病毒性疾病的預防和治療的製作方法

2023-12-11 23:52:02 2

專利名稱：病毒性疾病的預防和治療的製作方法
技術領域：
本發明由分別抗FRMS和親和標記的病毒包膜蛋白的單克隆抗體構成，它是得到政府支持的發明，國立衛生研究院基金支助號為R01AI44669-01和R21 AI44312-02。因此，政府對本發明擁有一定權益。
本申請要求對1998年8月3日提交的美國臨時專利申請第60/095,105號和1999年6月29日提交的美國臨時專利申請第60/141,806號的優先權，通過引用將這兩個專利整體結合到本文中。
1．前言本發明涉及令人驚奇的發現，即可構建為免疫系統提供過渡的融合相關決定簇的高效疫苗，該高效疫苗可產生能夠有效中和來自世界各地和不同系統發育病毒進化枝的各種各樣初級分離株的獨特抗體。本發明涉及產生融合相關分子結構(Fusion-Related Molecular Structure,FRMS)，該分子結構含有一個或多個融合相關決定簇。本發明還涉及這樣的發現對各種不同初級分離株的廣泛而均等的中和作用表明，FRMS提供的關鍵決定簇是高度保守的，而且在結合和融合時緊密依賴於包膜蛋白的基本功能。本發明提供形成、分離和純化FRMS的方法以及在各種組合物和方法中應用這種FRMS，包括例如用作疫苗免疫原、診斷試劑和治療藥物。
本發明涉及能夠觸發抗病毒致病原和初級病毒分離株的中和抗體的FRMS。針對所述FRMS產生的抗體可用來研究關於病毒和宿主細胞融合的分子途徑以及用來鑑定抗體介導的阻斷對所述途徑的可能作用位點。本發明還涉及將本發明抗體用作抗病毒劑、血液製品添加劑、避孕藥添加劑、接觸後治療或胎兒免疫中的被動免疫。
2．發明背景不能將本文中的文獻引用解釋為承認這樣的文獻對本發明而言是先有技術。
病毒是在人類、動物、細菌和植物引起許多疾病的感染原，因此其在醫學和工業上非常重要。概括地說，稱為病毒體的游離病毒顆粒由基因組(可以為RNA或DNA)、相關蛋白或聚醯胺以及稱為衣殼的蛋白質外殼組成。某些病毒體還由膜性包膜包圍。衣殼和包膜結構用來保護基因組免被環境中存在的核酸酶作用，而且用來促進病毒粘附以及進入其感染並在其中複製的細胞內。
2.1．病毒進入病毒必須利用宿主細胞的生物合成器才能複製。病毒利用動物細胞合成途徑和可利用的底物維持並繁殖其自身的遺傳信息。為了接近細胞生物器，病毒必須進入或感染細胞。在宿主細胞膜上存在的一種或多種病毒受體蛋白促進病毒進入。病毒蛋白與這些受體結合引發一系列複雜的過程，通過這些變化病毒核酸或核蛋白釋放入細胞中。
如果是包膜病毒，則病毒包膜與細胞膜如細胞表面膜或內膜融合有助於感染。各種各樣的包膜病毒與人類和動物疾病有關。
2.2．HIV一個臨床上重要的包膜病毒的實例是HIV。人類免疫缺陷病毒(HIV)是稱為獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)的慢性退行性免疫系統疾病(Barre-Sinoussi,F.等，1983,Science 220:868-870；Gallo,R等，1984,Science 224:500-503)。HIV主要在人類CD4+T淋巴細胞群中複製，HIV感染導致缺乏這種細胞類型，最終導致免疫機能不全、機會感染、神經功能紊亂、腫瘤生長以致最終死亡。至少存在兩種不同類型的HIV，包括HIV-1(Barre-Sinorssi,F.等，1983,Science 220:868-870；Gallo,R.等，1984,Science 224:500-503)和HIV-2(Clavel,F.等，1986,Science 233:343-346；Guyader,M.等，1987,Nature 326:662-669)。另外，在每種HIV類型的群體中存在明顯的遺傳異質性。
HIV是逆轉錄病毒科的慢病毒類成員(Teich,N.等，1984,RNATumor Viruses,Weiss,R.等編輯，CSH-Press，第949-956頁)。逆轉錄病毒是小包膜病毒，它含有單鏈RNA基因組而且通過病毒編碼的逆轉錄酶即依賴RNA的DNA聚合酶產生的DNA中間體複製(Varmus,H.,1988,Science 240:1427-1439)。
HIV病毒顆粒含有病毒核心(部分由衣殼蛋白組成)和病毒RNA基因組和早期複製過程需要的酶。肉豆蔻化gag蛋白圍繞病毒核心構成外殼，它又由得自感染細胞膜的脂質膜包膜包裹。HIV包膜表面糖蛋白以單一160kD前體蛋白合成，前體蛋白在病毒出芽期間被細胞蛋白酶裂解為兩種糖蛋白gp41和gp120。gp41是跨膜糖蛋白，gp120是胞外糖蛋白，它可能以三聚型或多聚型與gp41非共價結合(Hammarskjold,M.等，1989,Biochem.Biophys.Acta 989:269-280)。
HIV靶向CD4+細胞，因為CD4細胞膜蛋白(CD4)起HIV-1病毒的細胞受體的作用(Dalgleish,A.等，1984,Nature 312:763-767；Klatzmann等，1984,Nature 312:767-768；Maddon等，1986,Cell47:333-348)。病毒進入細胞取決於gp120結合細胞CD4受體分子(McDougal,J.S.等，1986,Science 231:382-385；Maddon,P.J.等，1986,Cell 47:333-348)，這可以解釋HIV的CD4+細胞趨向性。
病毒包膜蛋白和細胞受體相互作用時，包膜蛋白-CD4複合物發生構象變化，促進隨後與宿主細胞共同受體相互作用形成三分子複合物。三分子複合物進一步發生構象變化使得匯合的細胞膜和病毒包膜融合，從而釋放病毒遺傳物質入細胞中。
2.3．病毒治療策略2.3.1．藥物治療儘管對有效治療藥物的設計進行了巨大的努力，但是目前仍然沒有針對AIDS的治癒性抗逆轉錄病毒藥物。對於開發這樣的藥物的努力集中在HIV生活周期的幾個階段(Mitsuya,H.等，1991,FASEB J.5:2369-2381)。已經提出了許多幹擾HIV生活周期的病毒靶，因為普遍的觀點認為幹擾宿主細胞蛋白具有有害的副作用。例如病毒編碼的逆轉錄酶已成為藥物開發的一個焦點。已經開發了許多針對逆轉錄酶的藥物，包括2』,3』-雙脫氧核苷類似物如AZT、ddI、ddC和d4T，已證明這些藥物是抗HIV有效的藥物(Mitsuya,H.等，1991,Science249:1533-1544)。
對HIV-1的新治療方案證實，針對逆轉錄酶(RT)的抗HIV化合物(如疊氮胸苷(AZT)、拉米夫啶(3TC)、雙脫氧肌苷(ddI)、雙脫氧胞苷(ddC))與HIV-1蛋白酶抑制劑聯合使用對降低病毒負荷量的作用(降低2-3個對數)遠遠高於單獨使用AZT的治療(約降低1個對數)。例如最近聯合使用AZT、ddI、3TC和ritonavir獲得更好的結果(Perelson,A.S.等，1996,Science 15:1582-1586)。但是，長期聯合使用這些化學藥物可產生毒性尤其是骨髓毒性。長期細胞毒性療法也可能通過殺傷細胞活性(Blazevic,V.等，1995,AIDS Res.Hum.Retroviruses 11:1335-1342)和釋放抑制因子(值得注意的是趨化因子Rantes、MIP-1α和MIP-1β(Cocchi,F.等，1995,Science 270:1811-1815))抑制CD8+T細胞，而CD8+T細胞是控制HIV必須的。對長期化學抗逆轉錄病毒療法的另一個主要擔心是發生部分或完全抗性的HIV突變(Lange,J.M.,1995,AIDS Res.Hum.Retroviruses 10:S77-82)。據認為，這種突變是抗病毒療法的必然結果。因為治療而導致野生型病毒消失和出現突變病毒以及CD4+T細胞數同時減少，此現象有力提示，至少對於某些化合物，出現病毒突變體是AIDS治療失敗的潛在因素。
此外，常規藥物的失敗也可能是因為在生長緩慢的細胞群存在HIV儲主，所述儲至處於潛伏狀態而不會活躍產生病毒，因此逃避了許多常規治療。
人們還對開發可抑制病毒進入細胞的藥物進行努力。迄今這些研究的焦點集中在HIV細胞表面受體CD4。例如已經證明重組可溶CD4可抑制某些HIV-1病毒株感染CD4+T細胞(Smith,D.H.等，1987,Science 238:1704-1707)。但是一些初級HIV-1分離株對重組CD4的抑制較不敏感(Daar,E.等，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6574-6579)。另外，重組可溶CD4臨床試驗沒有獲得結論性結果(Schooley,R.等，1990,Ann.Int.Med.112:247-253；Kahn,J.O.等，1990,Ann.Int.Med.112:254-261；Yarchoan,R.等，1989,Proc.Vth Int.Conf onAIDS，第564頁，MCP 137)。
