性劑，表面活性劑的混合比例為前述成分重量百分比的0.003-30，優先混合比例為0.01-10；還可加入適量防腐劑、穩定劑和用於顯色測定的色原，還可考慮加入適量催化劑和抗幹擾物質。
本發明中使用的對高密度脂蛋白膽固醇具有較強作用的表面活性劑可以是陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑或非離子表面性性劑，只要對高密度脂蛋白膽固醇具有較強作用，作為陽離子表面活性劑的實例有月桂醯胺基咪唑啉、棕櫚醯胺基咪唑啉、聚環氧乙烷十二烷胺、聚氧乙烯十六烷胺；作為陰離子表面活性劑的實例有十二(烷)醇聚氧乙烯醚磷酸混合脂、PAM共聚物、十二烷基二苯醚二磺酸鈉、棕櫚醯甲基硫磺酸鈉；作為非離子表面活性劑的實例有磺基咪唑啉甜菜鹼、烷基聚氧乙烯甜菜鹼；作為非離子表面活性劑的實例子有聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、二苄基聯苯基聚氧乙烯醚、失水山梨醇聚氧乙烯、聚氧乙烯-聚氧丙烯聚醚、三苄基酚聚氧乙烯醚等。這裡優選非離子表面活性劑(如Tween-80、Triton X-100、GenapolX-081、Thesit等)。表面活性劑可以單獨使用也可以混合使用，其用量如前所述。
在本發明中為了保持酶化合物和試劑的穩定性，可以加入穩定劑、防腐劑或防黴劑或其它的醇類，如乙二胺四乙酸鈉(EDTA.2Na)、牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、二價金屬離子。防腐劑或防黴劑的種類和用量可多可少不作限定，一般使用範圍0.1-20mmol/L。
在本發明中用於顯色測定的色原有2.4.6-三溴-3-羥基苯甲酸(TBHBA)、3.5-二氯-2-羥基苯甲酸(DHBS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽(TOPS)、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-5-2甲氧基苯胺(HDAOS)、TODP、TOOS等。色原的種類和用量也可多可少不作限定，一般使用範圍0.01-10mmol/L。
本發明所使用的緩衝液，可以是GOOD』S緩衝液、磷酸鹽緩衝液、三羥甲基氨基甲烷緩衝液、檸檬酸緩衝液、硼酸鹽緩衝液等，緩衝液的種類和濃度因具體成份而定，這裡不作限制，只要在PH為5-9的範圍內保證緩衝作用且不抑制酶活性的一種或其混合物。優先選用50-200mmol/L的GOOD』S緩衝液。
催化劑的種類和用量也可多可少不作限定，一般使用範圍也為10U/L-10000U/L。
本發明中為了防止其它非測量物質的幹擾，可加入抗壞血酸氧化酶等抗幹擾物質。該物質的種類和用量也的種類和用量可多可少不作限定，一般使用範圍10U/L-10000U/L。
本發明所採用的所有生化用品均可外購獲得。
本發明所提供的高密度中膽固醇的試劑，在測試時全自動生化分析儀上的主要參數如下
實施例1本實施例中的高親合酶膽固醇酯酶化合物與高親合酶膽固醇氧化酶化合物由甾類糖苷化合物中的龍舌苷甾類糖苷與酶製備；配置方式如前所述，其中化合物活化的活化條件為
化合物與活化劑的摩爾比為1∶1，溫度15℃，PH值為8，時間10小時。
緩衝液的摩爾配比是100mmol/L，緩衝液的PH值為7。
活化後的化合物與溶解後的酶混合，該溶液在15℃的溫度下反應20小時。
所述的龍舌苷預先置於以下有機溶劑混合物中溶解甲醯替二甲胺與甲苯按2∶1混合的混合物，化合物與有機溶劑混合物的重量比例為1∶0.01。
試劑I高親合酶膽固醇酯酶化合物 500U/L高親合酶膽固醇氧化酶化合物 5000U/L緩衝液GOOD』S(PH6.7) 100mmol/L穩定劑BSA1g/L穩定劑聚乙二醇 10g/L穩定劑EDTA.2Na 2mmol/L色原TOPS 2mmol/L防腐劑NaN3 7.5mmol/L催化劑辣根過氧化物酶 950U/L抗幹擾物質抗壞血酸氧化酶 1000U/L試劑II表面活性劑聚氧乙烯烷基苯基醚 500g/L緩衝液GOOD』S(PH6.7) 100mmol/L防腐劑NaN3 7.5mmol/L色原4-AAP0.25mmol/L穩定劑BSA1g/L穩定劑EDTA.2Na 2mmol/L上機測試時試劑I、試劑II同時混合加入測試。
