快速誘導繁殖偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織的方法與流程

2023-10-09 03:50:09 2

本發明涉及一種植物愈傷組織誘導及培養的方法，尤其是一種偏穗鵝觀草無毒條件下種子消毒及快速誘導繁殖其無菌實生苗下胚軸愈傷組織的方法。

背景技術：

愈傷組織的培養是植物組織培養過程中的一個重要階段，愈傷組織是幼嫩的薄壁細胞，具有潛在的分化能力，可以進一步分化形成完整植株，通過愈傷的培養也可獲得不同性質的愈傷組織，可為原生質體的分離，融合或遺傳轉化提供優質材料。偏穗鵝觀草(Roegneria komarovii(Nevski)Nevski)為禾本科鵝觀草屬多年生草本植物，原產於中國，除新疆、青海、西藏外，分布遍及全國。多生長在海拔100-2300米的山坡和溼潤草地。此種植物可作牲畜的飼料，葉質柔軟而繁盛，產草量大，可食性高。目前對無毒條件下進行種子消毒並快速誘導偏穗鵝觀草無菌實生苗下胚軸愈傷組織的相關報導還比較少。當前急需一種以無升汞處理偏穗鵝觀草種子並以其無菌苗下胚軸為外植體誘導愈傷從而使其增殖的方法，通過人工控制環境條件來產生大量的愈傷組織，並進一步培養使其增殖，為偏穗鵝觀草與小麥體細胞雜交做準備，從而將其優良性狀導入小麥，以期為小麥遺傳育種及研究提供中間材料。

技術實現要素：

本發明的目的在於避免現有技術的不足之處而提供一種快速誘導繁殖偏穗鵝觀草無菌實生苗下胚軸愈傷組織的方法，該方法簡單易行，能夠高效快速的獲得大量偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織。

以無菌培養獲得的偏穗鵝觀草下胚軸為外植體，誘導愈傷組織發生，然後繼代培養，使其增殖。

為實現上述目的，本發明採取的技術方案為一種快速誘導繁殖偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織的方法，其主要特點在於步驟如下：

(1)無毒條件下無菌外植體的獲得：將偏穗鵝觀草種子置於50％～55％的濃硫酸中,在條件為28℃～30℃，210r/min～220r/min的搖床裡振蕩0.9～1.2小時做脫皮催芽處理，之後用蒸餾水洗去濃硫酸並置於超淨工作檯，首先用無菌水清洗種子，然後用75％的酒精振蕩衝洗2.5～3.5min，緊接著用無菌水將種子表面的酒精清洗乾淨，再用20％～25％的次氯酸鈉振蕩衝洗14～16min,最後用無菌水將種子表面的次氯酸鈉清洗乾淨，獲得偏穗鵝觀草無菌種子，將滅菌後的種子放置於培養無菌實生苗的培養基中培養10-15d，獲得無菌實生苗的下胚軸幼嫩部分作為誘導愈傷的外植體；

(2)愈傷組織誘導：將步驟(1)獲得的無菌實生苗下胚軸橫切為約0.3-0.5cm長的小段作為誘導愈傷的材料，接種於誘導愈傷組織培養基上培養25-30d，誘導愈傷發生；

(3)愈傷組織增殖培養：將步驟(2)獲得的顏色黃綠，質地疏鬆的愈傷組織切割成直徑為0.1-0.2cm的小塊，然後轉接到誘導愈傷組織增殖培養基中，培養25-30d後繼續轉接到新的誘導愈傷組織增殖培養基中進行繼代增殖，最終獲得顏色黃綠，結構緻密的優良愈傷組織材料。

所述的快速誘導繁殖偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織的方法，其步驟(1)中所述的培養無菌實生苗的培養基為MS營養液、5-7g/L瓊脂、20-30g/L蔗糖、0.05-0.1g肌醇組成，PH＝5.7-5.8；步驟(2)中所述的誘導愈傷組織培養基、步驟(3)中所述的誘導愈傷組織增殖培養基均為MS誘導培養基，其配比為：3.0-5.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，5-7g/L瓊脂，20-30g/L蔗糖，0.05-0.1g肌醇組成，PH＝5.7-5.8。

所述的快速誘導繁殖偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織的方法，所述的步驟(1)中偏穗鵝觀草發芽階段需暗培養，發芽以後階段及步驟(2)、(3)的下胚軸愈傷誘導和愈傷增殖均在連續光照培養，光照強度在1500-20001x之間，溼度60-70％的環境下進行。

