胚胎幹細胞用餵食細胞培育培養基及餵食細胞的製作方法
2023-10-09 03:49:29 2
專利名稱：胚胎幹細胞用餵食細胞培育培養基及餵食細胞的製作方法
技術領域：
本發明，系關於包含人類胚胎幹細胞之胚胎幹細胞培養所使用之餵食細胞之培育培養基、利用該培養基之餵食細胞之製造方法、以及藉此製得之胚胎幹細胞用餵食細胞。
背景技術：
胚胎幹細胞，系來自於囊胚中內層細胞群之未分化細胞，具有能分化成全部組織之多樣性，而被期待於細胞培養、組織移植、新藥研究、及基因治療之領域中之應用。再者，亦已獲知可由移植成體之體細胞核所得之複製胚胎，誘導胚胎幹細胞。近年來，將胚胎幹細胞導入以神經組織為首之各種組織之技術已被報告出來，由於由胚胎幹細胞所誘導之組織系無免疫排斥之遺傳性上相等之組織，故可期待其於移植醫療及基因治療之利用。又，亦有報告指出，胚胎幹細胞之培育對象由實驗小動物擴展至包含人類之靈長類，如獼猴胚胎幹細胞之分離、由人類體外受精卵之胚胎幹細胞之分離等。
又，末盛等人，由以往臨床試驗有用之醫學研究中廣泛使用之長尾猴(Macaca fascicularis)之顯微受精卵，成功地培育出新穎之胚胎幹細胞，且證明其多樣性能長期維持，並且，亦證明可由該長尾猴胚胎幹細胞誘導多巴胺神經。
上述之含人類胚胎幹細胞之胚胎幹細胞，為促進其生長，以往系與餵食細胞共同培養。特別是，由於若使用血清培養包含人類之靈長類之胚胎幹細胞，則無法維持未分化狀態，故探討以無血清培養基培養(參照專利文獻1)。
然而，僅以無血清培養基培養無法維持胚胎幹細胞，而為了代替一部分血清之效果，必須與餵食細胞共同培養。該餵食細胞，例如，使用將由鼠之胎兒所調製出之纖維母細胞，以排多癌(Mitomycin-C)或放射線照射而使增殖停止之細胞，故因人類胚胎幹細胞與來自鼠之餵食細胞之共同培養，而有感染人獸共通感染症之虞。由於期待由該人類胚胎幹細胞所誘導之組織，能作為移植醫療及基因治療之材料，故期盼能儘可能的排除獸共通感染症等之疑慮。
因此，亦有報告指出，取代鼠之胎兒而以人類胎兒之纖維母細胞、成人輸卵管上皮細胞(非專利文獻1)、來自人類新生兒之包皮之纖維母細胞(非專利文獻2、3)、成人表皮纖維母細胞(非專利文獻4)、人類骨髓細胞(非專利文獻5)作為餵食細胞利用之方法。
然而，此等大致皆系利用初代細胞，由於為了大量製得胚胎幹細胞而需要來自複數供應源之材料，故需要花費一一檢查每供應源之時間。又，培育此等來自人類之餵食細胞之培養基，由於使用牛胎兒血清(FBS)等之血清，故亦有由該血清傳播未知之感染源或普恩蛋白(prion)之未知病源體的危險性。
專利文獻1國際公開第98/30679號非專利文獻1Nat.Biotechnol.20933-936(2002)非專利文獻2Biol.Reprod.682150-2156(2003)非專利文獻3Hum.Reprod.181404-1409(2003)非專利文獻4Stem.Cells.21546-556(2003)非專利文獻5Stem.Cells.21131-142(2003)發明內容本發明之課題，系提供一種胚胎幹細胞用餵食細胞培育培養基(以下，稱為餵食細胞培育培養基)，系將培養包含人類胚胎幹細胞之胚胎幹細胞所使用之餵食細胞，由特定供體之材料有效率地建立、並能以感染機會少之狀態進行培養。並且，提供一種與含人類胚胎幹細胞之胚胎幹細胞共同培養亦較安全之餵食細胞之製造方法，以及由此方法製得之餵食細胞。