還提出涉及某些病毒編碼蛋白的重要病毒特異性過程的晚期HIV複製為可能的抗HIV藥物靶。晚期過程依賴於病毒蛋白酶活性，因此開發抑制該蛋白酶的藥物(Erickson,J.,1990,Science 249:527-533)。
新近發現，CD8+T細胞產生的趨化因子參與抑制HIV感染(Paul,W.E.,1994,Cell 82:177；Bolognesi,D.P.,1993,Semin.Immunol.5:203)。證明CD8+T細胞分泌的趨化因子RANTES、MIP-1α和MIP-1β抑制HIV-1或HIV-2分離株體外感染細胞產生的HIV-1 p24抗原(Cocchi,F等，1995,Science 270:1811-1815)。因此證實這些以及其它趨化因子在HIV感染治療中可能有用。但是所有這些趨化因子和其它候選藥物的臨床結果仍然在討論中。
2.3.2．疫苗另一個抗病毒治療和預防的重要策略是開發疫苗。因為病毒感染如HIV具有潛在世界流行性，所以極其需要有效的疫苗。
一般而言，傳統的製備疫苗的方法包括應用失活或減毒病原體。致病微生物的適當失活使得它成為無害生物因子但是並沒有破壞其免疫原性。將這些「殺滅的」顆粒注射入宿主體內可引發能夠預防以後的活微生物感染的免疫應答。但是使用殺滅的疫苗(應用失活的病原體)的一個主要擔心是不能使所有微生物顆粒全部失活。即使完全殺滅了所有微生物，因為殺滅的病原體不會在其宿主內複製或因為其它未知的原因，獲得的免疫通常是不完全的短期有效，而需要多次免疫接種。最後，所述失活過程可能改變所述微生物的抗原，使得其作為免疫原的有效性降低。
減毒作用是指產生基本喪失其致病力的致病微生物株。達到此目的的一個途徑是使所述微生物處於異常生長條件下和/或以細胞培養物頻繁傳代。然後選擇喪失毒力但是仍然能夠引發免疫應答的突變體。減毒的病原體通常形成良好的免疫原，因為它們真正在宿主細胞內複製而觸髮長期持續的免疫。但是，使用活疫苗遇到幾個問題，最麻煩的是減毒不完全和毒力逆轉的危險。
上述方法的替代方法是應用亞單位疫苗。包括只用含有相關免疫物質的組分免疫接種。
例如如果是HIV，已經證實包膜蛋白(gp160、gp120、gp41)是在AIDS患者體內存在的抗HIV抗體的主要抗原(Barin等，1985,Science 228:1094-1096)。所以，這些蛋白是迄今用作抗HIV疫苗開發的免疫原的最常見的候選物。已有幾個研究小組開始將gp160、gp120和/或gp41的不同部分用作宿主免疫系統的免疫原性靶。參見例如Ivanoff,L.等，美國專利第5,141,867號；Saith,G.等，WO 92/22,654；Shafferman,A.,WO 91/09,872；Formoso,C.等，WO 90/07,119。
因為HIV包膜蛋白介導感染早期結合和進入步驟，所以許多疫苗策略集中於阻斷病毒包膜糖蛋白的功能。1993年，在國立衛生研究院(NIH)主持的大規模效能研究中率先將兩種重組型HIV包膜蛋白表面gp120亞單位(rgp120)用作候選疫苗。在以前的臨床研究中，已經證明這些rgp120疫苗是安全的而且引發的抗體能夠有效中和相關實驗室採用的HIV分離株(Belshe,R.B.等，1994,Journal of the AmericanMedical Association 272:475；Kahn,J.O.等，1994,Journal ofInfectious Diseases 170:1288)。但是其進一步發展陷入困境，原因是發現大部分初級分離株(「PI」)病毒難以被rgp120疫苗血清中和(Cohen,J.,1993,Science 262:980；Cohen,J.,1994,Science 264:1839)。
2.4．需要對初級分離株的中和作用到2000年，UNAIDS報告(www.unaids.org/unaids/report)HIV感染的擴大流行在世界範圍內可能感染超過4千萬人。迫切需要有效的HIV疫苗，但是向該目標的進展卻因為任何一種疫苗候選物都不能引發產生能夠中和各種HIV感染個體的初級分離株(PI)感染性的抗體而受阻(Wrin,T.等，1995,Journal of Virology 69:39；Moore,J.P.等，1995,AIDS 9(增刊A),S117；Mascola,J.R.等，1996,Journal of InfectiousDisease 173:340)。
遺憾的是，研究人員迄今仍然沒有成功製成可產生封閉各種各樣初級HIV分離株的抗體的疫苗。初級分離株直接取自感染患者，並使其於實驗室在初級外周血淋巴細胞(PB ls)中進行僅有的有限生長。所以，初級HIV分離株較實驗室使用的病毒株更接近臨床。實驗室使用的病毒株是在實驗室建立T細胞系中持續生長的病毒株(參見Wrin等，1995,J.of Virology 69:39)。以前的疫苗候選物觸發產生抗實驗室使用的病毒株的中和抗體。例如Wrin等，1995,Journal of Virology69:39，測試了用重組DNA技術由實驗室使用的分離株產生的HIV包膜蛋白。用這些重組蛋白免疫接種產生的抗體只中和實驗室使用的HIV病毒分離株。用來原位產生天然寡聚包膜蛋白的重組病毒載體和DNA也不能觸發產生抗初級分離株的中和抗體。此外，重組技術產生的包含gp120和可溶CD4受體的免疫原觸發產生抗gp120的抗體(Gershoni,1993,FASEB Journal 7:1185)，但是這些抗體不能中和初級分離株。
中和抗體對防止病毒和宿主細胞結合以及融合是重要的。分析了中和實驗室使用的分離株的抗體作用。中和抗體直接特異性針對gp120上的CD4結合域，幹擾CD4結合。但是大多數中和抗體幹擾CD4結合後的步驟。例如某些中和抗體抑制與共同受體的相互作用(Trkola等，1998,Journal of Virology 72:1876；Wu等,1996,Nature 384:179-83)。
必須鑑定在宿主觸發產生中和抗體的免疫原，以開發有效的疫苗。中和抗體必須不僅作用於實驗室使用的分離株，而且也作用於臨床相關的初級分離株。據以上可知，仍然需要產生有效中和各種各樣的初級分離株的抗體的新免疫原分子。
3．發明概述本發明基於以下令人驚奇的發現可構建為免疫系統提供過渡融合相關決定簇的高效疫苗，該高效疫苗可產生能夠有效中和來自世界各地和不同系統發育病毒進化枝的廣泛包膜病毒初級分離株的獨特抗體。本發明疫苗含有作為免疫原的包含一個或多個融合相關決定簇的融合相關分子結構(FRMS)。本發明還基於這樣的發現對各種不同初級分離株的廣泛而均等的中和作用表明，FRMS提供的關鍵決定簇是高度保守的，而且在結合和融合時緊密依賴於包膜蛋白的基本作用。本發明提供在各種組合物和方法中應用這種FRMS，包括例如用作疫苗免疫原、血液製品添加劑、抗病毒劑、診斷試劑和治療藥物。
本發明涉及能夠觸發產生抗包膜病毒病原體的中和抗體的FRMS。觸發產生這類中和抗體的表位產生自在病毒包膜與宿主細胞膜結合和融合過程中的構象變化。
在一個實施方案中，病毒蛋白與至少一種宿主細胞受體或共同受體相互作用產生所述複合物，而且通過共培養用表達病毒蛋白的核酸轉化的細胞和表達宿主細胞受體的細胞也可以產生。最好是所述細胞重組表達宿主細胞受體。在又一實施方案中，在發生細胞與細胞相互作用時固定培養物以保存可融合免疫原。在一個優選方案中，因為主要人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)包膜蛋白、宿主細胞受體CD4和宿主細胞共同受體CCR5相互作用而製得融合相關免疫原。
用本主題發明的FRMS作免疫原接種產生針對病毒病原體的免疫應答並在接種宿主觸發產生中和抗體。除了採用FRMS作為疫苗之外，針對FRMS的抗體可用來研究關於病毒和宿主細胞融合的分子途徑以及鑑定抗體介導的阻斷對所述分子途徑的可能作用位點。另外，特異性高親和力「標記」可表達為包膜蛋白或宿主細胞受體的一部分，它有助於分離和純化本發明的FRMS。
本發明還涉及開發由這些FRMS免疫原激發產生的單克隆抗體(mAb)。提供能夠中和初級分離株的單克隆抗體。抗功能性保守的融合依賴性表位的中和mAb也可用於在接觸後治療或胎兒免疫中的被動免疫接種。
