一種中藥微生物發酵製劑及其製備方法與應用與流程

2023-10-09 02:22:34

本發明涉及發中藥微生物發酵製劑，具體來說是一種中藥微生物發酵製劑及其製備方法和應用。

背景技術：

腦血栓形成是腦梗死最常見的類型。是腦動脈主幹或皮質支動脈粥樣硬化導致血管增厚、管腔狹窄閉塞和血栓形成，引起腦局部血流減少或供血中斷，腦組織缺血缺氧導致軟化壞死出現局灶性神經系統症狀；該疾病隨年齡增長病死率明顯上升，平均病死率為25％左右，常見死因是腦疝、多臟器衰竭、繼發感染及心肺功能不全倖存者中病殘率亦較高，大約20％的倖存者在1～2年內再次復發。

目前西醫臨床上防治腦血栓的方法主要是急性期內溶栓抗凝抗水腫治療，所用藥物副作用大且復發率高，中醫臨床使用的藥物同樣存在上述缺點。

技術實現要素：

本發明針對上述問題，提供一種副作用小、利用率高、不易復發的中藥微生物發酵製劑及其製備方法和應用，可以有效預防和治療高血壓、腦動脈硬化、腦萎縮、腦血栓及其後遺症。

為實現上述目的，本發明採用的技術方案為：

一種中藥微生物發酵製劑，將側耳與中藥原料藥混合發酵所得，所述中藥原料藥按重量份數計：川穹10-100份，丹參10-100份，三七10-100份，天麻10-100份，白芷10-100份，銀杏葉10-100份，葛根10-100份，蠶蛹10-100份，安息香10-100份，石菖蒲10-100份，僵蠶6-60份，鬱金6-60份，羚羊角6-60份，人工牛黃6-60份，羅布麻6-60份，茯苓6-60份，桂枝6-60份，甘草6-60份，毛冬青6-60份，地龍6-60份，牛膝6-60份，薑黃4-40份，桃仁4-40份，蔓刑子4-40份，黃芪4-40份，路路通4-40份，人參4-40份，黃苓4-40份，獨活4-40份，石斛4-40份，冰片2-20份，穿山甲2-20份，血謁2-20份，水蛭2-20份，珍珠2-20份，大黃2-20份，琥珀2-20份，麻黃2-20份，硃砂2-20份，遠志2-20份，全蠍2-20份，麝香2-20份；側耳佔中藥原料藥質量的5％-10％；

所述側耳為pleurotussp.，已於2014年4月14日保藏在「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，保藏編號為cgmccno.9060。

上述側耳已在cn105412739a(申請號201410480058.0,申請日2014年09月18日)中公布。

本發明中藥原料藥的重量份數優選為：川穹50-100份，丹參50-100份，三七50-100份，天麻50-100份，白芷50-100份，銀杏葉50-100份，葛根50-100份，蠶蛹50-100份，安息香50-100份，石菖蒲50-100份，僵蠶30-60份，鬱金30-60份，羚羊角30-60份，人工牛黃30-60份，羅布麻30-60份，茯苓30-60份，桂枝30-60份，甘草30-60份，毛冬青30-60份，地龍30-60份，牛膝30-60份，薑黃20-40份，桃仁20-40份，蔓刑子20-40份，黃芪20-40份，路路通20-40份，人參20-40份，黃苓20-40份，獨活20-40份，石斛20-40份，冰片10-20份，穿山甲10-20份，血謁10-20份，水蛭10-20份，珍珠10-20份，大黃10-20份，琥珀10-20份，麻黃10-20份，硃砂10-20份，遠志10-20份，全蠍10-20份，麝香10-20份。

本發明中藥原料藥的重量數最優選為：川穹100g，丹參100g，三七100g，天麻100g，白芷100g，銀杏葉100g，葛根100g，蠶蛹100g，安息香100g，石菖蒲100g，僵蠶60g，鬱金60g，羚羊角60g，人工牛黃60g，羅布麻60g，茯苓60g，桂枝60g，甘草60g，毛冬青60g，地龍60g，牛膝60g，薑黃40g，桃仁40g，蔓刑子40g，黃芪40g，路路通40g，人參40g，黃苓40g，獨活40g，石斛40g，冰片20g，穿山甲20g，血謁20g，水蛭20g，珍珠20g，大黃20g，琥珀20g，麻黃20g，硃砂20g，遠志20g，全蠍20g，麝香20g。

