一種蘭花種子的保存及育苗方法與流程
2023-10-09 03:43:14 1
本發明屬於植物種質資源保藏技術領域，具體涉及一種蘭花種子的保存及育苗方法。
背景技術：
蘭科植物俗稱蘭花，在我國有近2000年的栽培歷史，是園藝花卉中的重要栽培植物。蘭科植物多為珍稀瀕危植物，全世界所有野生蘭科植物均被列人《野生動植物瀕危物種國際貿易公約》的保護範圍，佔該公約應保護植物的90％以上，是植物保護中的「旗艦」類群。歷史上我國的花卉種質資源流失相當嚴重，而且現在仍然在流失，如果不採取切實有效的措施來保護我國蘭花種質資源，將會給我國花卉業帶來巨大損失。
技術實現要素：
本發明的第一個目的是提供一種蘭花種子的保存方法。
本發明的一種蘭花種子的保存方法，包括以下步驟：
採收發育基本成熟而未開裂的蘭花蒴果，消毒，無菌條件下將蒴果內的種子轉移至滅菌的離心管內，蓋上離心管蓋並用透氣膜密封，於4-6℃條件下保存。
優選，所述的蘭花種子的保存方法，包括以下步驟：
採收發育基本成熟而未開裂的蘭花蒴果，消毒，無菌條件下將單個蒴果內的種子全部脫落至無菌濾紙上，再轉移至一個滅菌的1mL離心管內，蓋上離心管蓋並用透氣膜密封，對離心管編號並記錄其中種子的對應信息，於4-6℃條件下保存。
優選，所述的蘭花為五唇蘭(Doritis pulcherrima)、小花萬代蘭(Vanda coerulescens)或鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)。
優選，所述的發育基本成熟而未開裂的蘭花蒴果為授粉後120天以上的未開裂的五唇蘭(Doritis pulcherrima)蒴果、授粉後150天以上的未開裂的小花萬代蘭(Vanda coerulescens)蒴果或授粉後150天以上的未開裂的鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)蒴果。
優選，所述的消毒是將蘭花蒴果在體積分數70％乙醇溶液中浸泡15～30s，再用質量分數0.1％升汞溶液消毒15～20min，無菌水衝洗4～5次，用無菌濾紙吸乾蒴果表面的水分。
本發明的第二個目的是提供一種蘭花種子的保存及育苗方法。
一種蘭花種子的保存及育苗方法，包括以下步驟：
a.保存：採收發育基本成熟而未開裂的蘭花蒴果，消毒，無菌條件下將蒴果內的種子轉移至滅菌的離心管內，蓋上離心管蓋並用透氣膜密封，於4-6℃條件下保存；
b.育苗：將保存的種子取出，室溫下放置至離心管內達到室溫後，用無菌水將種子製作成種子懸浮液，然後取種子懸浮液均勻接種於一次成苗培養基上，一次培養成苗；所述的一次成苗培養基：每升含花寶1號1～2g、花寶2號1～2g、蛋白腖0.5～2g、土豆泥40～80g、香蕉泥50～100g、蘋果泥10～20g、活性碳500～1000mg、肌醇80～120mg、甘氨酸1.5～2.5mg、鹽酸硫胺素(VB1)0.05～0.2mg、鹽酸吡哆醇(VB6)0.4～0.8mg、煙酸0.4～0.8mg、6-苄基嘌呤0.05～0.1mg、萘乙酸(NAA)0.2～2mg、蔗糖15～30g和瓊脂6～7g，pH 5.4-5.6。
優選，所述的蘭花為五唇蘭(Doritis pulcherrima)、小花萬代蘭(Vanda coerulescens)或鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)。
優選，所述的發育基本成熟而未開裂的蘭花蒴果為授粉後120天以上的未開裂的五唇蘭(Doritis pulcherrima)蒴果、授粉後150天以上的未開裂的小花萬代蘭(Vanda coerulescens)蒴果或授粉後150天以上的未開裂的鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)蒴果。