所述的快速誘導繁殖偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織的方法，還包括有步驟(3)所述的產生的愈傷組織材料，通過稱量法測定愈傷組織的生長量,其具體步驟為：

1)將盛有MS誘導培養基的錐形瓶放在天平上進行稱量，得到數值a；

2)將1)中稱量過的錐形瓶放入超淨工作檯中進行愈傷組織的轉接，轉接結束後對錐形瓶進行稱量，得到數值b；

3)將轉接後的愈傷組織培養30天後再次對錐形瓶進行稱量，得到數值c；

愈傷組織的生長量為：c-(b-a)。

本發明的有益效果如下：

1.在不用升汞的無毒條件下對偏穗鵝觀草種子進行消毒處理，用50％的濃硫酸對其進行脫皮催芽，繼而用70％的酒精和20％的次氯酸鈉依次處理。

2.以偏穗鵝觀草培養10-15d的無菌實生苗根部為取材對象，保證了材料的無菌，杜絕了由材料帶菌或滅菌不徹底造成的組培汙染，並且此階段其下胚軸部分十分幼嫩。

3.以無菌實生苗下胚軸組織為誘導愈傷的材料，能夠高效地誘導愈傷組織的生成。

4.愈傷的誘導與繼代培養所產生的愈傷組織質嫩，並且也可以通過稱量法測定愈傷組織的生長量。

5.愈傷的誘導與繼代培養所用培養基均以2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)為外源激素，實生苗培養、下胚軸愈傷誘導和愈傷增殖均在同一環境下進行，效果良好。實現了簡單、易行、高效獲得鵝觀草下胚軸愈傷組織的目標。

附圖說明：

圖1.本發明所用的無菌實生苗；

圖2.本發明所剪切的偏穗鵝觀草下胚軸部分；

圖3.本發明下胚軸組織培養28d後所得偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織；

圖4.本發明偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織繼代繁殖後的愈傷組織。

具體實施方式

以下結合實施例對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。下面對本發明的內容進行詳細的說明。

實施例1：一種快速誘導及繁殖偏穗鵝觀草無菌實生苗下胚軸愈傷組織的方法，將偏穗鵝觀草種子置於50％的濃硫酸中在條件為30℃，210r/min的搖床裡振蕩0.9小時做脫皮催芽處理，之後用蒸餾水洗去濃硫酸並置於超淨工作檯，首先用無菌水清洗種子，然後用75％的酒精處理2.5min，緊接著用無菌水將種子表面的酒精清洗乾淨，再用20％的次氯酸鈉處理14min,最後用無菌水將種子表面的次氯酸鈉清洗乾淨，獲得偏穗鵝觀草無菌種子，將滅菌後的種子放置於培養無菌實生苗的培養基中培養10d，培養基為MS營養液+5g/L瓊脂+20g/L蔗糖+0.05g肌醇組成，PH＝5.7。獲得無菌實生苗的下胚軸作為誘導愈傷的外植體；將無菌實生苗下胚軸橫切為約0.3cm的小段作為誘導愈傷的材料，接種於誘導愈傷組織培養基上培養28d，培養基為MS誘導培養基，其配比為：3.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，5g/L瓊脂，20g/L蔗糖，0.05g肌醇組成，PH＝5.7。誘導愈傷的發生，將獲得的顏色黃綠，質地疏鬆的愈傷組織切割成小塊，然後轉接到增殖培養基，培養28d後繼續轉接到新的培養基繼代增殖。誘導愈傷組織及繼代繁殖所用培養基主要由1/2MS營養液4.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)7g/L瓊脂20g/L蔗糖0.1g/L肌醇組成，PH＝5.8，愈傷誘導和愈傷繁殖均為連續光照培養，光照強度在1500-20001x之間，溼度70％的環境下進行。

