楤白皮總皂苷的抗腫瘤的應用的製作方法
2023-10-17 07:20:04
專利名稱：楤白皮總皂苷的抗腫瘤的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於抗腫瘤藥物技術領域，涉及惚白皮總皂苷的抗腫瘤的應用。
背景技術：
惡性腫瘤是嚴重影響人類健康的四大慢性非傳染性疾病之一，處於引起人類死亡疾病的第二位。目前人們對絕大多數腫瘤的治療都缺少有效地治療手段，常見的放療、化療、手術等手段通常或者毒副作用較大或者療效有限。因此迫切需要尋找療效好、副作用小的抗腫瘤藥物，其中，從天然產物中發現的具有抗腫瘤活性物質是一條較好的途徑。秦巴山區是我國天然藥物資源最為豐富的區域之一，其中一些從秦巴地區太白山某些中草藥提取的有效成分已被《美國藥典》錄入或用於臨床腫瘤的治療之中，因此近年來太白山傳統中草藥成為新藥研究的重點領域。
發明內容
本發明解決的問題在於提供惚白皮總皂苷的抗腫瘤的應用，惚白皮總皂苷是一種植物提取物，其毒副作用小、而抗腫瘤療效顯著，是一種新的抗腫瘤藥物。本發明是通過以下技術方案來實現惚白皮總皂苷的抗腫瘤的應用。惚白皮總皂苷用於抗腫瘤藥物的製備的應用。所述的於抗腫瘤藥物為口服給藥。所述的抗腫瘤藥物為抗實體腫瘤或抗非實體腫瘤的藥物。所述的抗實體腫瘤的藥物為抗肝癌、抗黑色素瘤和/或抗肉瘤的藥物；所述的抗非實體腫瘤的藥物為抗白血病的藥物。惚白皮總皂苷在製備抗腫瘤的化療藥物的輔助藥物中的應用。所述的輔助藥物是增強化療藥物的療效或減輕其毒副反應的藥物。環磷醯胺配合使用的應用，用於增強其它抗腫瘤藥物的療效或減輕其它抗腫瘤藥物的毒副反應。惚白皮總皂苷與環磷醯胺配合使用在抗腫瘤藥物的製備的應用。一種口服的具有抗腫瘤作用的中藥提取物，其藥用成分為惚白皮總皂苷，添加或不添加輔料後製成片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑、乳劑、乳膏劑或軟膏劑，其中惚白皮總皂苷的質量分數為O. 1% 100%。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明提供惚白皮總皂苷的抗腫瘤的應用，其毒副作用小、而抗腫瘤療效顯著。惚白皮總皂苷對小鼠S180肉瘤、H22肝癌、小鼠白血病有一定的抑制作用，其中B16和FBL3的IC50為O. 0774g/L, O. 199g/L，在O. 025g/mL到3. 2g/mL濃度範圍內對H22細胞抑制率均在80%以上。在體研究結果顯示灌胃給予小鼠惚白皮總皂苷IOOmg · kg^\200mg · kg'300mg · kg'對小鼠S180肉瘤的抑制率分別為16. 9%,37. 1%、27· 0% ;相同劑量下對H22肝癌的抑制率分別為23. 7%、10%、13. 4%。進一步，提出惚白皮總皂苷與環磷醯胺等抗腫瘤藥的配合使用，惚白皮總皂苷對環磷醯胺的抑瘤作用表現出一定增強效果，從而達到增強其它抗腫瘤藥物療效、減少其它抗腫瘤藥用量或減輕其它抗腫瘤藥物毒副反應的目的。
圖IDDP作用48h後對H22、B16和FBL3腫瘤細胞的抑制作用；圖2為惚白皮總皂苷不同時間點對FBL3細胞的抑制作用；圖3為惚白皮總皂苷對H22、B16和FBL3腫瘤細胞的抑制作用；圖4-1 圖4-3為H22細胞不同處理的細胞觀察圖(IOX 10);圖4_1為正常組，圖
4-2為惚白皮總皂苷O.025g/L組，圖4-3為DDP組；圖5-1 圖5-3為B16細胞不同處理的細胞觀察圖(10X10);圖5-1為正常組，圖
