一種牙鮃抗凍蛋白的應用的製作方法
2023-10-08 08:40:34
一種牙鮃抗凍蛋白的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及水產生物技術中的功能基因篩選與應用【技術領域】，具體地說是一種牙鮃抗凍蛋白的應用。牙鮃IV型抗凍蛋白作為製備低溫保護劑的應用。本發明克隆並表達獲得的牙鮃IV型抗凍蛋白，並通過體外細菌低溫保護保護實驗分析其低溫保護作用。該蛋白容易通過細菌大量表達，在本發明的表達、純化條件下能夠自然摺疊，具有天然蛋白的特性，避免了體外表達蛋白的變性復性過程。
【專利說明】一種牙鮃抗凍蛋白的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及水產生物技術中的功能基因篩選與應用【技術領域】，具體地說是一種牙 鮃抗凍蛋白的應用。
【背景技術】
[0002] 在極端的寒冷條件下，魚類為了避免冰凍對機體的損傷，進化出抗凍蛋白 (Antifreeze protein，AFP)。AFP最早是由DeVries在南極Mcmurdo海峽的一種南極魚科 魚類Antarctic Nototheniids (Trematomus nicolai)的血液中發現。其生物學功能為特 異地與冰晶結合，吸附在其表面並抑制其生長，改變其形態，從而減緩冰晶生長速度。此外， 還具有重結晶抑制效應，使體內的冰晶主要以體積小而均勻的狀態存在，從而避免溫度降 低對生物體造成的傷害。AFP根據蛋白含糖與否分為抗凍糖蛋白（AFGPs)和不含糖的抗凍 蛋白或稱為抗凍多肽（AFP)，不含糖的抗凍蛋白根據其胺基酸組成的差異，又分為I型、II 型、III型和IV型。
[0003] AFP-IV是 Deng 等首先從長角杜父魚（Myoxocephalus octodecimspinosis)的 血清中分離到的一種新型抗凍蛋白。該抗凍蛋白通常含有108個胺基酸，分子量約為 12. 3KDa，並且含有高達17%的Glu，序列與膜載脂蛋白有相似性（約為22% )，因此被認為 是由膜載脂蛋白進化而來。該蛋白三維結構為4個左手α-螺旋反向平行排列摺疊成的一 個螺旋束，其中疏水基團向內，親水基團向外，親水基的表面可與冰晶結合，阻止冰晶從皮 膚表面滲入。此外，側紋南極魚（Pleuragramma antarcticum)和革首南極魚（Notothenia coriiceps)等魚類中也發現了 AFP-IV，並分別進行了原核重組表達，發現AFP-IV熱滯值在 濃度為〇. 5mg/mL時是0. 08°C，具有抗凍活性。
[0004] 牙鮃（Paralichthys olivaceus)，是我國重要的海水養殖魚類之一，其適應性強， 可耐受2°C的低溫。因此，克隆並鑑定牙鮃AFP-IV蛋白，可為該蛋白在低溫保護方面的功能 研究提供基礎。
【發明內容】
[0005] 本發明目的在於提供一種牙鮃抗凍蛋白的應用。
[0006] 為實現上述目的本發明採用的技術方案為：
[0007] -種牙鮃抗凍蛋白的應用，牙鮃IV型抗凍蛋白作為製備低溫保護劑的應用。
[0008] 所述牙鮃AFP IV蛋白用於製備細菌體外的低溫保護劑的應用。
[0009] 所述低溫保護劑是指低溫下能夠維持生物正常生存或者降低生物傷害、死亡的物 質。其中低溫中的最低溫度可達到o°c。
[0010] 所述牙鮃AFP IV由序列表SEQ ID No. 1中核苷酸序列所示。所述序列從牙鮃cDNA 中克隆得到的魚類IV型抗凍蛋白基因同源的基因AFP IV，其CDNA全長652bp，包含375bp 開放閱讀框，編碼124個胺基酸。
[0011] 本發明所具有的優點：
[0012] 本發明克隆並表達獲得的牙鮃IV型抗凍蛋白，並通過體外細菌低溫保護保護實 驗分析其低溫保護作用。該蛋白容易通過細菌大量表達，在本發明的表達、純化條件下能夠 自然摺疊，具有天然蛋白的特性，避免了體外表達蛋白的變性復性過程。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發明實施例提供的pET-30a(+)載體組成示意圖。