表1為本實施例1的上機測試值與沉澱法的測定值對照表。
圖1根據表1數據製成，本實施例1測得值與沉澱法(《全國臨床檢驗操作規程》第二版279頁所推薦)的測得值的相關性r為0.992，說明相關性良好。
實施例2本實施例中使用膽固醇酯酶化合物、膽固醇氧化酶化合物由三萜烯糖苷類化合物的中的茶皂苷與酶製備；配置方式如前所述，其中化合物活化的活化條件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶5，溫度0℃，PH值為4，時間24小時。
緩衝液的摩爾配比是50mmol/L，緩衝液的PH值為9。
活化後的化合物與溶解後的酶混合，該溶液在0℃的溫度下反應24小時；所述的茶皂苷預先置於以下有機溶劑混合物中溶解甲醯替二甲胺與乙醇按2∶1混合的混合物；化合物與有機溶劑混合物的重量比例為1∶15。
試劑I膽固醇酯酶化合物用量為 5000U/L膽固醇氧化酶化合物用量為4000U/L緩衝液GOOD』S(PH5)50mmol/L穩定劑BSA 1g/L穩定劑Mgcl25mmol/L穩定劑EDTA.2Na 2mmol/L色原TOOS2.2mmol/L防腐劑NaN3 7.5mmol/L催化劑辣根過氧化物酶950U/L抗幹擾物質抗壞血酸氧化酶1000U/L試劑II表面活性劑聚氧乙烯-聚氧丙烯聚醚 600g/L緩衝液GOOD』S(PH6.7) 50mmol/L防腐劑NaN3 7.5mmol/L色原4-AAP 0.20mmol/L穩定劑BSA 1g/L穩定劑EDTA.2Na 2mmol/L
上機測試時試劑I、試劑II同時混合加入測試。
表2為本實施例2的上機測試值與沉澱法的測定值對照表。
圖2根據表2數據製成，本實施例2測得值與沉澱法(《全國臨床檢驗操作規程》第二版279頁所推薦)的測得值的相關性r為0.994，說明相關性良好。
實施例3本實施例中使用膽固醇酯酶化合物、膽固醇氧化酶化合物由由三萜烯糖苷類化合物的中的茶皂苷與酶製備；配置方式如前所述。
化合物活化的活化條件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶10，溫度25℃，PH值11，時間0.1小時。
緩衝液的摩爾配比是200mmol/L，緩衝液的PH值為5。
活化後的化合物與溶解後的酶混合，該溶液在25℃的溫度下反應18小時；所述的茶皂苷預先置於以下有機溶劑混合物中溶解六甲醇與甲苯按2∶1混合的混合物，化合物與有機溶劑混合物的重量比例為1∶30。
試劑I膽固醇酯酶化合物用量為6000U/L膽固醇氧化酶化合物用量為 600U/L緩衝液GOOD』S(PH9) 200mmol/L穩定劑BSA 1g/L穩定劑Mgcl25mmol/L穩定劑EDTA.2Na2mmol/L色原HDAOS 3mmol/L防腐劑NaN37.5mmol/L催化劑辣根過氧化物酶 950U/L抗幹擾物質抗壞血酸氧化酶 1000U/L試劑II表面活性劑三苄基酚聚氧乙烯醚 12g/L緩衝液GOOD』S(PH6.7)200mmol/L防腐劑NaN37.5mmol/L
色原4-AAP 0.15mmol/L穩定劑BSA 1g/L穩定劑EDTA.2Na 2mmol/L上機測試時試劑I、試劑II同時混合加入測試。
表3為本實施例3的上機測試值與沉澱法的測定值對照表。
圖3根據表3數據製成，本實施例3測得值與沉澱法(《全國臨床檢驗操作規程》第二版279頁所推薦)的測得值的相關性r為0.989，說明相關性良好。
表1
表2
表3
權利要求
1.高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑，包括適量防腐劑、穩定劑和色原，其特徵在於該試劑還包括以下成分A、高親合性酶化合物，該酶化合物，由酶和化合物反應而得，其中，化合物是甾類糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白質、蛋白質毒素和多烯抗菌素等化合物中的一種或任意比例混合的多種與活化劑混合、活化後的活化物，化合物的濃度為1-50毫克/毫升；酶是1、膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，二者比例10∶1-1∶10、2、脂蛋白脂酶和膽固醇氧化酶，二者比例10∶1-1∶10中的任一組與緩衝液混合、溶解後的溶解物，緩衝液的PH值為5-9，緩衝液的摩爾配比是50-200mmol/L，所述的緩衝液是GOOD』S緩衝液或磷酸鹽緩衝液或三羥甲基氨基甲烷緩衝液或檸檬酸緩衝液或硼酸鹽緩衝液；上述化合物與酶二種成分反應時的摩爾配合比為1∶1-20∶1；B、表面活性劑，其混合比例為A成分的重量百分比的0.003-30，所述的表面活性劑是陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑和非離子表面活性劑中的一種或任意比例混合的多種。
