一種甘蔗黃蚜室內人工飼養繁殖方法與流程
2023-10-17 05:40:29 1
本發明涉及一種昆蟲飼養繁殖方法，具體涉及一種甘蔗黃蚜室內人工飼養繁殖方法，屬昆蟲飼養繁殖技術領域。
背景技術：
甘蔗蚜蟲（melanaphissacchari）有甘蔗黃蚜longiunguissaccharizehntner（又稱高粱蚜）、甘蔗綿蚜ceratovacunalanigerazehntner（又名粉蚜）和刺根蚜tetrancurabirsutabaker三種，為同翅目，蚜蟲科。其中甘蔗黃蚜以成蟲或若蟲群集甘蔗葉片葉背吸食汁液，使蔗葉枯黃甚至凋萎，分泌出的大量蜜露可引起煤煙病，影響光合作用，造成產量減產、糖分下降。甘蔗黃蚜也是傳播甘蔗花葉病毒、高梁花葉病毒和甘蔗黃葉病毒等多種植物病毒的傳播媒介昆蟲，以非持久性方式傳播。
目前，甘蔗黃蚜作為病毒傳播途徑和抗藥性試驗等實驗材料，所用蟲源一般直接採自田間寄主植株，需要花費大量人力物力，並且在自然環境下，甘蔗黃蚜的生長繁殖受季節和環境條件影響，不能保證有足夠的實驗材料，且均一性較差。因此，急需解決甘蔗黃蚜室內人工飼養繁殖技術問題，建立簡單易行、快速大量繁殖技術體系，為甘蔗抗病蟲育種及防治甘蔗黃蚜的新型農藥的研發提供可靠的、均一性好、不受季節限制的蟲源實驗材料。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種室內人工大量繁殖甘蔗黃蚜的方法，可以方便快捷周年持續提供足夠數量的無病毒、無菌、均一性好的甘蔗黃蚜。
本發明的一種甘蔗黃蚜室內人工飼養繁殖方法，其特徵在於室內人工飼養繁殖的步驟如下：
（1）無菌無毒甘蔗組培瓶苗的培養：培養、擴繁經檢測不攜帶病毒的無菌無毒甘蔗組培瓶苗，並以無菌無毒甘蔗組培瓶苗，作為甘蔗黃蚜的飼養介質；
（2）甘蔗黃蚜的消毒：從田間採集帶有甘蔗黃蚜的甘蔗葉片，在群集一起的甘蔗黃蚜群體中抽取出若干個體，採用分子生物學rt-pcr檢測方法確定沒有攜帶病毒後，先用無菌水衝洗，無菌濾紙吸乾水分，然後在超淨工作檯上用消毒劑消毒3~5min，再用無菌水衝洗3~5次，用無菌濾紙吸乾水分，獲得無菌無毒甘蔗黃蚜；
（3）甘蔗黃蚜無病毒、無菌化、均一化培養：在步驟（2）的無菌無毒甘蔗黃蚜中，選取大小一致的若干個體，接種於若干無菌無毒甘蔗組培瓶苗中，旋緊含透氣膜的瓶蓋，置於18~30℃、光照8~16h·d-1、光強2000~10000lx條件下培養；以無菌無毒甘蔗組培瓶苗作為甘蔗黃蚜的飼養介質，在人工飼養繁殖過程中，每間隔一段時間更換新的無菌無毒甘蔗組培瓶苗，即可不間斷獲得無病毒、無菌、均一的甘蔗黃蚜種群；
（4）甘蔗黃蚜無病毒無菌化傳代培養：取步驟（2）或（3）獲得的甘蔗黃蚜作為蟲源，按步驟（3）的飼養方法，傳代繁殖，從而保持無毒無菌甘蔗黃蚜的持續傳代繁殖。
其中，步驟（2）所述的消毒劑是重量百分濃度為0.1%的hgcl2。
步驟（3）所述接種，指每瓶接入一隻無菌無毒的甘蔗黃蚜。
步驟（3）所述的每間隔一段時間，是每間隔10~12d。
本發明的優點及有益之處：
1、本發明的甘蔗黃蚜室內人工飼養繁殖方法，在室內利用無菌無毒甘蔗組培瓶苗人工飼養繁殖無菌無毒甘蔗黃蚜，不受自然條件的影響，可以周年提供足夠數量的無毒、均一蟲源。
2、無菌無毒甘蔗黃蚜在密閉的培養容器內生長繁殖，不會遷移至外界環境中，避免了對周邊作物病原的傳播和相應病害的流行。
3、無菌無毒甘蔗黃蚜在密閉的培養容器內生長繁殖，常年保持無菌狀態，不受環境微生物和天敵影響。
4、用無菌無毒甘蔗組培瓶苗作為飼養介質，成本低、易操作。