本發明提供包含因為(a)包膜病毒包膜蛋白與(b)一種或多種細胞膜蛋白結合形成的表位的分離分子結構，所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在合適的條件下必須並足以融合所述病毒包膜與含有所述細胞膜蛋白的細胞膜。
本發明提供包含因為(a)裝配入HIV包膜的HIV包膜蛋白或其突變體與(b)人CD4和HIV融合的共同受體結合形成的表位的分離分子結構。在一個實施方案中，共同受體是趨化因子受體CCR5或CXCR4。在另一個實施方案中，通過結合融合缺陷的HIV gp41突變體形成所述分子結構。在另一個實施方案中，所述突變體包含一個或多個選自V2E、G10V、V570R和Y586E的突變。在又一實施方案中，所述分子結構通過結合野生型HIV包膜蛋白而形成。
本發明提供包含因為(a)包膜病毒的突變包膜蛋白和(b)一種或多種宿主細胞膜蛋白結合形成的表位的分離分子結構，所述包膜蛋白為野生型時在病毒包膜與宿主細胞膜融合時起作用，而所述突變包膜蛋白是融合缺陷的，所述宿主細胞膜蛋白起所述包膜蛋白受體的作用。
在一個實施方案中，所述病毒屬於選自以下的病毒科逆轉錄病毒科(Retroviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、日冕形病毒科、線狀病毒科(Filoviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、本揚病毒科、黃病毒科(Flaviviridae)、披蓋病毒科(Togaviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)和皰疹病毒科(Herpesviridae)。在另一個實施方案中，所述包膜蛋白是HCV E1和HCVE2，而細胞膜蛋白是CD81。在另一個實施方案中，所述分子結構是交聯的細胞分子結構。在再一實施方案中，所述分子結構從細胞裂解物分離獲得。在一個實施方案中，所述細胞分子結構包括重組表達所述包膜蛋白的細胞。在又一實施方案中，所述細胞裂解物得自多種包括重組表達所述包膜蛋白的細胞在內的細胞。在又一實施方案中，所述細胞分子結構還包括重組表達一種或多種宿主細胞膜蛋白的細胞。
本發明提供重組包膜病毒，其中所述病毒在其包膜上重組表達所述病毒的天然包膜蛋白的細胞受體。在一個實施方案中，所述細胞受體是人CD4或HIV的共同受體，或者所述病毒既重組表達人CD4又重組表達所述共同受體。在另一實施方案中，所述合適條件包括降低pH。在另一實施方案中，所述交聯的細胞分子結構還包括含所述包膜蛋白的所述病毒的交聯病毒顆粒。
本發明提供含免疫原量的所述分子結構和藥學上可接受的載體的疫苗製劑。
本發明提供抗所述分子結構的單克隆抗體。在一個實施方案中，所述抗體是標記抗體。
本發明提供對所述分子結構特異性的純化多克隆抗血清。
本發明提供含有抑制或減輕所述病毒感染的有效量抗體的避孕的膠凍、泡沫狀物、乳膏或軟膏。
本發明提供含有抑制或減輕HIV感染有效量抗體的避孕的膠凍、泡沫狀物、乳膏或軟膏。
本發明提供含有抑制或減輕HIV感染有效量抗血清的避孕的膠凍、泡沫狀物、乳膏或軟膏。
本發明提供哺乳動物血液樣品，該血液樣品中加有抑制或減輕所述病毒感染有效量抗體。
本發明提供人類血液樣品，該血液樣品中加有抑制或減輕HIV感染有效量抗體。在一個實施方案中，所述包膜蛋白或宿主細胞膜蛋白還含有親和標記物。在另一實施方案中，所述包膜蛋白CD4或共同受體還含有親和標記物。在又一實施方案中，所述抗體是標記抗體。
本發明提供在一個或多個容器中含有抗所述分子結構的標記單克隆抗體的試劑盒。
本發明提供在一個或多個容器中含有抗所述分子結構的標記單克隆抗體的試劑盒。在一個實施方案中，所述試劑盒在另外的容器中含有所述分子結構。
本發明提供重組表達在病毒包膜與宿主細胞膜融合時起作用的包膜病毒包膜蛋白或融合缺陷型的突變型所述包膜蛋白的細胞系，該細胞系表達一種或多種起所述包膜蛋白受體作用的細胞膜蛋白。在一個實施方案中，重組表達起受體作用的所述一種或多種蛋白。
本發明提供重組表達HIV gp160的細胞系，該細胞系表達CD4和HIV共同受體；所述細胞系缺乏切割gp160產生gp120和gp41的功能性蛋白酶。
本發明提供治療或預防患者病毒感染的方法，該方法包括給予所述患者有效治療或預防病毒感染的免疫原量的所述分子結構。在一個實施方案中，所述患者是人類。在另一實施方案中，所述患者是家畜。
本發明提供在人類治療或預防HIV感染的方法，該方法包括給予所述人類個體有效治療或預防HIV感染的免疫原量的所述分子結構。
本發明提供治療或預防患者病毒感染的方法，該方法包括給予所述患者治療或預防病毒感染的有效量的所述單克隆抗體。
本發明提供治療或預防人類HIV感染的方法，該方法包括給予所述人類個體治療或預防HIV感染有效量的所述單克隆抗體。在一個實施方案中，所述人類個體的HIV感染風險高。在一個實施方案中，所述方法用於治療所述人類AIDS患者。
本發明提供治療或預防人類胎兒HIV感染的方法，該方法包括給予懷有所述胎兒的孕婦治療或預防所述胎兒HIV感染有效量的所述單克隆抗體。
本發明提供抑制血液樣品病毒感染的方法，該方法包括使所述血液樣品與抑制所述病毒感染有效量的所述單克隆抗體接觸。
本發明提供抑制人類血液樣品HIV感染的方法，該方法包括使所述人類血液樣品與抑制HIV感染有效量的所述單克隆抗體接觸。
本發明提供淨化外科或牙科工具的方法，該方法包括使所述工具與抑制所述病毒感染有效量的所述單克隆抗體接觸。
本發明提供淨化外科或牙科工具的方法，該方法包括使所述工具與抑制HIV感染有效量的所述單克隆抗體接觸。
本發明提供在預先給予了一定量所述分子結構的對象監測抗所述分子結構抗體產生的方法，該方法包括從所述對象分離包括血清在內的標本；以及檢測所述血清中存在的抗所述分子結構的任何抗體。在一個實施方案中，用一種方法進行所述檢測，該方法包括用抗所述分子結構的標記抗體進行競爭性免疫分析。
本發明提供產生用於治療或預防病毒感染的疫苗的免疫原的方法，該方法包括以下描述的順序步驟(a)使包膜病毒的包膜蛋白(該包膜蛋白在所述病毒包膜與細胞膜融合時起作用)或其嵌合型、或者融合缺陷型的所述包膜蛋白的突變型或其嵌合型與起所述包膜蛋白受體作用的一種或多種細胞蛋白或其嵌合型接觸；(b)使所述包膜蛋白或其嵌合型或者突變型或其嵌合型和所述一種或多種宿主細胞蛋白或其嵌合型暴露於交聯劑；和(c)分離含有所述包膜蛋白或其嵌合型或者突變型或其嵌合型的交聯結構。
本發明提供產生用於治療或預防HIV感染的疫苗的免疫原的方法，該方法包括以下描述的順序步驟(a)共培養重組表達HIV包膜蛋白或其嵌合型、或者融合缺陷型的所述包膜蛋白的突變型或其嵌合型的第一種細胞與表達(ⅰ)人CD4或其嵌合型和(ⅱ)HIV共同受體或其嵌合型的第二種細胞；(b)使所述包膜蛋白或其嵌合型、或者突變型或其嵌合型和所述CD4或其嵌合型和共同受體或其嵌合型暴露於交聯劑；和(c)分離含有所述包膜蛋白或其嵌合型或者突變型或其嵌合型的交聯結構。在一個實施方案中，所述病毒是HIV，所述宿主細胞蛋白是人CD4和HIV共同受體。在一個實施方案中，所述第二種細胞重組表達CD4、或者所述共同受體、或者既表達CD4又表達所述共同受體或任何前述嵌合型。
在另一實施方案中，所述第一種和第二種細胞是相同細胞類型。在又一實施方案中，所述包膜蛋白或其嵌合型、或者突變型或其嵌合型存在於病毒顆粒或病毒樣顆粒上。在再一實施方案中，所述交聯結構是交聯的細胞複合物。
在另一實施方案中，所述病毒選自逆轉錄病毒科、彈狀病毒科、日冕形病毒科、線狀病毒科、痘病毒科、本揚病毒科、黃病毒科、披蓋病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科和皰疹病毒科。
在另一實施方案中，所述接觸步驟通過用表達所述包膜蛋白或其嵌合型、或突變型或其嵌合型的所述病毒感染表達所述宿主細胞蛋白的細胞進行。在另一實施方案中，嵌合型所述包膜蛋白或所述宿主細胞蛋白中的一種被接觸，所述嵌合型含有親和標記物。在另一實施方案中，嵌合型所述包膜蛋白或CD4或所述共同受體被接觸，所述嵌合型含有親和標記物。
本發明提供產生用於治療或預防HIV感染的疫苗的免疫原的方法，該方法包括以下描述的順序步驟(a)共培養重組表達HIV包膜蛋白或其嵌合型、或者融合缺陷型的所述包膜蛋白的突變型或其嵌合型的第一種細胞與表達(ⅰ)人CD4或其嵌合型和(ⅱ)HIV共同受體或其嵌合型的第二種細胞，其中表達至少一種包含親和標記物的所述嵌合型；(b)在非變性條件下裂解所述共培養細胞形成細胞裂解物；和(c)從所述細胞裂解物分離含有所述包膜蛋白或其嵌合型或者突變型或其嵌合型的分子結構，應用的方法包括使所述細胞裂解物與所述親和標記物的結合配偶體接觸，並回收結合於所述親和標記物的分子結構。