本發明人等，為解決上述問題而持續研究之結果發現，於基本培養基中，由至少含有血清白蛋白及胰島素之胚胎幹細胞用餵食細胞培育培養基，可將含有選自由胚胎幹細胞之餵食細胞所得之胎兒表皮纖維母細胞、胎兒肌肉纖維母細胞、胎兒肺纖維母細胞、胎兒上皮細胞、胎兒內皮細胞、成體表皮纖維母細胞、成體肺纖維母細胞、成體上皮細胞、成體內皮細胞中之至少1種細胞種源之細胞集團安定地進行增殖，而完成本發明。
亦即，本發明系以下所述者1.一種胚胎幹細胞用餵食細胞培育培養基，其含有血清白蛋白、胰島素及基本培養基，該血清白蛋白之量為2g/L～50g/L，該胰島素之量為1mg/L～100mg/L，而該基本培養基系由選自MEM、α-MEM、DMEM、IMDM、Ham F10、Ham F12、Medium199、RPMI1640、RITC 80-7、MCDB104、MCDB105、MCDB153、MCDB201及MCDB202中之至少一種所構成。
2.如上述1所記載之培養基，其中，進一步含有細胞黏連因子。
3.如上述2所記載之培養基，其中該細胞黏連因子，系選自膠原(collagen)、明膠(gelatine)、纖維結合素結合蛋白(fibronectin)、粘連蛋白(Vitronectin)、層粘連蛋白(laminin)、聚離胺酸(polylysine)、聚鳥胺酸(polyornithine)、及聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine)中之至少1種。
4.如上述1、2或3所記載之培養基，其中，進一步含有細胞增殖因子。
5.如上述4所記載之培養基，其中，該細胞增殖因子，系選自纖維母細胞增殖因子及上皮細胞增殖因子中之至少一種。
6.一種胚胎幹細胞用餵食細胞之製造方法，其包括培養增殖步驟，將含有選自胎兒表皮纖維母細胞、胎兒肌肉纖維母細胞、胎兒肺纖維母細胞、胎兒上皮細胞、胎兒內皮細胞、成體表皮纖維母細胞、成體肺纖維母細胞、成體上皮細胞、成體內皮細胞中之至少1種細胞種源之細胞集團，以上述1～5任一項記載之胚胎幹細胞用餵食細胞培育培養基進行培養增殖；及停止增殖步驟，將該培養增殖之細胞集團，以排多癌或放射線照射而使增殖停止。
7.如上述6所記載之製造方法，其中該培養增殖步驟，繫於以細胞黏連因子塗布之培養容器中進行。
8.如上述7所記載之製造方法，其中該細胞黏連因子，系選自膠原、明膠、纖維結合素結合蛋白、粘連蛋白、層粘連蛋白、聚離胺酸、聚鳥胺酸、及聚乙烯亞胺中之至少1種。
9.如上述6、7或8所記載之製造方法，於該培養增殖步驟中，使培養細胞平均細胞分裂20次以上。
10.一種胚胎幹細胞用餵食細胞，系由上述6～9之任一項記載之製造方法所製得。
藉由本發明之餵食細胞培育培養基，即使與含人類胚胎幹細胞之胚胎幹細胞共同培養，亦可建立較安全之餵食細胞，而能長期培養。餵食細胞之材料，由於系來自例如胎兒表皮纖維母細胞、胎兒肌肉纖維母細胞、胎兒肺纖維母細胞、胎兒上皮細胞、胎兒內皮細胞、成體表皮纖維母細胞、成體肺纖維母細胞、成體上皮細胞、成體內皮細胞等特定之供體，故對於長期培養之可能性系有用。藉此，可將含人類胚胎幹細胞之胚胎幹細胞與餵食細胞共同培養，於作為移植或基因治療等材料之胚胎幹細胞使用時，可提供人畜共通感染症疑慮少之胚胎幹細胞。
圖1，系顯示以實施例2所培育之餵食細胞培養之長尾猴胚胎幹細胞之第10天之群落(40倍)之圖。