所述中藥微生物發酵製劑的製備方法為：

(1)按重量份數計，取川穹10-100份，丹參10-100份，三七10-100份，天麻10-100份，白芷10-100份，銀杏葉10-100份，葛根10-100份，蠶蛹10-100份，安息香10-100份，石菖蒲10-100份，僵蠶6-60份，鬱金6-60份，羚羊角6-60份，人工牛黃6-60份，羅布麻6-60份，茯苓6-60份，桂枝6-60份，甘草6-60份，毛冬青6-60份，地龍6-60份，牛膝6-60份，薑黃4-40份，桃仁4-40份，蔓刑子4-40份，黃芪4-40份，路路通4-40份，人參4-40份，黃苓4-40份，獨活4-40份，石斛4-40份，冰片2-20份，穿山甲2-20份，血謁2-20份，水蛭2-20份，珍珠2-20份，大黃2-20份，琥珀2-20份，麻黃2-20份，硃砂2-20份，遠志2-20份，全蠍2-20份，麝香2-20份的中藥原料藥混合，待用；

(2)取步驟(1)的中藥原料混合物與側耳混合發酵後,得到發酵物,將發酵物乾燥、磨成細粉即得到中藥微生物發酵製劑；

所述步驟(2)側耳接種量為中藥原料的5％-10％，並在溫度為37-65℃、溼度為80％-98％條件下發酵1-7天，得到中藥微生物發酵製劑。

所述側耳(pleurotussp.)，已於2014年4月14日保藏在「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，保藏編號為cgmccno.9060。

所述中藥微生物發酵製劑可製成散劑、片劑、丸劑、膠丸、膠囊劑、乳劑、糖漿或口服液。

所述中藥微生物發酵製劑的應用：作為製備預防或治療高血壓、腦動脈硬化、腦萎縮、腦血栓、腦梗塞及其後遺症的藥物中的應用。

本發明的發酵中藥製劑是參照君臣佐使的中藥組方原則所設計的現代中藥。採用的原料藥的功效如下所示：

川穹中的川穹嗪能擴張冠狀動脈，增加冠狀動脈血流量，改善心肌的血氧供應，並降低心肌的耗氧量；可擴張腦血管，降低血管阻力，顯著增加腦及肢體血流量，改善微循環；能降低血小板表面活性，抑制血小板凝集，預防血栓的形成。

天麻可鎮靜、降壓、增加冠狀動脈血流量、促進腦血流、降低腦血管阻力，增加耐缺氧力和對心肌缺血有保護作用。天麻尤其對多種原因所致眩暈有良效，同時治療老年人多發的高血壓。

上述中藥中川穹，丹參，三七，天麻，白芷，銀杏葉，葛根，蠶蛹，安息香和石菖蒲作為主藥，其他藥物作為輔藥；主要和輔藥混合可更有效的提高各自成分的作用；同時可將輔藥中各類成分按照6:4:2的質量比例混合，即輔藥1：輔藥2：輔藥3為6:4:2，其中輔藥1為僵蠶，鬱金，羚羊角，人工牛黃，羅布麻，茯苓，桂枝，甘草，毛冬青，地龍和牛膝；輔藥2為薑黃，桃仁，蔓刑子，黃芪，路路通，人參，黃苓，獨活和石斛；輔藥3為冰片，穿山甲，血謁，水蛭，珍珠，大黃，琥珀，麻黃，硃砂，遠志，全蠍和麝香；將中藥按照10:6:4:2的科學配伍比例，可有效將各中藥成分間的相輔相成作用發揮極致，進而再將微生物在其中進行發酵，所得發酵物在經側耳發酵後吸取中藥同時發酵產生的有益物質能夠更好的作為預防或治療高血壓、腦動脈硬化、腦萎縮、腦血栓、腦梗塞及其後遺症的藥物；所述後遺症指偏癱(半身不遂)、四肢麻木、語言障礙、頭痛、頭暈、眼花、耳鳴、失眠、反應遲鈍、應激差、記憶力減退等。

本發明的有益效果在於：

1.本發明提供的中藥微生物發酵製劑具有活血化瘀、溫經通絡、消腫降壓、鎮靜安神、扶正固本中和調理的作用。

2.本發明為純發酵微生物中藥製劑，無毒無副作用，安全可靠；另外，本發明在繼承中藥炮製學發酵法基礎上，結合現代生物工程的發酵技術，利用側耳對中藥材進行發酵處理，增加了藥物的療效和利用率。