本發明提供為所述方法製品的交聯結構。
本發明提供抗所述結構的單克隆抗體，其中所述抗體體外中和以下初級HIV分離株92US657、92US660、92RW023、93IN101、92UG035和92TH023。
本發明提供含有抑制或減輕HIV感染的劑量的所述抗體的避孕的膠凍、泡沫狀物、乳膏或軟膏。
本發明提供治療或預防對象病毒感染的方法，該方法包括給予所述對象有效治療或預防所述病毒感染的免疫原量的所述結構。
本發明提供治療或預防人類HIV感染的方法，該方法包括給予所述人類個體有效治療或預防HIV感染的免疫原量的所述分子結構。
本發明提供淨化外科或牙科工具的方法，該方法包括使所述工具與抑制HIV感染有效量的所述單克隆抗體接觸。
本發明提供淨化外科或牙科工具的方法，該方法包括使所述工具與抑制所述病毒感染有效量的所述單克隆抗體接觸。
本發明提供篩選具有疫苗功效的分子結構的方法，該方法包括用所述分子結構免疫人類以外的轉基因哺乳動物，其中所述人類以外的轉基因哺乳動物由一種或多種轉基因表達人CD4和HIV共同受體，然後檢測所述哺乳動物產生的任何中和HIV的抗體。
本發明提供篩選具有疫苗功效的分子結構的方法，該方法包括用所述分子結構免疫人類以外的轉基因哺乳動物，其中所述人類以外的轉基因哺乳動物由一種或多種轉基因表達所述一種或多種宿主細胞膜蛋白；然後檢測所述哺乳動物產生的任何中和所述病毒的抗體。在一個實施方案中，所述哺乳動物為小鼠。在另一實施方案中，所述第一種細胞重組表達HIV包膜蛋白或其嵌合型。
4．附圖簡述

圖1．FC和FI疫苗血清對同源168P PI病毒的中和作用。用FC免疫原(COS-env和U87-CD4-CCR5；方框；n=3隻小鼠)或用細胞對照(單獨的U87-CD4-CCR5細胞或與模擬轉染的COS細胞共培養的U87-CD4-CCR5細胞；圓形；n=3隻小鼠)免疫轉基因小鼠(hu CD4+,hu CCR5+，小鼠CD4+)。同樣使用未免疫的小鼠(三角形；n=2小鼠)。用表達CXCR4(黑色符號)或CCR5(白色符號)的U87-CD4細胞測試血清對168P的中和作用。數據為用第二次和第三次免疫接種後2周獲得的血清進行3-6次中和測定的平均值。
圖2A-B．FC而不是FI疫苗血清對P168具有中和作用。(A)用FC免疫原(黑色方框；n=4)、FI免疫原(COS-env和U87細胞，灰色圓形，n=4；COS-env和U87-CD4細胞，灰色菱形，n=3；COS-env和sCD4，白色菱形，n=2；COS-env和U87-CD4-CCR5細胞，在混合用於免疫接種前分別固定每一種細胞，灰色方框，n=2)或模擬轉染的cos細胞免疫原(與U87-CD4-CCR5細胞共培養，白色圓形，n=2)免疫轉基因小鼠。同樣使用未免疫的小鼠(白色三角形，n=2)。中和作用與特異性的共同受體的使用無關，此處的數據為用U87-CD4-CXCR4或-CCR5細胞的3-6次中和測定的平均值。在某些情況下，合併每個試驗組所有動物的血清。(B)FC而不是FI疫苗血清對P168具有中和作用。對人PBL(淋巴細胞)培養物中的同源168P PI病毒的中和作用。分離PBL，用植物凝集素進行刺激，在白介素-2存在下進行培養；測定中和作用。培養5天後通過ELISA(Coulter Corporation)測定HIV p24抗原，測定值用病毒對照(36ng/ml)歸一化。星號表示p24抗原水平在ELISA中所用的稀釋度下低於檢測下限。
圖3A-B．FC疫苗血清不中和帶有兼嗜性MLV包膜蛋白的假型HIV病毒體(A)或初級SIVmac251(B)。用U87-CD4-CXCR4細胞測定帶有兼嗜性MLV包膜蛋白的HIV(兼嗜性MLV假型)對合併的FC和FI抗血清的中和敏感性。用U87-CD4-CCR5細胞測定對初級分離株SIVmac251的中和作用。符號為FC免疫原(黑色方框)和FI免疫原(Cos-env+U87細胞；灰色圓形)。
圖4A-B．FI疫苗血清對TCLA 168C病毒的中和作用。用以下合併血清以U87-CD4-CXCR4細胞測試168P PI病毒(A)和其TCLA衍生物168C(B)的中和敏感性FC免疫原(黑色方框)、FI免疫原(COS-env+U87細胞，灰色圓形；COS-env+U87-CD4細胞，灰色菱形；COS-env+sCD4，白色菱形)和模擬轉染的細胞對照(白色圓形)。
圖5．對進化枝A-E的不同PI病毒的中和作用。在人PBL中擴增初級分離株，用以下合併的血清以容許的U87-CD4-CCR5(或-CXCR4)細胞測定中和作用FC免疫原(黑色方框)、FI免疫原(COS-env+U87細胞，灰色圓形；COS-env+U87-CD4，灰色菱形；COS-env+sCD4，白色菱形和模擬轉染的細胞對照(白色圓形)。可獲得的話，病毒生物型在右下角標示為SI或NSI。病毒同種型標示在每個圖的下角。
圖6．甲醛固定的COS-env細胞對PI病毒中和活性的吸附。將FC疫苗血清反覆與甲醛固定的COS-env細胞(灰色方框)或對照COS細胞(白色方框)溫育。對FC免疫接種前獲得的血清進行相似的吸附(分別為灰色圓形和白色圓形)。開始的FC和免疫前的血清分別以黑色方框或黑色圓形表示。用U87-CD4-CXCR4細胞測試血清對168P的中和作用。
圖7．完整的U87-CD4-CCR5細胞不吸附對PI病毒中和活性。將合併的FC疫苗血清與U87-CD4 CCR5細胞(白色方框)或在空白微培養孔(模擬，黑色方框)中溫育。對合併的FI血清(COS-env+U98-CD4)進行相似的處理(分別為白色圓形和黑色圓形)。用U87-CD4-CCR5細胞測試血清對168P的殘餘中和作用。
圖8．雜交瘤上清液對兩種HIV進化枝B初級分離株的中和活性。
圖9．用可融合疫苗免疫原免疫的小鼠的血清滴度。白色方框代表可融合(FRMS)免疫原(env+CD4/CCR5)；黑色圓形代表表達包膜蛋白免疫原的細胞和既不表達CD4也不表達CCR5的細胞的免疫原(env)；白色圓形代表表達包膜蛋白的細胞和表達CD4免疫原的細胞的免疫原(env+CD4)；白色三角形代表表達CD4和CCR5免疫原的細胞對照(CD4/CCR5)。
圖10．得自用本主題發明的可融合免疫原複合物免疫小鼠的抗體對320SI初級病毒分離株的交叉中和作用。黑色圓形代表可融合(FRMS)免疫原(env+CD4/CCR5)；白色方框代表表達包膜蛋白的細胞的免疫原(env)；白色圓形代表表達包膜蛋白和CD4的細胞的免疫原(env+CD4)。
圖11．用蛋白質印跡分析檢測與CD4-Spep和CCR5-Spep共純化的包膜蛋白。a)與表達CD4-Spep的細胞共培養後分離的168P包膜蛋白；b)與表達CD4和CCR5-Spep的細胞共培養後分離的168P包膜蛋白；c)與模擬轉染的細胞共培養後可檢測到的168P包膜蛋白。
圖12．感染後24小時rV-168Penv感染的BSC40細胞和rV-CD4/CCR5感染的BSC40細胞的共培養。
5．發明詳述本發明涉及能夠觸發產生抗包膜病毒病原體的中和抗體的融合相關性分子結構(FRMS)。本發明FRMS含有因為一個或多個細胞分子與一個或多個病毒包膜分子結合形成的表位。病毒包膜與細胞膜融合的過程始於病毒包膜蛋白與宿主細胞上的特異性細胞受體和/或共同受體結合之後，並涉及病毒包膜與表面細胞膜或內細胞膜融合。發生於包膜-受體/共同受體複合物的構象變化驅動融合。儘管不希望受限於具體機制，但是人們認為融合過程中發生的構象變化顯露出用於中和抗體的新而獨特的免疫原性表位。本主題發明的融合相關分子結構模擬融合過程中形成的構象中間體。本發明的FRMS可用於各種目的，包括但不限於在本文的5.5和5.7小節所述的目的。例如在本發明一個優選的實施方案中，當FRMS用來接種宿主動物時，它引發抗所述感染病毒的中和抗體，由此提供本發明疫苗製劑的新型有效組分，用於治療或預防病毒感染及其不良影響。
因此，本發明提供含有因為(a)包膜病毒的包膜蛋白和(b)一種或多種細胞膜蛋白結合形成的表位的分離的分子結構，所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在合適的條件下必須並足以融合所述病毒包膜與含有所述細胞膜蛋白的細胞膜。本文使用的細胞膜蛋白包括細胞表面膜和內膜(包括但不限於內質網膜)的蛋白。這樣的細胞膜蛋白可以是膜內在蛋白(例如跨膜蛋白)、或者可以通過附著脂質(例如脂肪酸鏈或異戊二烯基)或通過寡糖(例如連接於磷脂、磷脂醯肌醇的寡糖)附著於所述細胞膜，或者所述細胞膜蛋白也可以通過非共價作用(例如與膜內在蛋白結合)與所述膜結合。