圖2，系顯示以實施例2所培育之餵食細胞培養之長尾猴胚胎幹細胞繼代後之第4天之群落(100倍)之圖。
圖3，系顯示以實施例2所培育之餵食細胞培養之長尾猴胚胎幹細胞之增殖之圖。
圖4，系顯示以實施例2所培育之餵食細胞培養之長尾猴胚胎幹細胞繼代後之第4天之群落其SSEA-4免疫染色相片(100倍)之圖。
圖5，系顯示以實施例3所培育之餵食細胞培養之長尾猴胚胎幹細胞之第10天之群落(40倍)之圖。
圖6，系顯示以實施例3所培育之餵食細胞培養之長尾猴胚胎幹細胞繼代後之第4天之群落(100倍)之圖。
圖7，系顯示以實施例3所培育之餵食細胞培養之長尾猴胚胎幹細胞之增殖之圖。
圖8，系顯示實施例4中組合塗布明膠與餵食細胞培育培養基(B)進行培養時之MRC-5之增殖之圖。記載有培養開始時之PDL、與以之後繼代培養時之細胞數測定所算出之培養結束時之PDL。
圖9，系顯示實施例5中組合塗布膠原與餵食細胞培育培養基(B)進行培養時之MRC-5之增殖之圖。記載有培養開始時之PDL、與以之後繼代培養時之細胞數測定所算出之培養結束時之PDL。
具體實施例方式
本發明所使用之基本培養基，可單獨使用選自MEM、α-MEM、DMEM、IMDM、Ham F10、Ham F12、Medium199、RPMI1640、RITC 80-7、MCDB104、MCDB105、MCDB153、MCDB201、MCDB202，及/或亦可組合複數使用，而以利用於纖維母細胞之無血清培養基之DMEM、IMDM、Ham F10、Ham F12、RITC 80-7、MCDB104、MCDB105、MCDB201、MCDB202為佳，而利用於靈長類胚胎幹細胞之無血清培養中之DMEM∶Ham F12為1∶1之混合培養基，由培養基之營養價值、餵食細胞培育後之與胚胎幹細胞共同培養之生存率之觀點考慮則較佳。
再者，本發明所利用之基本培養基之詳細組成，系根據表1所記載之出處。
表1基本培養基之出處
本發明所使用之餵時細胞培育培養基，系含有血清白蛋白及胰島素作為必須成分。該培養基亦可再含有其它成分。然而，其它成分若含有牛胎兒血清(FBS)等未知成分或夾雜物，因感染症等之疑慮高，故為不宜。
作為其它成分，有該基本培養基中未含有之成分、或該基本培養基中已含有但量不足夠之成分。具體而言，例如，細胞黏連因子、細胞增殖因子、運鐵蛋白等含有金屬之蛋白質、其它之聚及蛋白質、胺基酸類、維他命類等。將此等成分配合於基本培養基中，以製造餵食細胞培育培養基。又，亦可將市售之稱為血清代替物者配合於基本培養基中，來製造餵食細胞培育培養基。該血清代替物，通常系含有血清白蛋白及胰島素，且含有如上所述之其它成分。因此，可於基本培養基中，將血清代替物以配合目的之量使用適當量之血清白蛋白及胰島素。作為血清代替物，例如，於上述專利文獻1所記載血清代替物。
本發明之餵食細胞培育培養基中，以含有細胞黏連因子作為其它成分為佳。又，以含有細胞增殖因子為佳。再者，以含有運鐵蛋白等含金屬之蛋白質為佳。作為細胞黏連因子，以選自膠原、明膠、纖維結合素結合蛋白、粘連蛋白、層粘連蛋白、聚離胺酸、聚鳥胺酸、及聚乙烯亞胺中之至少1種為佳，特別是以膠原、明膠、纖維結合素結合蛋白、粘連蛋白等為更佳。作為細胞增殖因子，以選自纖維母細胞增殖因子(FGF)、及上皮細胞增殖因子(EGF)中之至少1種為佳。