優選，所述的消毒是將蘭花蒴果在體積分數70％乙醇溶液中浸泡15～30s，再用質量分數0.1％升汞溶液消毒15～20min，無菌水衝洗4～5次，用無菌濾紙吸乾蒴果表面的水分。
優選，所述的種子懸浮液的濃度為10-15粒種子/mL無菌水，所述的種子懸浮液的接種量為20-30粒種子/150mL一次成苗培養基。經本方法存放的種子不需再經表面消毒處理，採用非共生萌發技術進行無菌播種，可迅速得到種苗。
本發明將蘭花種子在4-6℃條件下貯存5年後，種子發芽率雖然有下降，但仍然保持較高的萌發率(75.2％)，該保存方法可以作為蘭花種質資源保存的一種選擇方案，其優點是所需貯存空間小，設施條件簡單、廉價、無汙染，保存容量巨大，一個25cm*10cm*5cm的塑料盒可以存儲高達數以億粒計的蘭花種子，從目前得到的結果推算保存期可以長達10年以上，是一種高效的蘭花種質資源保存方法。本發明具有貯存空間小，設施條件簡單、廉價、無汙染，保存容量巨大，保存成本低廉等特點，特別是對經濟欠發達的國家和地區來說意義十分重大，可以花費不多、要求不高就能保存在著大量的蘭花種質資源，解決一些經濟欠發達的國家或地區雖種質資源豐富，但又無力建造低溫庫來保存種質資源而導致嚴重丟失的矛盾。
種子保存過程中影響其貯藏壽命的因素土要有兩個，一個是種子含水量，另一個是貯藏溫度。當種子水分高於14％時，微生物在種子的表面和內部繁殖侵染，顯著而迅速地縮短了種子的壽命。本發明採用的具有一定透氣性無菌的塑料離心管低溫存儲蘭花種子，種子在存儲過程中緩慢失水，呼吸代謝水平比較低，保存環境相對溼度較低，加上對種子進行的是無菌保存，減少了微生物對種子活力的破壞，種子無菌的條件下進行緩慢的新陳代謝，保持著較高的生命力，因此大大延長了種子的保存期。本發明的蘭花種子庫建立程序是對蘭花進行人工授粉，果實發育120～180天時，取果實經表面消毒後，無菌條件下將蘭花種子收集在已滅菌的塑料離心管中，不需經過脫水乾燥處理，用透氣膜密封好放置於4-6℃避光保存，即在無菌狀態下透氣保存，可作為蘭花中長期保存方法。
蘭花果實中種子數量巨大，可以利用很小的空間建立其種子庫而進行中長期有效的種質資源保存，這種保存方法具有設備簡單、易操作、成本低等優點，可通過種子庫中存儲的蘭花有活力種子的萌發而達到恢復群體、培養新品種等目的，本發明具有重要的科研價值和應用價值。本發明保存的種子量大，種子輕，佔空間小，1立方空間可存儲8萬個果實。如果一個果為一個種，那就可存儲8萬個種，如果一個果實有10萬粒種子，那可存儲80億粒蘭花種子。本發明的蘭花種子是單果單管保存，保證種子的專一性和純正性。利用本發明方法，可望在蘭花種質資源存儲方法上找到一條簡單、容易操作、成本低廉的途徑，可為有效保存蘭花種質資源、新品種培育、瀕危品種的種苗生產及生態恢復等奠定其物質基礎，從而可為我國蘭花新品種培育及其產業的可持續發展奠定基礎，增強我國在世界花卉產業上的競爭力，並獲得較好的經濟效益和社會效益、生態效益。
具體實施方式
以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
以下實施例中使用的花寶1號、花寶2號為美國HYPONeX化學公司生產、臺灣臺和園藝企業股份有限公司分裝產品。使用的透氣膜是M封口膜(PM-996)，該封口膜產品的厚度均為0.005"(127μm)(4*1.25)，產地美國，從國內相關的設備銷售公司購買。
實施例1：五唇蘭(Doritis pulcherrima)種子的保存及育苗方法