本發明還提供含有一種表位的分離分子結構，所述表位的形成是因為以下兩種組分的結合(a)包膜病毒的突變包膜蛋白，其野生型包膜蛋白在所述病毒包膜與宿主細胞膜蛋白融合時發揮作用，而其突變包膜蛋白是融合缺陷型；和(b)起所述包膜蛋白受體作用的一種或多種宿主細胞膜蛋白。
在一個具體的實施方案中，本發明提供含有一種表位的分離分子結構，所述表位的形成是因為以下兩種組分的結合(a)裝配入病毒包膜的HIV包膜蛋白或其突變體；和(b)人CD4和HIV融合的共同受體。在一個實施方案中，所述共同受體是趨化因子受體CCR5或CXCR4。在另一具體實施方案中，所述分子結構因為融合缺陷型的HIV gp41突變體的結合而形成。在再一實施方案中，所述突變體含有一種或多種選自V2E、G10V、V570R和Y586E的突變。在另一實施方案中，所述分子結構因為野生型HIV包膜蛋白的結合而形成。在另一具體實施方案中，所述包膜蛋白是黃病毒HCV的E1和E2，而所述細胞膜蛋白是CD81。
本發明還提供產生用於治療或預防病毒感染的疫苗的免疫原的方法，該方法包括以下描述的順序步驟(a)使包膜病毒的包膜蛋白(該包膜蛋白在所述病毒包膜與細胞膜融合時起作用)或其嵌合型、或者融合缺陷型的所述包膜蛋白的突變型或其嵌合型與起所述包膜蛋白受體作用的一種或多種細胞蛋白或其嵌合型接觸；(b)使所述包膜蛋白或其嵌合型、或者突變型或其嵌合型和所述一種或多種宿主細胞蛋白或其嵌合型暴露於交聯劑；和(c)分離含有所述包膜蛋白或其嵌合型、或者突變型或其嵌合型的交聯結構。在一個實施方案中，所述病毒是HIV，所述宿主細胞蛋白是人CD4和HIV共同受體。
在具體的實施方案中，本發明還提供產生用於治療或預防HIV感染的疫苗的免疫原的方法，該方法包括以下描述的順序步驟(a)共培養重組表達HIV包膜蛋白或其嵌合型、或者融合缺陷型的所述包膜蛋白的突變型或其嵌合型的第一種細胞與表達(ⅰ)人CD4或其嵌合型和(ⅱ)HIV共同受體或其嵌合型的第二種細胞；(b)使所述包膜蛋白或其嵌合型、或者突變型或其嵌合型和所述CD4或其嵌合型和共同受體或其嵌合型暴露於交聯劑；和(c)分離含有所述包膜蛋白或其嵌合型或者突變型或其嵌合型的交聯結構。
在一個具體實施方案中，所述第二種細胞重組表達CD4、或者所述共同受體、或者既表達CD4又表達所述共同受體或任何前述嵌合型。在另一具體實施方案中，本發明提供產生用於治療或預防HIV感染的疫苗的免疫原的方法，該方法包括以下描述的順序步驟(a)共培養重組表達HIV包膜蛋白或其嵌合型、或者融合缺陷型的所述包膜蛋白的突變型或其嵌合型的第一種細胞與表達(ⅰ)人CD4或其嵌合型和(ⅱ)HIV共同受體或其嵌合型的第二種細胞，其中至少表達一種含有親和標記物的所述嵌合型；b)在非變性條件下裂解所述共培養細胞形成細胞裂解物；和(c)從所述細胞裂解物分離含有所述包膜蛋白或其嵌合型或者突變型或其嵌合型的分子結構，應用的方法包括使所述細胞裂解物與所述親和標記物的結合配偶體接觸，並回收結合於所述親和標記物的分子結構。
5.1．FRMS的形成本發明涉及含有因為一種或多種病毒包膜分子和一種或多種宿主細胞分子結合形成的表位的FRMS。本發明FRMS包含因為至少一種病毒包膜蛋白和至少一種宿主細胞蛋白結合形成的結構。例如本發明的FRMS可包括可融合複合物(例如在病毒包膜與細胞膜融合過程中形成的複合物)、融合缺陷型複合物(例如融合缺陷型病毒包膜和細胞膜在融合前過程中形成的複合物)以及一種或多種病毒包膜分子與一種或多種細胞受體和/或所述病毒的共同受體結合形成的複合物。如果是HIV，則所述FRMS的產生緣於HIV包膜蛋白與CD4以及趨化因子受體結合。
本發明的FRMS因此含有能夠觸發產生抗所述病毒的中和抗體的表位。
本發明的FRMS可用本文所述的多種方法形成。在一個優選實施方案中，培養表達一種或多種其結合產生FRMS的組分的細胞，以形成FRMS。所有所述組分可表達在一種細胞上，或者第一種組分可表達在一種細胞上，第二種組分可表達在一種不同的細胞上，而第三種組分(如果有的話)可以表達在一種前述細胞上或不同的細胞上。或者，可用其表面含有所述組分的病毒顆粒或假病毒或重組病毒或病毒樣顆粒代替一種所述細胞。所述組分(病毒包膜蛋白、宿主細胞受體和/或任何必須的宿主細胞共同受體)各自可以是內源性的或由所述細胞重組表達。因此，FRMS可通過內源性分子、外源性分子(例如重組表達的分子)或其任何組合的相互作用形成。
在本發明再一實施方案中，包膜病毒的可溶型病毒包膜蛋白用於形成本發明的FRMS。例如在一個實施方案中，所述可溶包膜蛋白可加入體外宿主細胞中，該宿主細胞表達所述病毒的受體。所以，可溶性病毒包膜蛋白和宿主細胞受體結合導致形成FRMS。
在本發明另一實施方案中，一種或多種可溶細胞受體用於形成FRMS。在一個實施方案中，例如可使用其與病毒包膜蛋白結合導致形成FRMS的可溶細胞受體，通過使所述病毒包膜與所述可溶細胞受體接觸形成FRMS。在另一具體實施方案中，其結合導致形成FRMS的所有組分均是可溶型，而所述FRMS是體外重建的FRMS。在該實施方案中，FRMS的重建可任選藉助於加入抗所述FRMS的mAb。
在本發明再一實施方案中，降低pH促進FRMS。例如在某些實施方案中，這種pH介導的細胞融合使得可製備其細胞膜蛋白位於內細胞膜的包膜病毒的FRMS。
5.1.1．複合物組分的內源性表達參與形成特定病毒的FRMS的細胞組分包括所述細胞受體和/或特定病毒的共同受體。在一個具體實施方案中，至少部分所述組分由所述細胞內源性表達。因此，表達FRMS的細胞組分的本領域已知的任何細胞可用於形成FRMS。
可使用表達天然細胞受體和/或病毒蛋白的共同受體的細胞。如本文所述，例如人CD4是本領域已知的HIV細胞受體。在本發明的一個實施方案中，內源性表達CD4的細胞用於形成FRMS。
內源性表達本發明複合物的組分的細胞可含有用來形成所述FRMS的一種或多種所述細胞組分。例如可使用表達FRMS的所有需要細胞組分的細胞，或者可使用不表達所有需要細胞組分的細胞。例如如果是HIV FRMS，既表達CD4又表達HIV共同受體如CCR5的任何細胞可用於形成HIV FRMS。或者在該實施方案中可使用內源性表達CD4但是不內源性表達HIV共同受體的任何細胞，而且如下所討論，非內源性表達的所述複合物組分可導入所述細胞中並重組表達。在該實施方案中，所述複合物的額外細胞組分導入所述細胞中，使得所述細胞既表達內源性細胞組分又表達外源性細胞組分。在本發明的一個具體實施方案中，所述共同受體CXCR4主要位於T細胞系。在本發明另一具體實施方案中，所述共同受體CCR5主要位於巨噬細胞上。在本發明的一個具體實施方案中，所述共同受體CXCR4主要位於T細胞系。在本發明的另一具體實施方案中，所述共同受體CCR5主要位於巨噬細胞上。外源性組分可用本領域已知的任何方法導入所述細胞中，所述方法包括描述於以下5.1.2小節的方法。
在本發明的再一實施方案中，通過病毒基因或基因組整合轉化的細胞可用於形成融合相關複合物，所述轉化細胞表達FRMS的病毒組分。以這種方式，可以認為所述細胞內源性表達對構建FRMS重要的病毒組分。這種病毒轉化細胞也可以內源性表達FRMS的一種或多種細胞組分。或者病毒顆粒可用作內源性表達FRMS的病毒組分的來源。
5.1.2．重組表達對形成FRMS重要的組分對構建FRMS或其片段、類似物或衍生物重要的任何組分均可導入細胞中，使得所述外源性組分在所述細胞中表達。
本發明包括表達系統，既可是真核生物表達載體也可是原核生物表達載體。它們可用來表達對形成本發明的FRMS或其片段、類似物或衍生物重要的組分。
在本發明的其它實施方案中，所述病毒包膜蛋白在宿主細胞中表達。在該實施方案中，外源性病毒包膜蛋白可以通過本文所述的轉染或病毒載體或者通過用含有所述病毒包膜蛋白的活病毒或減毒病毒感染導入所述細胞中。所以，病毒感染在優選實施方案中可使得產生病毒包膜蛋白，修飾所述病毒包膜蛋白(例如通過重組方法)可增強病毒包膜蛋白在所述細胞膜上表達，從而增加其在所述細胞表面或其它細胞膜上表達。例如本領域已知尋靶信號增強細胞蛋白傳遞至特定亞細胞區室或部位。例如內質網信號DKEL(單字母胺基酸編碼)可工程入所述病毒包膜蛋白以在所述病毒感染細胞時，促進所述蛋白靶向內質網。