結果：誘導愈傷率70％，誘導愈傷黃綠色，無褐變；在繼代增殖過程中，愈傷組織生長迅速，最終愈傷組織呈現黃綠色。

實施例2：一種快速誘導及繁殖偏穗鵝觀草無菌實生苗下胚軸愈傷組織的方法，將偏穗鵝觀草種子置於55％的濃硫酸中在條件為28℃，220r/min的搖床裡振蕩1小時做脫皮催芽處理，之後用蒸餾水洗去濃硫酸並置於超淨工作檯，首先用無菌水清洗種子，然後用75％的酒精處理3min，緊接著用無菌水將種子表面的酒精清洗乾淨，再用22％的次氯酸鈉處理15min,最後用無菌水將種子表面的次氯酸鈉清洗乾淨，獲得偏穗鵝觀草無菌種子，將滅菌後的種子放置於培養無菌實生苗的培養基中培養12d，培養基為MS營養液+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖+0.1g肌醇組成，PH＝5.8。獲得無菌實生苗的下胚軸作為誘導愈傷的外植體；將無菌實生苗下胚軸橫切為約0.5cm的小段作為誘導愈傷的材料，接種於誘導愈傷組織培養基上培養30d，培養基為MS誘導培養基，其配比為：5.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，7g/L瓊脂，30g/L蔗糖，0.1g肌醇組成，PH＝5.8。誘導愈傷的發生；將獲得的顏色黃綠，質地疏鬆的愈傷組織切割成小塊，然後轉接到增殖培養基，培養28d後繼續轉接到新的培養基繼代增殖。誘導愈傷組織及繼代繁殖所用培養基主要由MS營養液3.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)7g/L瓊脂25g/L蔗糖0.1g/L肌醇組成，PH＝5.8，愈傷誘導和愈傷繁殖均為連續光照培養，光照強度在1500-20001x之間，溼度60％的環境下進行。

結果：誘導愈傷率70％，誘導愈傷黃綠色，無褐變；在繼代增殖過程中，愈傷組織生長迅速，最終愈傷組織呈現黃綠色。

實施例3：

一種快速誘導及繁殖偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織的方法，將偏穗鵝觀草種子置於52％的濃硫酸中在條件為30℃，210r/min的搖床裡振蕩1.2小時做脫皮催芽處理，之後用蒸餾水洗去濃硫酸並置於超淨工作檯，首先用無菌水清洗種子，然後用75％的酒精處理3.5min，緊接著用無菌水將種子表面的酒精清洗乾淨，再用25％的次氯酸鈉處理16min,最後用無菌水將種子表面的次氯酸鈉清洗乾淨，獲得偏穗鵝觀草無菌種子，將滅菌後的種子放置於培養無菌實生苗的培養基中培養15d，培養基為MS營養液+6g/L瓊脂+25g/L蔗糖+0.08g肌醇組成，PH＝5.8。獲得無菌實生苗的下胚軸作為誘導愈傷的外植體；將無菌實生苗下胚軸橫切為約0.5cm的小段作為誘導愈傷的材料，接種於誘導愈傷組織培養基上培養28d，培養基為MS誘導培養基，其配比為：4.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，6g/L瓊脂，25g/L蔗糖，0.08g肌醇組成，PH＝5.8。誘導愈傷的發生，將獲得的顏色黃綠，質地疏鬆的愈傷組織切割成小塊，然後轉接到增殖培養基，培養28d後繼續轉接到新的培養基繼代增殖。誘導愈傷組織及繼代繁殖所用培養基主要由MS營養液5.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)7g/L瓊脂30g/L蔗糖0.1g/L肌醇組成，PH＝5.8，愈傷誘導和愈傷繁殖均為連續光照培養，光照強度1500-20001x之間，溼度70％的環境下進行。

結果：誘導愈傷率75％，誘導愈傷黃綠色，無褐變；在繼代增殖過程中，愈傷組織生長迅速，最終愈傷組織呈現黃綠色。

實施例4：一種快速誘導繁殖偏穗鵝觀草無菌實生苗下胚軸愈傷組織的方法，還包括有步驟(3)所述的產生的愈傷組織材料，通過稱量法測定愈傷組織的生長量。其具體步驟為：

1)將盛有MS誘導培養基的錐形瓶放在天平上進行稱量，得到數值a；

2)將1)中稱量過的錐形瓶放入超淨工作檯中進行愈傷組織的轉接，轉接結束後對錐形瓶進行稱量，得到數值b；

3)將轉接後的愈傷組織培養30天後再次對錐形瓶進行稱量，得到數值c；

4)愈傷組織的生長量為：c-(b-a)。

試驗例：

在偏穗鵝觀草無菌實生苗下胚軸愈傷組織誘導及增殖過程中，外源誘導激素的選擇與配比對愈傷組織的誘導及增殖起到了關鍵作用，本試驗通過對激素的選擇與配比進行優化，最終確定了最佳的偏穗鵝觀草無菌實生苗下胚軸愈傷組織誘導及其增殖的方法。