1.人工授粉：五唇蘭於當年8月初開花時，選擇生長健壯植株，於白天上午十時，以滅了菌的牙籤為工具，挑取開放兩天左右的花朵上的有活力花粉塊，將其授於另外一朵開放兩天左右的花朵的柱頭上，共授粉20朵花。授粉後摘除母本的唇瓣後套袋，約1星期後去袋，要掛上標籤，標籤上具有父、母本名稱、雜交日期和授粉人等信息。
2.培育蒴果：成功進行人工授粉後，加強母本植株的肥水管理，保證人工授粉蒴果的正常發育直至成熟。
3.消毒蒴果及製作種子庫：選取果齡為120天的蒴果(此時蒴果發育基本成熟而未開裂)，在體積分數70％乙醇溶液中浸泡15～30s，再用質量分數0.1％升汞溶液消毒15～20min，無菌水衝洗4～5次，於超淨工作檯上無菌條件下用無菌濾紙吸乾蒴果表面的水分。接著用無菌手術刀切開蒴果，將蒴果內的種子全部脫落至無菌濾紙上，再把來自於同一個蒴果的種子集中放置於已經高溫滅菌的1mL的塑料離心管內，蓋上蓋子，再用透氣膜密封離心管。在離心管上標示一個早定的編號，電腦文檔上存儲編號對應清楚該五唇蘭種子的相關信息，再把離心管放置於分屬或分種的塑料盒(25cm*10cm*5cm)內，存儲10個蒴果的種子，此塑料盒裝載的即是五唇蘭的種子庫。
4.低溫保存：將存放了離心管的塑料盒子放置4℃冰箱條件下存儲。
5.無菌播種：將存放冰箱一定時間(5～10年)的五唇蘭種子取出，室溫條件下放置兩個小時至離心管內達到室溫，然後於超淨工作檯上用無菌水將五唇蘭種子製作成種子濃度為10-15粒/mL的接種用的種子懸浮液。無菌條件下用移液槍吸取接種用的種子懸浮液2mL至一次成苗培養基上並使種子均勻分布於該培養基上，每個蘭花培養瓶中裝有150mL該培養基、接種的種子數量20-30粒。經統計，保存5年後的五唇蘭種子萌發率為74.8％。所用的一次成苗培養基：每升含花寶1號1g、花寶2號1g、蛋白腖0.5g、土豆泥40g、香蕉泥50g、蘋果泥10g、活性碳500mg、肌醇80mg、甘氨酸1.5mg、鹽酸硫胺素(VB1)0.05mg、鹽酸吡哆醇(VB6)0.4mg、煙酸0.4mg、6-苄基嘌呤0.05mg、萘乙酸(NAA)0.2mg、蔗糖15g和瓊脂6g，pH 5.4；其配製方法是：將上述各組分混合均勻後，於1.06kg/cm2(121℃)條件下滅菌20min，待培養基冷卻前進行無菌分裝。
6.一次成苗培養：將接種好的五唇蘭種子置於自然光照培養室中(26±2)℃培養，培養6～8個月後一次培養成苗。
實施例2：小花萬代蘭(Vanda coerulescens)種子的保存及育苗方法
1.人工授粉：小花萬代蘭於當年9月初開花時，選擇生長健壯植株，於白天上午十時，以滅了菌的牙籤為工具，挑取開放兩天左右的花朵上的有活力花粉塊，將其授於另外一朵開放兩天左右的花朵的柱頭上，共人工授粉20朵。授粉後摘除母本的唇瓣後套袋，約1星期後去袋，要掛上標籤，標籤上具有父、母本名稱、雜交日期和授粉人等信息。
2.培育蒴果：成功進行人工授粉後，加強母本植株的肥水管理，保證人工授粉蒴果的正常發育直至成熟。
3.消毒蒴果及製作種子庫：選取果齡為150天的蒴果(此時蒴果發育基本成熟而未開裂)，在體積分數70％乙醇溶液中浸泡15～30s，再用質量分數0.1％升汞溶液消毒15～20min，無菌水衝洗4～5次，於超淨工作檯上無菌條件下用無菌濾紙吸乾蒴果表面的水分。接著用無菌手術刀切開蒴果，將蒴果內的種子全部脫落至無菌濾紙上，再把來自於同一個蒴果的種子集中放置於已經高溫滅菌的1mL的塑料離心管內，蓋上蓋子，再用透氣膜密封離心管。在離心管上標示一個早定的編號，電腦文檔上存儲編號對應清楚該小花萬代蘭種子的相關信息，再把離心管放置於分屬或分種的塑料盒(25cm*10cm*5cm)內，存儲10個蒴果的種子，此塑料盒裝載的即是小花萬代蘭的種子庫。
4.低溫保存：將存放了離心管的塑料盒子放置5℃冰箱條件下存儲。