本發明還提供表達對形成FRMS重要的病毒和細胞組分的細胞。在一個實施方案中，構建一種細胞表達所述細胞受體和/或病毒共同受體，並重組表達所述病毒包膜蛋白。這種細胞可內源性表達所述宿主細胞受體和/或所述病毒共同受體或者重組表達這兩種蛋白的一種或兩種。在重組表達病毒蛋白和細胞蛋白的實施方案中，編碼這類蛋白的核酸可由不同載體或由單一載體(例如一種載體含有有效連接至單一啟動子的多個基因)表達。因此，在該實施方案中，形成FRMS必須的所有組分均表達在單一細胞上。在一個具體的實施方案中，構建一種細胞重組表達CD4、共同受體CCR5或CXCR4和HIV gp160。或者可用gp120和gp41代替gp160。在一個優選的實施方案中，當構建單個細胞表達gp160、cd4和HIV-1共同受體時，也可構建所述病毒包膜蛋白使得它缺乏引起gp160裂解成gp120和gp41的天然蛋白酶位點。在該實施方案中，將一個替代蛋白酶位點構建入所述病毒包膜蛋白中，所述蛋白酶對於所述宿主細胞而言不是自身蛋白酶(如細菌蛋白酶)。通過使所述細胞與所述非自身蛋白酶接觸(例如在所述細胞培養基中加入產生切割有效量的蛋白酶)引發FRMS在表達所述三種蛋白的細胞上形成。各種蛋白酶和蛋白酶位點是本領域已知的，並可按照本發明使用。
可將編碼本發明的病毒包膜蛋白或細胞受體蛋白或其功能活性類似物或片段或其它衍生物的核苷酸序列插入合適的表達載體中，例如含有對插入的蛋白編碼序列轉錄和翻譯和/或實施本發明方法所必須的元件的載體。
本發明包括DNA表達載體和/或病毒載體的應用，所述載體含有FRMS或其類似物、衍生物或片段的組分的編碼序列，該編碼序列與控制所述編碼序列表達的調節元件有效連接；以及本發明包括遺傳工程的宿主細胞，該宿主細胞含有任何上述編碼序列，該編碼序列與控制所述編碼序列在所述宿主細胞中表達的調節元件有效連接。
可用本領域周知的技術通過重組DAN技術產生所述DAN表達載體和病毒載體，所述載體含有編碼對形成本發明FRMS重要的組分的核酸。因此，本文描述了通過表達含有對形成FRMS或其類似物、衍生物或片段重要的組分的編碼序列的核酸，從而製備本發明的表達載體和病毒載體的方法。本領域技術人員周知的方法可用來構建含有基因產物編碼序列和合適轉錄控制信號和翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括例如體外重組DAN技術、合成技術和遺傳重組。參見例如描述於Sambrook等，1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版，Clod Spring Harbor Press,N.Y.，和Ausubel等，1989-1999,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates andWiley Interscience,N.Y.的方法，所述兩個文獻均通過引用整體結合到本文中。或者可用例如寡核苷酸合成儀化學合成基因產物序列。參見例如描述於「Oligonucleotide Synthesis」,1984,Gait,M.J.編輯，IRLPress,Oxford中的技術，該文獻通過引用整體結合到本文中。可用本領域已知的各種方法調節基因表達，包括但不限於在Mizuno,T.等，1984,Proc.Natl.Acad Sci USA.81(7)1966-70中介紹的方法。
可用各種方法如脂質體、電穿孔、轉染、病毒載體和噬菌體等達到將編碼一種或多種導致形成FRMS的組分的核酸或DNA導入細胞中。
在一個實施方案中，編碼一種或多種形成FRMS的重要組分的核酸如下獲得將含有編碼所述組分的核酸的質粒DNA包裝入脂質體中或者使含有編碼所述組分的核酸的質粒DNA和脂質或脂質體複合形成DNA-脂質或DNA-脂質體複合物。陽離子脂質和中性脂質組成的脂質體一般用來體外轉染細胞。陽離子脂質與質粒DNA複合並形成脂質體。
本發明設計了陽離子和中性脂質體。通過混合陽離子脂質體與帶負電荷的生物活性分子(例如DNA)並使其電荷結合從而使所述組分複合。陽離子脂質體特別用於核酸，因為核酸帶負電荷。陽離子脂質體實例包括脂質轉染試劑、脂質轉染胺試劑、lipofectace和DOTAP(Hawley-Nelson等，1992,Focus 15(3):73-83；Felgner等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413；Stewart等，1992,Human GeneTherapy 3:267-275)。也可利用可市售獲得的陽離子脂質體，例如二甲基二(十八烷基)溴化銨(DDAB)、生物降低脂質1,2-二(油醯氧基)-3-(三甲基胺)丙烷(DOTAP)；這些脂質體可與中性脂質混合，例如L-α二油醯基磷脂醯乙胺(DOPE)或膽固醇(Chol)，它們是兩種常用於系統傳遞的中性脂質。可用本領域技術人員使用的方法(參見例如Nicolau等，1987,Methods Enzymol.149-157)優化DNA脂質體比率，而且本領域一般技術人員可容易地將此比率用於本發明以便把本發明的複合物包裹起來。
在本發明的再一實施方案中，編碼所述基因的質粒DNA或編碼一種或多種導致形成本發明的FRMS的組分的核酸可以通過攜帶多個正電荷的聚陽離子分子傳遞，而且它們可用來達到體外、體內和來自體內的基因轉移。聚陽離子如聚乙烯亞胺(pdyethilenimine)可用來實現成功的基因轉移(參見例如Boletta等，1996,J.AM.Soc.Nephrol.7:1728)。
重組病毒可用來傳遞其結合產生FRMS的組分。這些病毒感染的細胞或所述病毒基因組轉化的細胞因此表達所需要的組分。所以，在本發明的另一實施方案中，可工程改造表達本文描述的一種或多種組分的活重組載體或失活重組病毒載體。在這方面，可遺傳工程改造各種病毒用以表達對形成FRMS重要的組分。在某些情況下，可能需要所述重組病毒是冷適用、溫度敏感或減毒的病毒。
按照本發明，種類繁多的病毒和病毒載體可用來傳遞編碼一種或多種對形成本發明的FRMS重要的組分的核苷酸序列，其幾個實例在下文中描述。
逆轉錄病毒載體通常用來將基因傳遞至宿主細胞中。逆轉錄病毒載體是非常有效的基因傳遞媒介，因為它們進入所述細胞中，所以不會產生可檢測到的有害效應。逆轉錄病毒核酸可整合入宿主染色體DNA中，使得它們長期存在並穩定傳遞至下一代，這種載體可用於傳遞一種或多種導致形成FRMS的組分。合適的逆轉錄病毒載體實例有慢病毒，其優勢是可感染並轉導非分裂細胞。在這樣的一個實施方案中，慢病毒載體編碼可包裝的RNA載體基因組並可有效連接至一種啟動子，其中所有功能性逆轉錄病毒輔助基因均不存在，這樣的慢病毒載體用來轉移編碼對形成本發明的FRMS重要的組分的DNA。這類載體的實例描述於WO 98/17815、WO 98/17816和WO 98/17817，其每一專利內容通過引用整體結合到本文中。
在再一實施方案中，感染並轉導非分裂細胞的非整合病毒載體如腺病毒載體可用來傳遞對形成FRMS重要的組分。腺病毒載體具有幾大優勢，因為這類載體避免了與永久性改變宿主細胞基因組或促進插入誘變有關的風險。腺病毒是開發的最好非整合病毒載體之一，並可用來轉移高達75kb的表達盒。可以非常高的滴度產生重組腺病毒，所以它是高度感染性的並可有效地轉移基因至種類繁多的非複製和複製細胞，而對哺乳動物體內基因轉移更理想。
腺病毒基載體較安全，並可進行操作以編碼所需要的組分，同時使其喪失以正常裂解病毒生活周期複製的能力。腺病毒具有氣道上皮天然趨向性。因此，腺病毒基載體特別優選用於上皮性傳遞應用。在特別的實施方案中，腺病毒基基因治療載體包含腺病毒血清型2基因組，其中所述基因組的E1a和E1b區缺失而代之以目的核苷酸序列，所述基因組區參與早期的病毒複製。在又一實施方案中，腺病毒基基因治療載體僅含有必須的可讀框(腺病毒早期區4(E4)的ORF3或OFR6)，而缺失所有其它E4可讀框，或者可另外在E3區中含有缺失(參見例如美國專利第5,670,488號，該專利通過引用整體結合到本文中)。在另一實施方案中，所用的腺病毒基治療載體可以是假腺病毒(PAV)，它不含有有害的病毒基因而且外源物質的理論容量近36kb。
在另一實施方案中，腺伴隨病毒(AAV)系統可用來傳遞對形成本發明的FRMS重要的組分。AAV具有廣泛的宿主範圍，而且目前設計了不需要輔助病毒的AAV載體。這類AAV載體實例描述於WO97/17458。
可按照本發明使用痘苗病毒載體，因為DNA大片段容易克隆入其基因組，並已有減毒的重組痘苗變異體的描述(Meyer等，1991,J.Gen.Virol.72:1031-1038)。在本發明的一個實施方案中，痘苗病毒載體用來傳遞對形成FRMS重要的組分，使得所述組分在所述重組痘苗感染細胞中表達。在一個具體的實施方案中，所述組分是人CD4、共同受體(例如CCR5或CXCR4)和HIV包膜蛋白。在該具體的實施方案中，用所述重組痘苗感染細胞導致所述組分表達並形成HIV FRMS。