5-2為惚白皮總皂苷O.lg/L組，圖5-3為DDP加藥48h ；圖6-1 圖6-3為FBL3細胞不同處理的細胞觀察圖(10X 10);圖6-1為正常組，圖6-2為惚白皮總皂苷O. 2g/L組，圖6-3為DDP組。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。I.材料與儀器I. I藥物飛天蜈蚣七根皮提取物惚白皮總皂苷，用前以去離子水配置成適當濃度。惚白皮總皂苷的提取為惚木的根皮經乙醇-水溶液浸潰後加熱回流提取，提取液上樣於D-101樹脂柱，用水洗脫至流出液無色後再用乙醇-水溶液梯度洗脫，收集洗脫餾分後回收乙醇，然後用乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯萃取液乾燥後得到惚白皮總皂苷。惚白皮總皂苷抗腫瘤疾病方面有效成分為皂苷類，含齊墩果酸和糖生成的皂甙。用紫外分光光度法以齊墩果酸-3-0-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷為對照，測定惚白皮總皂苷以齊墩果酸-3-0-β -D-吡喃葡萄糖醛酸苷計不得少於30%。具體的提取為取選好的飛天蜈蚣七1000克分別經過衝洗、乾燥後粉碎成粗粉，加乙醇-水溶液8000ml (乙醇濃度為70%，浸潰時間8 12小時，浸潰後回流提取兩次溫度為80 90°C，每次2小時，合併提取液，減壓回收乙醇，濃縮至相對密度I. 06至I. 10(60°C測)，得到濃縮液 2000ml ；濃縮液加水1000ml，攪拌均勻，靜止24小時，抽濾；濾液上D-101樹脂柱，先用水洗脫至無色後棄去，再用乙醇溶液50% 80%梯度洗脫，50%乙醇洗脫液棄去，合併60% 80%梯度洗脫液；洗脫液回收乙醇，濃縮至相對密度I. 06-1. 10 (60°C測)；噴霧乾燥或真空乾燥；取藥物乾燥粉，加水適量溶解均勻後加乙酸乙酯萃取，合併乙酸乙酯萃取液，進行減壓濃縮，濃縮溫度為50°C，真空度為O. 09Mpa，濃縮至溶液相對密度O. 90-0. 95 (50°C測)，即得中草藥提取物惚白皮總皂苷80克。
I. 2 動物昆明小鼠，18 22g，均購自西安交通大學實驗動物中心。動物合格證號=SCXK(K)2007-001。動物分籠飼養，自由飲水，餵顆粒飼料。I. 3細胞株細胞株S180肉瘤細胞株，由西安交通大學醫學院第一附屬醫院分子中心實驗室贈予；H22和FBL3由西安交通大學醫學院癌症研究所實驗室贈予；B16細胞株由西安交通大學醫學院第一附屬醫院泌尿外科國家重點學科實驗室贈予。
具體使用均為上述細胞的傳代培養細胞。I. 4藥品與試劑注射用環磷醯胺(CTX)，江蘇恆瑞醫藥股份有限公司，批號11020121。注射用順鉬(DDP)齊魯製藥有限公司，批號003006100。DMEM培養基賽默飛世爾生物化學製品(北京)有限公司，批號NWG0451 ；新生牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；MTT,上海桑尼生物科技有限公司；DMS0科昊生物工程有限責任公司。I. 5統計學方法實驗數據均以平均值土標準差(I±s)表示，組間均數的兩兩比較採用t檢驗。2、惚白皮總皂苷的抗腫瘤效果2. IMTT法檢測惚白皮總皂苷對腫瘤細胞的增殖抑制作用分別取對數生長期、CO2孵箱37°C培養的H22，FBL3和B16細胞，製成單個細胞懸液，使細胞濃度為5000個/孔，接種於96孔板，每孔加IOOul的細胞懸液。H22為懸浮細胞，而FBL3和B16則需貼壁生長。因此H22在接種後立即每孔加藥(惚白皮總皂苷或陽性對照藥DDP)20ul，然後使總體積為200ul，FBL3和B16培養24h待貼壁細胞後加藥(惚白皮總皂苷或陽性對照藥DDP)。