3.多味藥材科學配伍，溫寒互補，能調養五臟，淨化血液，充盈氣血，清除血管垃圾並能有效預防復發。

具體實施方式

以下實施例用於進一步詳細描述本發明，但不構成對本發明的限制，本發明的具體數據絕非僅限於這些實施例。

一、藥物製備

實施例1

1.按重量份數計，取川穹50份，丹參50份，三七50份，天麻50份，白芷50份，銀杏葉50份，葛根50份，蠶蛹50份，安息香50份，石菖蒲50份，僵蠶30份，鬱金30份，羚羊角30份，人工牛黃30份，羅布麻30份，茯苓30份，桂枝30份，甘草30份，毛冬青30份，地龍30份，牛膝30份，薑黃20份，桃仁20份，蔓刑子20份，黃芪20份，路路通20份，人參20份，黃苓20份，獨活20份，石斛20份，冰片10份，穿山甲10份，血謁10份，水蛭10份，珍珠10份，大黃10份，琥珀10份，麻黃10份，硃砂10份，遠志10份，全蠍10份，麝香10份的中藥原料混合粉碎，過100目篩，製成中藥混合細粉,待用；

2.側耳活化：採用接種環挑取側耳菌絲接於pda固體培養基,在20℃、培養120小時，得到側耳純培養單菌落。

3.將上述活化的側耳接種到步驟1中藥原料中，並在溫度為60℃、溼度為98％條件下發酵7天，得到發酵產物，活化的側耳佔中藥原料質量的10％。

4.將上述發酵產物烘乾、粉碎，過100目篩，所得細粉為中藥微生物發酵製劑。

所述側耳(pleurotussp.)，已於2014年4月14日保藏在「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，保藏編號為cgmccno.9060，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

實施例2

1.按重量份數計，取川穹100份，丹參100份，三七100份，天麻100份，白芷100份，銀杏葉100份，葛根100份，蠶蛹100份，安息香100份，石菖蒲100份，僵蠶60份，鬱金60份，羚羊角60份，人工牛黃60份，羅布麻60份，茯苓60份，桂枝60份，甘草60份，毛冬青60份，地龍60份，牛膝60份，薑黃40份，桃仁40份，蔓刑子40份，黃芪40份，路路通40份，人參40份，黃苓40份，獨活40份，石斛40份，冰片20份，穿山甲20份，血謁20份，水蛭20份，珍珠20份，大黃20份，琥珀20份，麻黃20份，硃砂20份，遠志20份，全蠍20份，麝香20份的中藥原料混合粉碎，過110目篩，製成中藥混合細粉,待用；

2.側耳活化：採用接種環挑取側耳菌絲接於pda固體培養基,在35℃、培養70小時，得到側耳純培養單菌落。

3.將上述活化的側耳接種到步驟1中藥原料中，並在溫度為65℃、溼度為98％條件下發酵5天，得到發酵產物，活化的側耳佔中藥原料質量的5％。

4.上述發酵產物烘乾、粉碎，過100目篩，所得細粉為中藥微生物發酵製劑。

所述側耳(pleurotussp.)，已於2014年4月14日保藏在「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，保藏編號為cgmccno.9060，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

二、臨床前試驗

1.急性毒性試驗(小白鼠最大耐受量)：

觀察本實驗提供的中藥微生物發酵製劑以小白鼠所能接受的最大劑量灌胃給藥產生的毒性反應和死亡情況，測定小白鼠的最大耐受劑量，為臨床用藥的安全性體統動物急性毒性實驗參考。

受試藥物為上述實施例1製備的散劑，將其用蒸餾水配製成37.5％濃度(g/ml)供試驗用。受試動物為昆明種封閉群小白鼠，體重18-22g，由中國醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：遼實條合字1號與遼實質合字008。