在另一實施方案中，構建兩種不同的重組痘苗病毒，使得第一種病毒編碼HIV env蛋白，而第二種病毒編碼人CD4和趨化因子受體。在該實施方案中，第一種病毒用來感染第一細胞群，使得所述感染導致表達HIV env蛋白。第二種病毒用來感染第二細胞群，使得所述感染導致表達CD4和趨化因子受體。共培養第一感染細胞群和第二感染細胞群，使得形成HIV FRMS。在又一實施方案中，所述共培養的細胞可以是交聯細胞。
可工程以下病毒來表達形成減毒表型的突變包括流感病毒在內的正粘病毒；包括呼吸道合胞病毒和Sendai病毒在內的副粘病毒；以及彈狀病毒(參見例如1996年11月26日公開的美國專利系列號5,578,473，將其通過引用整體結合到本文中)。也可以工程這些病毒基因組以表達外源核苷酸序列，如對形成本發明的FRMS重要的組分(參見例如1992年11月24日公開的美國專利系列號5,166,057，將其通過引用整體結合到本文中)。
可用反向遺傳技術操作負鏈和正鏈RNA病毒基因組，以導入產生減毒表型的突變，如用流感病毒、麻疹病毒、Sindbis病毒和脊髓灰質炎病毒所證實的一樣(參見Palese等，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11354-11358)。這些技術也可用來導入外源DNA即編碼對形成FRMS重要的組分或蛋白的外源DNA，以獲得按照本發明使用的重組病毒載體。此外，可工程減毒的腺病毒和逆轉錄病毒，以表達對形成FRMS重要的組分。所以，各種各樣的病毒可工程來傳遞對形成本發明FRMS重要的組分。
噬菌體可用來特異性感染細菌細胞(Soothill,J.S.,1992,J.Med.Microbiol.37:358-261)。
在本發明的病毒載體中，非病毒DNA(例如編碼細胞受體的DNA)或非天然病毒DNA(例如編碼病毒包膜蛋白的DNA)可編碼對形成FRMS重要的任何組分。
因此，本領域技術人員知道，可通過病毒體、病毒感染的細胞或化學/遺傳失活的病毒體、病毒載體、病毒複製子(即非複製的病毒構建物例如VEE複製子)、重組DNA法產生的病毒樣顆粒或以裸DNA為細胞提供用以構建本主題發明的FRMS的病毒包膜蛋白、細胞受體和/或共同受體。
如上所述，重組表達系統可應用調節元件，包括但不限於誘導型和非誘導型啟動子、增強子、操縱基因。用於將DNA或核酸片段插入載體的任何前述方法均可用來構建含有合適轉錄/翻譯控制信號和蛋白編碼序列組成的基因或嵌合基因的表達載體。這些方法可以包括體外重組DNA技術和合成技術。一般而言，編碼蛋白或肽片段的核酸序列的表達可受第二種核酸序列調控，使得所述蛋白或肽在用所述重組DNA分子轉化的宿主細胞中表達。例如病毒包膜蛋白的表達可受控於本領域已知的任何啟動子/增強子元件。啟動子/增強子可以是同源(即自身)或異源(即非自身)的。可用於控制蛋白表達的啟動子包括但不限於SV40早期啟動子區(Benoist等，1981,Nature 290:304-310)、含有Rous肉瘤病毒的3』長末端重複序列的啟動子(Yamamoto等，1980,Cell 22:787-797)、皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441-1445)、金屬硫蛋白基因的調節序列(Brinster等，1982,Nature 296:39-42)。含有胭脂氨酸合成酶啟動子區的植物表達載體(Herrera-Estrella等，Nature 303:209-213)、花椰菜花葉病毒35S RNA啟動子(Gardner等，1981,Nucl.Acids Res.9:2871)、和光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的啟動子(Herrera-Estrella等，1984,Nature 310:115-120)、得自酵母或其它真菌的啟動子元件如Gal4-反應啟動子、ADC(醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子、鹼性磷酸酶啟動子以及以下具有組織特異性並可用於轉基因動物的動物轉錄控制區在胰腺腺泡細胞中有效的彈性蛋白酶Ⅰ基因控制區(Swift等，1984,Cell 38:639-646；Ornitz等，1986,Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.50:399-409；MacDonald,1987,Hepatology 7:425-515)；在胰腺β細胞中有效的基因控制區(Hanahan,1985,Nature 315:115-122)，在淋巴樣細胞中有效的免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等，1984,Cell 38:647-658；Adames等，1985,Nature 318:533-538；Alexander等，1987,Mol.Cell.Biol.7:1436-1444)，在睪丸、乳腺、淋巴樣細胞和肥大細胞中有效的小鼠乳癌病毒控制區(Leder等，1986,Cell 45:485-495)，在肝臟中有效的白蛋白基因控制區(Pinkert等，1987,Genes and Devel.1:268-276)，在肝臟中有效的甲胎蛋白基因控制區(Krumlauf等，1985,Mol.Cell.Biol.5:1639-1648；Hammer等，1987,Science 235:53-58)，在肝臟中有效的α1抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等，1987,Genes and Devel.l:161-171)，在類紅細胞中有效的β-球蛋白基因控制區(Mogram等，1985,Nature315:338-340；Kollias等，1986,Cell 46:89-94)，在腦少突膠質細胞中有效的髓鞘鹼性蛋白基因控制區(Readhead等，1987,Cell 48:703-712)；在骨骼肌中有效的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(Sani,1985,Nature 314:283-286)以及在下丘腦中有效的促性腺釋放激素基因控制區(Mason等，1986,Science 234:1372-1378)。
在一個具體的實施方案中，使用含有以下組分的載體與編碼病毒蛋白或細胞蛋白或嵌合蛋白的核酸有效連接的啟動子和一個或多個複製起點以及任選的一個或多個選擇標記(例如抗生素抗性基因)。在另一實施方案中，可用兩個或多個啟動子來控制在單一質粒中的兩個或多個基因的表達。
在一個具體的實施方案中，應用所述CMV立即早期(IE)啟動子來控制編碼病毒蛋白或細胞蛋白或嵌合蛋白的核酸的表達。
啟動子可以是誘導型或組成型啟動子。在存在某些誘導物的情況下可提高某些啟動子的表達；因此，例如可控制遺傳工程蛋白嵌合體的表達。誘導型啟動子可用來控制本發明所述蛋白的表達，使得所述蛋白僅在所述誘導物存在下才產生。
本發明還提供穩定表達導致形成本發明FRMS的組分的方法。關於長期、高產率產生重組蛋白，穩定表達是可能的。例如可工程穩定表達一種或多種細胞受體和所述病毒共同受體的細胞系。不是採用含有病毒複製起點的表達載體，而是可用合適表達控制元件(例如啟動子序列、增強子序列、轉錄中止子、聚腺苷酸化部位等)控制的DNA以及選擇標記轉化宿主細胞。例如在導入所述外源DNA後，可使工程的細胞在滋養培養基中生長1-2天，然後轉換到選擇培養基。重組質粒的選擇標記賦予選擇轉化灶抗性(例如通過將所述質粒穩定整合入其染色體中)，並允許細胞形成和生長形成轉化灶，它又可克隆並擴展為細胞系。該方法可優選用於工程細胞系。該方法可優選用於工程表達所選定基因產物的細胞系。這類細胞系特別用於篩選和評價影響選定基因產物的內源活性的化合物。