每個濃度設6個復孔，惚白皮總皂苷的終濃度分別為0. 025g/L、0. 05g/L、0. lg/L、0. 2g/L、0. 4g/L、0. 8g/L、l. 6g/L、3. 2g/L。同時設置對照組(不加藥)、調零組(加培養基和溶媒)和陽性藥順鉬(DDP)組。加藥後CO2孵箱37°C繼續培養。加藥培養48h後，每孔加MTT 20ul繼續培養4h，懸浮細胞2000r離心lOmin，棄去上清，每空加入150ulDMS0，在搖床上震蕩lOmin，在酶標儀450nm波長下檢測各孔的OD值，按下列公式計算抑制率。細胞增值抑制率％= [I- (OD給難-OD調零組)/ (OD對照組-OD調零組)]X 100%如圖I所示，在培養48h後，陽性對照藥順鉬則對H22、B16和FBL3細胞的抑制作用均呈現劑量依賴關係；在25 lOOumol/L範圍內，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，細胞生長抑制越明顯。當惚白皮總皂苷在0. 025g/L 3. 2g/L濃度範圍內，作用於FBL3細胞24h後，如圖2所示，藥物對腫瘤細胞的抑制作用隨濃度的升高有升高的趨勢，但量效關係並不十分明顯；當藥物作用48h後，藥物作用表現出了明顯的量效關係，藥物抑制腫瘤細胞生長的作用呈現明顯的S型曲線，也表明藥物作用48h後作用明顯。因此在後續檢測時選擇培養48h作為觀察時間點。在O. 025g/L 3. 2g/L濃度範圍內，加入惚白皮總皂苷與H22細胞共同培養48h後，其表現出明顯的腫瘤抑制作用，抑制率均在80%以上；與此同時，在O. 05g/L O. 4g/L濃度範圍內，惚白皮總皂苷對B16細胞的抑制作用則呈現出濃度依賴關係，隨著濃度的增加，腫瘤抑制率明顯上升，從O上升至80%以上，計算IC50為O. 199g/L ;在O. 025g/L O. 2g/L濃度範圍內，對B16細胞抑制率有明顯上升，從O上升至80%以上，IC5tl為O. 0774g/L，見圖3。2. 2腫瘤細胞形態變化的觀察在加入藥物48h後，分別於倒置顯微鏡下觀察不同時期細胞的生長狀態及細胞形態。H22細胞的觀察如圖4-1 圖4_3所示，H22細胞為懸浮細胞，對照組細胞形態完整，折光性強，細胞間界限清晰(圖4-1)。在陽性對照組，H22細胞碎片增多，發生死亡(圖
4-3)。惚白皮總皂苷組在藥物作用48h後，細胞形態由圓形變為不規則形狀，胞漿濃縮，核膜核仁破碎，出現大量的細胞碎片，顯示對腫瘤細胞具有抑制作用(圖4-2)。B16細胞的觀察如圖5-1 圖5-3所示，對照組細胞形態完整，貼壁生長旺盛(圖
5-1)。在陽性對照組，B16細胞核固縮，細胞變圓破裂(圖5-3)。在惚白皮總皂苷藥物作用48h後，B16細胞數量減少，活力下降，貼壁細胞變圓浮起，胞漿內空泡增加，細胞形態的完整性受到破壞，逐漸變圓脫落，形成大量的細胞碎片，表現出明顯的抗腫瘤作用(圖5-2)。如圖6-1 圖6-2所示，FBL3細胞的在加藥(圖6-2)或不加藥(圖6-1)培養48h後觀察腫瘤細胞的形態發現，在藥物作用後，細胞數量減少，細胞活力下降，貼壁細胞由不規則形狀變圓浮起，形態完整性收到破壞，形成大量細胞碎片，表現出明顯的抗腫瘤作用。在陽性對照組，FBL3細胞細胞核固縮，細胞破碎發生死亡(圖6-3)。2. 3惚白皮總皂苷對小鼠移植性小鼠S180肉瘤生長的抑制作用選擇腫瘤生長旺盛且無破潰、腹腔接種S180後7 8d的昆明小鼠，脫臼處死，酒精消毒皮膚，無菌條件下在超淨臺內吸取腫瘤腹水，以生理鹽水稀釋，O. 4%臺盼藍(Sigma公司)染色法計數活細胞數，活細胞數在95%以上，使成IX IO7個/mL，無菌條件下，昆明小鼠60隻，18 22g，鼠右前肢腋下接種S180肉瘤細胞懸液O. 