本發明之餵食細胞培育培養基中，必須含有血清白蛋白2g/L～50g/L及胰島素1mg/L～100mg/L之比例。更佳之血清白蛋白的量為4g/L～25g/L、胰島素的量為5mg/L～30mg/L。
再者，細胞黏連因子以含有0.3mg/L～50mg/L左右為佳。惟於後述之將細胞黏連因子塗布於培養容器內面使用之場合，於餵食細胞培育培養基中不一定須配合細胞黏連因子。細胞增殖因子，於餵食細胞培育培養基中，以含有0.01μg/L～100μg/L之比例為佳，特別是含有纖維母細胞增殖因子0.1μg/L～10μg/L為佳、含有上皮細胞增殖因子0.5μg/L～50μg/L為佳。運鐵蛋白等含有金屬之蛋白質，以含有1mg/L～50mg/L之比例為佳。
本發明之用以建立胚胎幹細胞用餵食細胞可使用之細胞，例如，可選自胎兒表皮纖維母細胞、胎兒肌肉纖維母細胞、胎兒肺纖維母細胞、胎兒上皮細胞、胎兒內皮細胞、成體表皮纖維母細胞、成體肺纖維母細胞、成體上皮細胞、成體內皮細胞中之至少1種。將含有所選擇之細胞種別之細胞集團，於含有本發明之餵時細胞培育用培養基之培養容器內，以3％～10％之CO2、溫度35℃～40℃之條件下，培養1日～30日，可使其增殖。使上述之細胞集團增殖後，以排多癌或放射線照射使細胞之增殖停止，藉此製得大量之餵食細胞。
如上所述，藉由含有細胞增殖步驟、及增殖停止步驟之製造方法，可於無血清培養下進行育成，而製造大致無動物感染之安全的胚胎幹細胞用餵食細胞。該細胞增殖步驟，可於細胞培養容器中事先以細胞黏連因子塗布。該細胞增殖步驟中，藉由使培養細胞平均細胞分裂20次以上，可大量製造餵食細胞。
實施例以下，說明本發明之實施例及比較例，但本實施例系顯示以輔助本發明之再現為目的之其中一實施樣態，並無法以本實施例作為本發明之界限或限制事項。又，以下之實施例等中，餵食細胞，系使用以含有牛胎兒血清(FBS)增殖之株化人類細胞。此系由於直接由人體得到人類細胞作為實驗材料極為困難，而成為將已提供為研究用之株化人類細胞使用於實驗之狀況。
實施例1以添加FBS 10v/v％之MEM培養基，培養至41.77PDL(populationdoubling level，細胞集團倍增值(日本組織培養學會編「組織培養之技術」第3版(基礎編)1996年p42))，將由細胞庫分讓之人類正常2倍肺纖維母細胞株(MRC-5)，使用以下之餵食細胞培育培養基(A)使細胞數懸濁成2.4×106cells，而於塗布明膠之培養皿上，以1次之繼代培養培養至42.99PDL。
餵食細胞培育培養基(A)之組成添加牛血清白蛋白(BSA)5g/L、EGF 10μg/L、胰島素1mg/L、皮質醇(hydrocortisone)1mg/L之RITC80-7培養基。
接著，將上述培養之MRC-5，使用含有最終濃度為10μg/mL之排多癌(Mitomycin-C，MMC)之餵食細胞培育培養基(A)，培養2～3小時，使細胞分裂惰性化。之後，除去含有MMC之餵食細胞培育培養基(A)，將細胞以磷酸緩衝溶液(PBS)洗淨3次。將洗淨後之細胞，藉由胰蛋白酶處理(0.25w/v％胰蛋白酶、1mM EDTA)由培養皿剝離，計算細胞數。其結果，可製得約5.5×106cells之餵食細胞。
實施例2將由與實施例1相同之細胞庫分讓之MRC-5，使用以下之餵食細胞培育培養基(B)使細胞數懸濁成2.1×105cells，而於塗布明膠之培養皿上，進行4次之繼代培養培養至53.47PDL。