2.根據權利要求1所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑，其特徵在於所述的酶優先選擇膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶。
3.根據權利要求1所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑，其特徵在於該試劑還包括適量催化劑。
4.根據權利要求1或2或3所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑，其特徵在於所述的表面活性劑的混合比例為0.01-10重量百分比。
5.根據權利要求4所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑，其特徵在於該試劑中還有適量抗幹擾物質。
6.根據權利要求1所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑的製備方法，其特徵在於該方法包括以下步驟一、化合物活化選擇所述的甾類糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白質、蛋白質毒素和多烯抗菌素等化合物中的一種或任意比例混合的多種，在水介質中用公知的疊氮法或碳化二亞胺法或丁二醯亞胺法或高碘酸鹽氧化法進行活化，活化條件為化合物與活化劑的摩爾比為1∶1-1∶10，溫度0-25℃，PH在4-11範圍內，時間0.1-24小時。二、酶溶解選擇所述的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶，或脂蛋白脂酶和膽固醇氧化酶中的任一組，溶解在緩衝液中；三、混合反應活化後的化合物與溶解後的酶混合，該溶液在0-25℃的溫度下反應18-24小時；四、配置反應後的酶化合物與表面活性劑混合，並加入防腐劑、穩定劑、用於顯色測定的色原。
7.根據權利要求6所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑的製備方法，其特徵在於所述的甾類糖苷、三萜烯糖苷或多烯抗生素預先置於以下有機溶劑混合物中溶解二甲亞碸或甲醯替二甲胺或六甲醇與甲苯按2∶1混合的混合物，或者，甲醯替二甲胺與乙醇按2∶1混合的混合物，化合物與有機溶劑混合物的重量比例為1∶30-1∶0.01。
8.根據權利要求6或7所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑的製備方法，其特徵在於該試劑中還加入催化劑。
9.根據權利要求8所述的高密度脂蛋白中膽固醇的測定試劑的製備方法，其特徵在於該試劑中還加入抗幹擾物質。
全文摘要
本發明涉及一種測定血清中的高密度脂蛋白中膽固醇試劑以及製備方法。本發明所要解決的技術問題是提供一種測定高密度脂蛋白中膽固醇的試劑的製備方法及試劑的改進，用該方法所製得的試劑應特異性好、檢測簡便、測試準確率高，並能夠在各種型號的全自動生化分析儀上進行檢測。技術方案是試劑的成分如下A.高親合性酶化合物，由酶和化合物反應而得，二種成分反應時的摩爾配合比為1∶1－20∶1；B.表面活性劑，其混合比例為A成分的重量百分比的0.003－30；C.適量防腐劑、穩定劑、色原。該試劑中還加入適量催化劑和抗幹擾物質。所述的製備方法包括以下步驟一、化合物活化；二、酶溶解；三、混合反應；四、配置。
文檔編號G01N21/77GK1632541SQ20041009938
公開日2005年6月29日 申請日期2004年12月31日 優先權日2004年12月31日
發明者王賢理, 蒙凱 申請人:浙江伊利康生物技術有限公司