2mL。接種腫瘤細胞前用75%乙醇消毒接種部位的皮膚，接種後將小鼠隨機分組，每組12隻，分別為模型組，陽性對照組(CTX，30mg · kg—1)，惚白皮總皂苷高、中、低劑量(300mg · kg'200mg · kg'IOOmg · kg-1)組。藥物配置成適當濃度，灌胃 ig (O. 2ml/10g)或腹腔注射ip (O. 2ml/10g)給藥，每日I次，連續給藥10天。末次藥後24h，稱體重，脫臼處
死動物，解剖剝離瘤塊，稱重，計算抑瘤率。
抑瘤率—對照組平均瘤重-治療組平均瘤重
—對照組平均瘤重X100 %。結果表明，在50mg ^kg4IOOmg *kg_1劑量範圍均表現出一定的抑瘤效果統計結果表明，200mg kg—1惚白皮總皂苷表現出一定的抑瘤效果，並具有統計學意義(P〈0. 05)，抑瘤率37. 1% (見表I)。IOOmg · kg-1和300mg · kg-1組也表現出了一定的抑瘤效果，但無統計學意義。陽性對照組CTX則表現出非常顯著的抑瘤效果(P〈0. 01)，抑瘤率49. 4%。表I.惚白皮總皂苷對小鼠移植S180實體瘤的治療作用([士 s )
權利要求
1.惚白皮總皂苷的抗腫瘤的應用。
2.惚白皮總皂苷用於抗腫瘤藥物的製備的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述的於抗腫瘤藥物為口服給藥。
4.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述的抗腫瘤藥物為抗實體腫瘤或抗非實體腫瘤的藥物。
5.如權利要求4所述的應用，其特徵在於，所述的抗實體腫瘤的藥物為抗肝癌、抗黑色素瘤和/或抗肉瘤的藥物；所述的抗非實體腫瘤的藥物為抗白血病的藥物。
6.惚白皮總皂苷在製備抗腫瘤的化療藥物的輔助藥物中的應用。
7.如權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述的輔助藥物是增強化療藥物的療效或減輕其毒副反應的藥物。
8.環磷醯胺配合使用的應用，其特徵在於，用於增強其它抗腫瘤藥物的療效或減輕其它抗腫瘤藥物的毒副反應。
9.惚白皮總皂苷與環磷醯胺配合使用在抗腫瘤藥物的製備的應用。
10.一種口服的具有抗腫瘤作用的中藥提取物，其藥用成分為惚白皮總皂苷，添加或不添加輔料後製成片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑、乳劑、乳膏劑或軟膏齊U，其中惚白皮總皂苷的質量分數為0.1% 100%。
全文摘要
本發明公開了楤白皮總皂苷的抗腫瘤的應用，其毒副作用小、而抗腫瘤療效顯著。楤白皮總皂苷對小鼠S180肉瘤、H22肝癌、小鼠白血病有一定的抑制作用，其中B16和FBL3的IC50為0.0774g/L，0.199g/L，在0.025g/mL到3.2g/mL濃度範圍內對H22細胞抑制率均在80%以上。灌胃給予小鼠楤白皮總皂苷100mg·kg-1、200mg·kg-1、300mg·kg-1，對小鼠S180肉瘤的抑制率分別為16.9%、37.1%、27.0%；相同劑量下對H22肝癌的抑制率分別為23.7%、10%、13.4%。
文檔編號A61K31/675GK102824386SQ20121017880
公開日2012年12月19日 申請日期2012年6月1日 優先權日2012年6月1日
發明者封衛毅, 鄭巧偉, 肖志強, 楊建剛, 倪亞會, 孟祥海 申請人:陝西新藥技術開發中心