接著，將上述培養之MRC-5，使用含有最終濃度為10μg/mL之MMC之餵食細胞培育培養基(B)，培養2～3小時，使細胞分裂惰性化。之後，除去含有MMC之餵食細胞培育培養基(B)，以PBS將細胞洗淨3次製成餵食細胞。將該餵食細胞，於塗布明膠之直徑60mm培養皿上，以每1枚約4×105個之活細胞數接種附著。
餵食細胞培育培養基(B)之組成添加有含白蛋白83g/L及胰島素100mg/L之血清代替物(Knock outSerum Replacement，印皮多露建公司(專利文獻1))20v/v％、MEM非必須胺基酸溶液(印皮多露建公司)1v/v％、丙酮酸鈉1mmol/L、L-麩醯胺2mmol/L、2-乙基硫醇(mercaptoethanol)0.1mmol/L、EGF 10μg/L、及FGF 1μg/L之DMEM∶Ham＝1∶1之混合培養基。
將冷凍保存之長尾猴胚胎幹細胞解凍後，將以下述之長尾猴胚胎幹細胞用培養基(A)使活細胞數懸濁成約2×105cells/ml之濃度後者，接種至已附著前述餵食細胞之培養皿。於5％CO2、37℃之培養箱內，每日進行長尾猴胚胎幹細胞用培養基(A)之交換進行培養，至長尾猴胚胎幹細胞之群落成長至可繼代培養為止(10天)。
長尾猴胚胎幹細胞用培養基(A)之組成添加有含白蛋白83g/L及胰島素100mg/L之血清代替物(專利文獻1)20v/v％、MEM非必須胺基酸溶液(印皮多露建公司)1v/v％、丙酮酸鈉1mmol/L、L-麩醯胺2mmol/L、2-乙基硫醇0.1mmol/L之DMEM∶Ham＝1∶1之混合培養基。
將上述培養之長尾猴胚胎幹細胞群落，藉由胰蛋白酶處理(0.25w/v％胰蛋白酶)由培養皿分離。將部分培養皿中之細胞再接種至含有新餵食細胞之培養皿中，之後以相同條件繼續培養4天，將剩餘培養皿中細胞由培養皿剝離，計算細胞數。
將繼代之胚胎幹細胞群落培養結束後，將部分培養皿中之細胞與上述同樣地由培養皿剝離，計算細胞數。培養皿中剩餘之細胞，以4w/v％聚甲醛固定後，以FITC標記之SSEA-4抗體(聖克魯斯公司)免疫染色，再以螢光顯微鏡以BP460-490nm、BA515nm進行觀察。
其結果，長尾猴胚胎幹細胞群落之形態，繼代時或培養結束時之任一者，皆與以來自鼠胎兒纖維母細胞之餵食細胞培養者相等(圖1、圖2)，長尾猴胚胎幹細胞系已增殖(圖3)。又，培養結束時之免疫染色中，觀察到為靈長類胚胎幹細胞標誌(marker)之一之SSEA-4之螢光(圖4)，故證明系靈長類胚胎幹細胞之群落。
藉此，說明了以本發明方法培育之由MRC-5培養之餵食細胞，可進行胚胎幹細胞之培養。
實施例3將由與實施例1相同之細胞庫分讓之MRC-5，使用餵食細胞培育培養基(B)使細胞數懸濁成2.4×106cells，而於塗布明膠之培養皿上，進行4次之繼代培養培養至53.68PDL。接著，將上述培養之MRC-5，使用含有最終濃度為10μg/mL之MMC之餵食細胞培育培養基(B)，培養2～3小時，使細胞分裂惰性化。之後，除去含有MMC之餵食細胞培育培養基(B)，以PBS將細胞洗淨3次製成餵食細胞。