[0014] 圖2為本發明實施例提供的重組牙鮃IV型抗凍蛋白純化產物示意圖。
[0015] 圖3為本發明實施例提供的重組牙鮃IV型抗凍蛋白對細菌的抗低溫保護作用曲 線。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1 :牙鮃IV型抗凍蛋白基因的獲得
[0017] 1.採用Trizol提取牙鮃RNA
[0018] a)取牙鮃受精卵約100μ L，先加入200μ L Trizol並進行充分研磨，然後加入 800 μ L Trizol用槍頭吹打均勻，將勻漿樣品在15-30°c放置5min ;
[0019] b)靜置後4°C 12000Xg離心lOmin，取上清至新的離心管中；
[0020] c)而後再在新試管中加200 μ L氯仿，劇烈振蕩15s，靜置2-3min ;
[0021] d)靜置後在4°C，12000 X g，離心15min。離心後樣品分三層，RNA主要在水相；
[0022] e)將600 μ L水相轉移到新的離心管，加600 μ L異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置 lOmin，沉澱 RNA ;
[0023] f)靜置沉澱後在以4°C，12000 X g，離心lOmin，RNA沉澱在管底呈一膠狀片層；
[0024] g)在離心後的管中加入ImL 75%乙醇（DEPC水配製），振蕩後4°C，7500Xg離心 5min,然後去上清；
[0025] 11)空氣乾燥1?敵約5111；[11，加入20以1^0似86、1?似86；1^66水溶解沉澱，可放入58 1€ 水浴IOmin使RNA完全溶解，RNA樣品液氮速凍後保存與-80°C備用。
[0026] 2. cDNA文庫的構建
[0027] 由寶生物工程（大連）有限公司完成。具體為將牙鮃Total RNA，先提取 PolyA+RNA,然後反轉錄合成雙鏈cDNA,經末端平滑化、連接Adaptor、酶切、去除短片段後 連接到pBluescript II SK(+)載體上得到初級cDNA文庫。將連接液部分轉化，塗平板得 至丨J 100萬克隆擴增放大的cDNA文庫。
[0028] 3.牙鮃IV型抗凍蛋白基因序列
[0029] 將百萬擴增文庫甘油菌保存液稀釋IO5倍後塗板，挑單克隆培養，提取質粒，用 EcoR I、Xho I進行雙酶切，篩選大小不同的片段，然後對應的單克隆進行測序。測序引 物：T3Primer :5, -ATTAACCCTCACTAAAGGGAA-3,，T7Primer :5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3,。 將獲得序列在NCBI資料庫進行Blast比對，獲得如SEQ ID No. 1所示的牙鮃IV型抗凍蛋 白基因序列（Genebank :AF384676)。
[0030] SEQ ID No. 1
[0031]
【權利要求】
1. 一種牙鮃抗凍蛋白的應用，其特徵在於：牙鮃IV型抗凍蛋白作為製備低溫保護劑的 應用。
2. 按權利要求1所述的牙鮃抗凍蛋白的應用，其特徵在於：所述牙鮃AFP IV蛋白用於 製備細菌體外的低溫保護劑的應用。
3. 按權利要求1或2所述的牙鮃抗凍蛋白的應用，其特徵在於： 所述牙鮃AFP IV由序列表SEQ ID No. 1中核苷酸序列所示。
【文檔編號】C12N1/04GK104212717SQ201410477873
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月18日 優先權日:2014年9月18日
【發明者】譚訓剛, 王倩, 李美潔, 焦爽, 尤鋒, 鄒玉霞 申請人:中國科學院海洋研究所