5.無菌播種：將存放冰箱一定時間(5～10年)的小花萬代蘭種子取出，室溫條件下放置兩個小時至離心管內達到室溫，然後於超淨工作檯上用無菌水將小花萬代蘭種子製作成種子濃度為10-15粒/mL的接種用的種子懸浮液。無菌條件下用移液槍吸取接種用的種子懸浮液2mL至一次成苗培養基並使種子均勻分布於該培養基上，每個蘭花培養瓶中裝有150mL該培養基、接種的種子數量20-30粒。經統計，保存5年後的小花萬代蘭種子萌發率為75.2％。所用的一次成苗培養基：每升含花寶1號2g、花寶2號2g、蛋白腖2g、土豆泥80g、香蕉泥100g、蘋果泥20g、活性碳1000mg、肌醇120mg、甘氨酸2.5mg、鹽酸硫胺素(VB1)0.2mg、鹽酸吡哆醇(VB6)0.8mg、煙酸0.8mg、6-苄基嘌呤0.1mg、萘乙酸(NAA)2mg、蔗糖30g和瓊脂7g，pH 5.6；其配製方法是：將上述各組分混合均勻後，於1.06kg/cm2(121℃)條件下滅菌20min，待培養基冷卻前進行無菌分裝。
6.一次成苗培養：將接種好的小花萬代蘭種子置於自然光照培養室中(26±2)℃培養，培養6～8個月後一次培養成苗。
實施例3：鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)種子的保存及育苗方法
1.人工授粉：鐵皮石斛當年3月初開花時，選擇生長健壯植株，於白天上午十時，以滅了菌的牙籤為工具，挑取開放兩天左右的花朵上的有活力花粉塊，將其授於另外一朵開放兩天左右的花朵的柱頭上，共授粉20朵。授粉後摘除母本的唇瓣後套袋，約1星期後去袋，要掛上標籤，標籤上具有父、母本名稱、雜交日期和授粉人等信息。
2.培育蒴果：成功進行人工授粉後，加強母本植株的肥水管理，保證人工授粉蒴果的正常發育直至成熟。
3.消毒蒴果及製作種子庫：選取果齡為150天的蒴果(此時蒴果發育基本成熟而未開裂)，在體積分數70％乙醇溶液中浸泡15～30s，再用質量分數0.1％升汞溶液消毒15～20min，無菌水衝洗4～5次，於超淨工作檯上無菌條件下用無菌濾紙吸乾蒴果表面的水分。接著用無菌手術刀切開蒴果，將蒴果內的種子全部脫落至無菌濾紙上，再把來自於同一個蒴果的種子集中放置於已經高溫滅菌的1mL的塑料離心管內，蓋上蓋子，再用透氣膜密封離心管。在離心管上標示一個早定的編號，電腦文檔上存儲編號對應清楚該鐵皮石斛種子的相關信息，再把離心管放置於分屬或分種的塑料盒(25cm*10cm*5cm)內，存儲10個蒴果的種子，此塑料盒裝載的即是鐵皮石斛的種子庫。
4.低溫保存：將存放了離心管的塑料盒子放置6℃冰箱條件下存儲。
5.無菌播種：將存放冰箱一定時間(5～10年)的鐵皮石斛種子取出，室溫條件下放置兩個小時至離心管內達到室溫，然後於超淨工作檯上用無菌水將鐵皮石斛種子製作成種子濃度為10-15粒/mL的接種用的種子懸浮液。無菌條件下用移液槍吸取接種用的種子懸浮液2mL至一次成苗培養基並使種子均勻分布於該培養基上，每個蘭花培養瓶中裝有150mL該培養基、接種的種子數量20-30粒。經統計，保存5年後的鐵皮石斛種子萌發率為74.3％。所用的一次成苗培養基：每升含花寶1號2g、花寶2號2g、蛋白腖1.5g、土豆泥60g、香蕉泥80g、蘋果泥20g、活性碳800mg、肌醇100mg、甘氨酸2mg、鹽酸硫胺素(VB1)0.2mg、鹽酸吡哆醇(VB6)0.6mg、煙酸0.8mg、6-苄基嘌呤0.1mg、萘乙酸(NAA)2mg、蔗糖25g和瓊脂7g，pH 5.6；其配製方法是：將上述各組分混合均勻後，於1.06kg/cm2(121℃)條件下滅菌20min，待培養基冷卻前進行無菌分裝。
6.一次成苗培養：將接種好的鐵皮石斛種子置於自然光照培養室中(26±2)℃培養，培養6～8個月後一次培養成苗。