將該餵食細胞，於塗布明膠之直徑60mm培養皿上，以每1枚約4×105個之活細胞數接種附著。於已附著前述餵食細胞之培養皿，將冷凍保存之長尾猴胚胎幹細胞解凍後，以長尾猴胚胎幹細胞用培養基(A)使活細胞數懸濁成約2×105cells/ml之濃度進行接種。於5％CO2、37℃之培養箱內，每日進行長尾猴胚胎幹細胞用培養基(A)之交換進行培養，至長尾猴胚胎幹細胞之群落成長至可繼代培養為止(10天)。藉由胰蛋白酶處理(0.25w/v％胰蛋白酶)，將胚胎幹細胞群落分離，並將部分培養皿中之細胞再接種至含有新餵食細胞之培養皿中，之後以相同條件繼續培養4天，將剩餘之培養皿中細胞由培養皿剝離，計算細胞數。
將繼代之胚胎幹細胞群落培養結束後，將細胞由培養皿剝離，計算細胞數。其結果，長尾猴胚胎幹細胞群落之形態，繼代時或培養結束時之任一者，皆與以鼠餵食細胞培養者相等(圖5、圖6)，細胞系已增殖(圖7)。
藉此，與實施例2相同，說明了使用塗布明膠之培養皿，則藉由製成之由MRC-5培養之餵食細胞，可進行胚胎幹細胞之培養。
實施例4將由與實施例1相同之細胞庫分讓之MRC-5，使用餵食細胞培育培養基(B)使細胞數懸濁成2.1×105cells，而於塗布明膠之培養皿上，反覆進行繼代培養至增殖情況變差為止，以無血清培養調查增殖界限。其結果，由本發明培養基之餵食細胞作成之纖維母細胞，由41.77PDL起亦可增殖至4次之繼代培養，並確認可分裂成約53PDL(圖8)。
藉此，說明了由1種之細胞株可培育相當量之餵食細胞。
實施例5將由與實施例1相同之細胞庫分讓之MRC-5，使用餵食細胞培育培養基(B)使細胞數懸濁成2.1×105cells，而於塗布膠原之培養皿上，反覆進行繼代培養至增殖情況變差為止，以無血清培養調查增殖界限。
其結果，由本發明培養基之餵食細胞所得之纖維母細胞，由41.77PDL起亦可增殖至7次之繼代培養，並確認可將纖維母細胞分裂成接近有限分裂細胞之界限之約60PDL(圖9)。
藉此，說明了藉由將本發明之培養基與塗布膠原組合，可培育更多之餵食細胞。
實施例6以添加FBS 10v/v％之MEM培養基，將由細胞庫分讓之人類正常2倍肺纖維母細胞株(TIG-3)培養至28.76PDL，使用餵食細胞培育培養基(B)，使細胞數懸濁成1.8×105cells，而於塗布膠原之培養皿上，以2次之繼代培養培養至35.51PDL。
接著，以含有最終濃度為10μg/mL之MMC之餵食細胞培育培養基(B)，培養2～3小時，使細胞分裂惰性化。之後，除去含有MMC之培養基，將細胞以PBS洗淨3次。藉由胰蛋白酶處理(0.25w/v％胰蛋白酶、1mM EDTA)，將洗淨後之細胞由培養皿剝離，計算細胞數。其結果，可製得約2.1×107cells之餵食細胞。
藉此，說明了藉由本發明之培養基，亦可由MRC-5以外之纖維母細胞株，培育大量之餵食細胞。
比較例1將由與實施例1相同之細胞庫分讓之MRC-5，改變成使用添加了FGF1μg/L、胰島素5mg/L且不含血清白蛋白之MCDB202初代纖維母細胞用培養基(以下稱「FGM」，Cambrex公司)，懸濁成2.2×105cells，於塗布明膠之培養皿上，進行1次之繼代培養。然而，繼代後細胞之增殖停止，且無法進行MMC處理，而難以培育餵食細胞。
比較例2將由與實施例1相同之細胞庫分讓之MRC-5，使用FGM懸濁成2.2×105cells，於塗布明膠之培養皿上，進行1次之繼代培養。然而與比較例1相同，繼代後細胞之增殖停止，且無法進行MMC處理，而難以培育餵食細胞。