1.外源激素種類的選擇

選擇常用誘導愈傷組織的3種外源激素，設置六個處理，分別為處理A(0.1mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA)，處理B(0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)，處理C(1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA)，處理D(5.0mg/L 2,4-D)，處理E(1.0mg/L NAA),處理F(1.0mg/L 6-BA)，其中6-BA是6-苄氨基嘌呤，NAA是萘乙酸，2,4-D是2,4-二氯苯氧乙酸。所用的基礎培養基是MS培養基，30g/L蔗糖，6g/L瓊脂，0.1g/L肌醇，PH＝5.8。將培養15d實生苗的下胚軸組織接種於以上六種不同誘導培養基中，3次重複，每瓶接種8塊，連續光照培養25-30d，觀察誘導愈傷組織情況。結果發現：處理A，B，C，E，F均無愈傷組織產生，且產生白色絮狀物，處理D誘導愈傷率高達70％，且全為黃綠色的愈傷組織。因此，確定2,4-D是最佳的誘導下胚軸愈傷組織的外源激素。

然後選擇使愈傷增殖的3種外源激素，設置六個處理，分別為處理A(0.1mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA)，處理B(0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)，處理C(1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA)，處理D(5.0mg/L 2,4-D)，處理E(1.0mg/L NAA),處理F(1.0mg/L 6-BA)，其中6-BA是6-苄氨基嘌呤，NAA是萘乙酸，2,4-D是2,4二氯苯氧乙酸。所用的基礎培養基是MS培養基，30g/L蔗糖，6g/L瓊脂，0.1g/L肌醇，PH＝5.8。在誘導愈傷培養基上生長25-30d的愈傷組織轉接至以上六種不同激素處理的增殖培養基中，3次重複，每瓶轉接8塊，連續光照培養25-30d，觀察愈傷組織的增殖情況，結果發現：處理A，B，C，E，F愈傷增值不明顯，並隨著培養時間的延長，愈傷組織顏色逐漸變黑；處理D愈傷組織明顯增大，且全為黃綠色的愈傷組織。因此，確定2,4-D是最佳的下胚軸愈傷組織增殖的外源激素。

2.外源激素用量的選擇

通過試驗1優選出適合誘導偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織的外源激素，在此基礎上，繼續對2,4-D用量進行優化，設處理A(3mg/L)、處理B(4mg/L)和處理C(5mg/L)3個梯度，所用基礎培養基是MS培養基，30g/L蔗糖，6g/L瓊脂，0.1g/L肌醇，PH＝5.8。將培養15d實生苗的下胚軸組織接種於以上三種不同誘導培養基中，3次重複，每瓶接種8塊，連續光照培養25-30d，觀察誘導愈傷組織情況。結果發現：處理A，B，C愈傷誘導率依次為50％，70％，75％，處理A的出愈速度較慢、B愈傷組織黃綠，結構鬆軟，處理C愈傷組織黃綠，結構緻密。

然後，在優選出最佳偏穗鵝觀草下胚軸誘導愈傷組織2,4-D用量的基礎上，繼續對下胚軸愈傷組織增殖培養基中2,4-D用量進行優化，設處理A(3mg/L)、處理B(4mg/L)和處理C(5mg/L)3個梯度，所用基礎培養基是MS培養基，30g/L蔗糖，6g/L瓊脂，0.1g/L肌醇，PH＝5.8。在誘導愈傷組織培養基上生長25-30d的愈傷組織轉接至以上三種不同的2,4-D用量的增殖培養基中，3次重複，每瓶轉接8塊，連續光照培養25-30d，觀察愈傷組織的增殖情況，結果發現：處理A愈傷組織生長緩慢，處理B愈傷組織黃綠，結構鬆散，處理C明顯增殖，並且愈傷組織黃綠，結構質密。

綜上所述，故確定外源激素2,4-D是偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織誘導及增殖的最適激素配比，同時5.0mg/L 2,4-D是誘導偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織最適的激素用量，5.0mg/L 2,4-D是偏穗鵝觀草下胚軸愈傷組織增殖的最適激素用量。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。