(1)取小白鼠20隻，雌雄各半，禁食不禁水17小時，稱體重；

(2)按劑量1ml/20gbw的容積24小時內給藥兩次，間隔8小時，相當每次劑量為18.75g/kg，日累積劑量為37.5g/kg，給藥後常規飼養，觀察7天；

結果受試動物健康，未發現受試動物死亡或由藥物中毒引起的異常變化。即表明本發明提供的製劑小白鼠灌胃給藥的最大耐受量大於或等於37.5g/kg·日，大於或等於臨床承認每日試用量0.2g/kg·日的187.5倍，參照中藥急性毒性實驗要求(中華人民共和國衛生部：新藥審批辦法《有關中藥部分的修訂和補充規定》，1992年9月1日起施行)，臨床試用4g/次，日服2-3次是安全的。

2.小白鼠凝血時間的影響的測定：

受試藥物與受試動物同上，受試藥物用蒸餾水配置成20％濃度(g/ml)供試驗用。

(1)取雄性小白鼠44隻，4禁食不禁水17小時，稱體重，隨機分為4組，每組11隻；

(2)按下表1劑量灌胃給藥，每天一次，連續給藥3天(不超過動物所能接受的最大容積1ml/20g)；

(3)末次給藥後1小時，剪尾尖取血(徐叔雲等，藥理實驗方法字，人民衛生出版社，1982第一版，835)，取血前禁食不禁水17小時，幹棉球拭去第一滴血，再以清潔載玻片取一大滴血液，直徑約5-10mm，立即開始計時，2min後，每隔30s，用潔淨乾燥的針頭，自血滴邊緣向中心輕輕挑動血滴一次，並觀察有無纖維蛋白絲被挑起，直至有纖維蛋白絲被挑起為止，記錄自血液流出至有纖維蛋白絲被挑起的時間為凝血時間。同時取血，常規方法做血小板計數，以各組平均凝血時間和平均血小板數分別以調和平均法和t檢驗法進行統計，比較各組的差異顯著性。

表1中藥微生物發酵製劑對小白鼠凝血時間及血小板數的影響檢測結果

***p＜0.001(與對照組比較)

由上表可見，本發明所提供的中藥微生物發酵製劑能非常明顯地降低血小板數，並有一定延長凝血時間的傾向。目前實驗室多以抗凝血作用和對血小板數目的影響作為防治腦血栓等疾病藥物的輔助藥效學指標，本實施例結果表明，本發明提供的中藥微生物發酵製劑能非常明顯的降低血小板數目，並有一定的抗凝血傾向(延長了凝血時間)。

三、臨床試驗

受試藥物為實施例1製備的散劑，4g/次，每天2次，飯前溫開水衝服，治療期間患者均未使用其他治療手段。受試患者為腦血栓(或多發性，伴隨或不伴隨腦梗塞或腦萎縮)患者200例，患者均不同程度伴隨偏癱(半身不遂)、四肢麻木、語言障礙、頭痛、頭暈、眼花、耳鳴、失眠、反應遲鈍、應激差、記憶力減退、高血壓等症狀。

臨床療效：按下述臨床療效判斷標準，200例患者中，153例患者治癒，其中150例患者2月內治癒，另外3例患者3-4月治癒；顯效41例，有效2例，無效4例；治癒率76.5％，有效率98.0％，且用藥過程中和回訪中均未發現明顯副作用、無復發。

血栓臨床療效判斷標準：①臨床治癒：臨床症狀消失，功能活動恢復正常；②顯效：臨床症狀明顯好轉；③有效：臨床症狀部分好轉；④無效：臨床症狀體徵無改變。

四、典型病例

病例1

高某，女，農民，患腦血栓，半身不遂，伴隨頭痛頭暈耳鳴，四肢麻木等症，服藥四個月後頭痛頭暈、四肢麻木、半身不遂症狀消失，血栓消失，一年未復發。

病例2

李某，女，58歲，小學教師，患有腦動脈硬化，腦血栓，伴隨頭痛、頭暈眼花、記憶力減退、反應遲鈍，用藥三個月後血栓消失，頭痛、頭暈眼花症狀消失，記憶力有所提高，大腦思維活動能力明顯好轉，能夠正常工作。

病例3

孫某，男，60歲，工人，多發性腦血栓，腦萎縮，腦梗塞，伴隨頭痛、頭暈、失眠，大腦應激差，半身不遂，口眼歪斜，用藥2個月後複診精神狀態良好，自感精力充沛，睡眠得到改善，頭痛頭暈症狀消失，血栓、萎縮消失，連續服藥3個月後，大腦應激明顯改善，病症基本消失，可以做到生活自理。