藉由本發明，可以來自動物之感染疑慮少之無血清培養基，生產含人類胚胎幹細胞之胚胎幹細胞所使用之餵食細胞。再者，藉由與明膠及膠原等細胞黏連因子組合，可長時間培養，故可將來自特定供體之材料作極致利用，而能將因改變餵食細胞供應源而產生之混入感染源之危險降至非常低。又，根據實施例，確認本發明可利用複數之細胞株，故可利用於多種類之來自動物之胚胎幹細胞所適合之各種餵食細胞之培育。
權利要求
1.一種胚胎幹細胞用餵食細胞培育培養基，其含有血清白蛋白、胰島素及基本培養基；該血清白蛋白之量為2g/L～50g/L，該胰島素之量為1mg/L～100mg/L，而該基本培養基系由選自MEM、α-MEM、DMEM、IMDM、Ham F10、Ham F12、Medium199、RPMI1640、RITC 80-7、MCDB104、MCDB105、MCDB153、MCDB201及MCDB202中之至少一種所構成。
2.如申請專利範圍第1項之培養基，其中，進一步含有細胞黏連因子。
3.如申請專利範圍第2項之培養基，其中該細胞黏連因子，系選自膠原、明膠、纖維結合素結合蛋白、粘連蛋白、層粘連蛋白、聚離胺酸、聚鳥胺酸、及聚乙烯亞胺中之至少1種。
4.如申請專利範圍第1、第2或第3項之培養基，其中，進一步含有細胞增殖因子。
5.如申請專利範圍第4項之培養基，其中該細胞增殖因子，系選自纖維母細胞增殖因子及上皮細胞增殖因子中之至少一種。
6.一種胚胎幹細胞用餵食細胞之製造方法，其包含培養增殖步驟，將含有選自胎兒表皮纖維母細胞、胎兒肌肉纖維母細胞、胎兒肺纖維母細胞、胎兒上皮細胞、胎兒內皮細胞、成體表皮纖維母細胞、成體肺纖維母細胞、成體上皮細胞、成體內皮細胞中之至少1種細胞種源之細胞集團，以申請專利範圍第1～第5項中任一項之胚胎幹細胞用餵食細胞培育培養基進行培養增殖；及停止增殖步驟，將該培養增殖之細胞集團，以排多癌(Mitomycin-C)或放射線照射而使增殖停止。
7.如申請專利範圍第6項之製造方法，其中該培養增殖步驟，繫於塗布細胞黏連因子之培養容器中進行。
8.如申請專利範圍第7項之製造方法，其中該細胞黏連因子，系選自膠原、明膠、纖維結合素結合蛋白、粘連蛋白、層粘連蛋白、聚離胺酸、聚鳥胺酸、及聚乙烯亞胺中之至少1種。
9.如申請專利範圍第6、第7或第8項之製造方法，於該培養增殖步驟中，使培養細胞平均細胞分裂20次以上。
10.一種胚胎幹細胞用餵食細胞，其特徵在於，系由申請專利範圍第6～第9項中任一項之製造方法所製得。
全文摘要
本發明系提供一種胚胎幹細胞用餵食細胞培育培養基，系將培養包含人類胚胎幹細胞之胚胎幹細胞所使用之餵食細胞，由來自特定供體之材料有效率地建立、並能以感染機會少之狀態進行培養。並且，提供一種與包含人類胚胎幹細胞之胚胎幹細胞共同培養亦較安全之餵食細胞之製造方法，以及由此方法製得之餵食細胞。於基本培養基中，由至少含有血清白蛋白及胰島素之胚胎幹細胞用餵食細胞培育培養基，將含有選自由胚胎幹細胞之餵食細胞所得之胎兒表皮纖維母細胞、胎兒肌肉纖維母細胞、胎兒肺纖維母細胞、胎兒上皮細胞、胎兒內皮細胞、成體表皮纖維母細胞、成體肺纖維母細胞、成體上皮細胞、成體內皮細胞中之至少1種細胞種源之細胞集團安定地進行增殖。
文檔編號A61K48/00GK1914313SQ20058000379
公開日2007年2月14日 申請日期2005年2月10日 優先權日2004年2月13日
發明者中辻憲夫, 末盛博文, 淺香勳, 菅井晴美, 岡本玲子 申請人:旭科技玻璃股份有限公司, 田邊製藥股份有限公司, 瑞伯喜爾有限公司