附圖說明
圖1：甘蔗黃蚜接種2天後的無菌無毒甘蔗組培瓶苗。
圖2：甘蔗黃蚜在無菌無毒甘蔗組培瓶苗中的繁殖後代。
圖3：甘蔗黃蚜在無菌無毒甘蔗組培瓶苗中生長繁殖曲線。圖中，橫坐標表示接種後的天數，縱坐標表示繁殖倍數。
具體實施方式
為了充分公開本發明的甘蔗黃蚜室內人工飼養繁殖方法，下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
實施例1、一種甘蔗黃蚜室內人工飼養繁殖方法，包括以下步驟：
從田間取生長健壯、無病蟲害的福農41甘蔗植株，砍成單芽莖段，選擇生長飽滿的芽，於52℃恆溫循環熱水浴處理30min，置37℃催芽，芽高不低於5cm時，取葉片，參考發表在《annalsofappliedbiology》（luoetal.,2016）和《virusgenes》（gaoetal.,2012）文獻所描述的甘蔗花葉病毒、高梁花葉病毒和甘蔗黃葉病毒的rt-pcr檢測方法，確定沒有攜帶病毒後，取芽，芽用75%乙醇消毒0~30s，用0.1%hgcl2消毒15min，剝去3~5片葉鞘，切下長約1cm帶生長點的莖尖接種於培養基a（ms+6-ba1.0mg/l+kt0.5mg/l+活性炭0.5g/l+糖20g/l）中，於25±2℃、光照10~12h·d-1、光強2000~3000lx條件下的人工氣候箱裡培養，每20d轉接到相同成分的新鮮培養基中，長出叢芽後轉入培養基b（ms+6-ba1.0mg/l+kt0.5mg/l+糖20g/l+瓊脂5~7g/l）中，每20d轉接到相同成分新鮮培養基中，生長至3~5cm高度的無菌無毒甘蔗組培瓶苗作為甘蔗黃蚜的飼養介質。
田間取帶有甘蔗黃蚜的甘蔗葉片，從群集一起的甘蔗黃蚜群體中隨機抽取出12頭個體，參考發表在《annalsofappliedbiology》（luoetal.,2016）和《virusgenes》（gaoetal.,2012）文獻所描述的甘蔗花葉病毒、高梁花葉病毒和甘蔗黃葉病毒的rt-pcr檢測方法，確定沒有攜帶病毒後，將帶有其餘甘蔗黃蚜的甘蔗葉片先用無菌水衝洗，隨後用無菌濾紙吸乾水分，在超淨工作檯上按無菌操作方式進行消毒、接種。然後用重量百分濃度為0.1%的hgcl2消毒4min，再用無菌水衝洗3次後，將其置於無菌濾紙上，把帶甘蔗黃蚜的葉片分割成僅攜帶1隻甘蔗黃蚜的小塊葉片，接入無菌無毒甘蔗組培瓶苗中，如圖1所示，每瓶接種一塊葉片，即每瓶接入一隻無菌無毒的甘蔗黃蚜。。
將接種過的無菌甘蔗組培瓶苗置於22±1℃、光照12h·d-1、光強6000lx條件下培養，48h內可觀察到甘蔗黃蚜遷移到無菌植株上。甘蔗黃蚜在無菌無毒甘蔗植株上生長繁殖，3~5d一代，世代重疊。如圖2所示，無菌無毒甘蔗黃蚜在室內人工飼養繁殖的過程中，隨著人工飼養繁殖的時間延長，甘蔗黃蚜種群數量也逐漸增加；如圖3所示，當人工飼養繁殖8d之後，甘蔗黃蚜種群數量急劇擴增；人工飼養繁殖10d時，平均繁殖倍數為29.8倍；人工飼養繁殖12d時，平均繁殖倍數為58.5倍。這時由於甘蔗黃蚜群體數量過大，一些甘蔗黃蚜個體出現死亡現象。因此，人工飼養繁殖10~12d時剪取帶有甘蔗黃蚜的無菌植株葉片轉接到新鮮無菌組培瓶苗中繼續傳代繁殖；或者選取均一性好的甘蔗黃蚜作為傳毒實驗或抗藥性等實驗的蟲源。以上甘蔗黃蚜經過分子生物學rt-pcr檢測，沒有檢測到甘蔗花葉病毒、高梁花葉病毒和甘蔗黃葉病毒。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。