許多選擇系統可用於產生穩定表達的細胞系，所述系統包括但不限於單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977,Cell 11:223)、次黃嘌呤-鳥嘌啉磷酸核糖轉移酶(Szybalska等，1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:2026)和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy等，1980,Cell 22:817)基因，它們可分別用於tk-、hgprt-或aprt-細胞。同樣，抗代謝物抗性可用作以下基因的選擇基礎賦予氨甲喋呤抗性的DHFR(Wigler等，1980，Natl.Acad.Sci.USA 77:3567；O』Hare等，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；賦予黴酚酸抗性的gpt(Mulligan等，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072)；賦予氨基糖苷G-418抗性的neo(Colberre-Garapin等，1981,J.Mol.Biol.150:1)和賦予潮黴素抗性的hygro(Santerre等，1984,Gene 30:147)。
5.1.3．表達其結合產生FRMS的組分的細胞本發明包括表達其結合導致形成FRMS的組分。在本發明的數個實施方案中，表達可以是在初級細胞、動物細胞和昆蟲細胞系中進行。按照本發明，可使用各種初級或次級細胞或細胞株，包括但不限於分離自皮膚、骨髓、肝臟、脾、胰腺、腎臟、腎上腺和神經組織的細胞，在此僅舉數例。可按照本發明使用的其它細胞類型有免疫細胞(如T細胞、B細胞、天然殺傷細胞等)、巨噬細胞/單核細胞、脂肪細胞、外膜細胞、成纖維細胞、神經原細胞、網狀細胞等。在又一實施方案中，可使用次級細胞系，包括但不限於肝細胞系如CWSV、NR、Chang肝細胞或其它細胞系如CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、293、373、CaSki和W138細胞系。在一個優選的實施方案中，宿主細胞含有一種或多種促進結合或病毒感染的細胞受體。
在本發明的一個優選實施方案中，所述細胞為真核生物細胞、優選為細胞系、優選哺乳動物細胞，而最優選人細胞用於本發明的方法。細胞可得自人類(例如HeLa細胞)、靈長類、小鼠、兔、雞等，但是也可得自人類以外的轉基因動物。許多真核細胞系可購自ATCC(American Type Culture Collection,Rockville,MD)。在一個最優選的實施方案中，真核細胞來自人類。在其它實施方案中，所述細胞得自小鼠、猴子或大鼠。優選非腫瘤細胞系和自體容許細胞用於製備本主題發明的FRMS。
所以，本發明提供含有導致形成本發明FRMS的一種或多種組分。本發明還提供含有形成本發明FRMS所需要的所有組分的細胞。在一個實施方案中，本發明提供重組表達在病毒包膜與宿主細胞膜融合時起作用的包膜病毒的包膜蛋白的細胞，或者重組表達融合缺陷型的所述包膜蛋白的突變型的細胞。在另一實施方案中，所述細胞表達起所述包膜蛋白受體作用的一種或多種細胞膜蛋白。在一個具體的實施方案中，本發明提供重組表達HIV gp160、人CD4和HIV共同受體的細胞。
本發明還提供重組表達在病毒包膜與宿主細胞膜融合時起作用的包膜病毒的包膜蛋白的細胞系、或者重組表達融合缺陷型的所述包膜蛋白的突變型的細胞系。在另一實施方案中，所述細胞系表達起所述包膜蛋白受體作用的一種或多種細胞膜蛋白。在一個具體的實施方案中，本發明提供重組表達HIV gp160的細胞系，該細胞系表達CD4和HIV共同受體；所述細胞系缺乏裂解gp160產生gp120和gp41的功能性蛋白酶。
在本發明的其它實施方案中，將含有本發明的FRMS的細胞作為免疫原給予患者(參見本文5.5小節)。在一個優選的實施方案中，當所述患者是人類患者時，所述細胞為人初級細胞。在另一優選實施方案中，所述細胞為自體細胞。
5.1.4．應用形成複合物的融合缺陷型突變體在一個實施方案中，應用含有野生型融合活性的任何病毒包膜蛋白製備FRMS。在一個替代實施方案中，如本小節所述，應用融合缺陷型包膜蛋白。
本發明提供對病毒包膜蛋白或宿主細胞受體或共同受體蛋白的突變的利用，這類突變抑制病毒包膜和細胞膜融合過程的完成。本發明提供不容許病毒包膜-細胞膜融合過程完成、但是確實形成本發明的融合相關分子結構的融合缺陷型突變。所述融合缺陷型突變用來構建含有表位的FRMS。在本發明的一個實施方案中，融合缺陷型包膜蛋白和細胞受體結合時，導致FRMS的累積。因此，本發明的融合缺陷型突變可用於形成FRMS。
本領域已知的任何誘變技術均可用來修飾DNA序列中的各核苷酸，目的是在所表達的肽序列中產生胺基酸取代，以產生/缺失限制位點或加入親和標記物。這類技術包括但不限於化學誘變、體外定點誘變(Hutchinson,C.等，1978,J.Biol.Chem 253:6551)、寡核苷酸定點誘變(Smith,1985,Ann.Rev.Genet.19:423-463；Hill等，1987,Methods Enzymol.155:558-568)、基於PCR的重疊延伸(Ho等，1989,Gene 77:51-59)、基於PCR的巨引物誘變(Sarkar等，1990,Biotechniques,8:404-407)等。通過DNA測序可證實修飾。
可構建任何包膜病毒的融合缺陷型突變。在一個具體的實施方案中，構建影響融合完成能力的突變。可根據公開的文獻或根據已知或理想結構預測的分子模型選擇突變。已知突變不會有害影響包膜蛋白表達，並優選運送到所述細胞表面。
在又一實施方案中，通過在細胞如COS、293T中表達所述突變基因(例如本發明的方法)證實融合缺陷型突變體並分析融合能力。然後可分析細胞的突變組分的細胞表面表達(用本領域已知的方法，例如流式細胞法或活細胞間接免疫螢光)。另外，可用蛋白質印跡分析或任何其它本領域已知的方法分析突變蛋白如突變的HIV gp160的蛋白水解處理。如在此的5.7小節所述，可分析突變組分的融合能力(例如通過合胞體形成分析，例如如果是HIV，則用U87-CD4-共同受體細胞融合分析)。
在本發明的又一實施方案中，測試結合缺陷型、融合缺陷型或融合中止的突變包膜蛋白在轉基因小鼠疫苗接種分析中產生初級分離病毒的中和抗體的能力。在該實施方案中，免疫原可包含與例如U87-CD4-CCR5細胞(當測試HIV相關突變時)共培養的、表達受試突變包膜蛋白的細胞。
在本發明的一個優選實施方案中，將引起廣泛的PI病毒中和的突變開發成亞單位及重組病毒基免疫原。表Ⅰ列出了用於HIV的典型突變。對本領域技術人員顯而易見的是，可構建適用於其它包膜病毒的相似突變。
表Ⅰ
在例如gp120核心結構的成橋摺疊(bridging sheet)中的其它突變包括Kwong等(Kwong PD等，1998,Nature 393:648-59；Kwong PD等，1999,J.Biol.Chem.274:4115-23)所述的突變和推定的gp41/gp120相互作用區的突變。
在另一實施方案中，本主題發明的FRMS用含有結合以及融合相關突變的病毒包膜蛋白製備。在一個實施方案中，所述病毒蛋白結合宿主細胞受體，但是突變在病毒包膜和宿主細胞膜融合前或融合期間引起融合過程停止。所以，本主題發明的FRMS包括由於一種或多種病毒包膜蛋白和一種或多種細胞膜蛋白結合產生的表位，包括融合缺陷型、融合中止型或結合缺陷型的蛋白，只要所述突變蛋白當用於本發明的方法時，形成產生PI中和抗體的表位。可分離引起融合過程中止的蛋白複合物並用於本發明方法和組合物，包括但不限於免疫原、診斷試劑、試劑盒、疫苗和組合物。
例如在一個具體的實施方案中，所述FRMS含有HIV-1的主要病毒包膜蛋白。存在可用於構建本主題發明的複合物的各類融合相關突變。儘管不希望受限於已知的機制，但是在HIV-1和宿主細胞融合期間，所述gp120表面部分和gp41跨膜部分構成的寡聚包膜蛋白複合物gp160最初與宿主細胞上的CD4受體結合。包膜蛋白和CD4受體兩者的構象變化均促進與宿主細胞表面的共同受體分子的相互作用。病毒蛋白-CD4-共同受體三分子複合物的進一步構象變化使得病毒gp41前髮夾結構中間體暴露並使N末端gp41疏水融合結構域插入宿主細胞膜中。隨後在前髮夾結構中間體中的7個一組的螺旋重複區摺疊形成融合活性的gp41的三聚捲曲螺旋核心。捲曲螺旋核心促成匯合的細胞膜和病毒膜最終融合。
具有消除了蛋白酶裂解gp160前體蛋白的突變從而防止釋放gp41疏水融合結構域的病毒包膜蛋白可用來構建所述主題複合物。具體來說，已經證實改變gp120 C末端高度保守的lys/arg-X-lys/arg-arg位點的某些突變可消除融合發生(參見例如Lee CN等，1994,AIDS Res.Hum.Retroviruses.10:1065-9)。
另外，影響N末端gp41融合肽的突變可用來產生本主題發明的複合物。gp41的疏水性N末端區通過插入細胞膜並使可能採用螺旋結構的脂質雙分子層不穩定介導融合。在該區的某些胺基酸變化致使包膜蛋白不能融合。具有這類變化的合成肽既不能與脂質雙分子層結合也不能引起融合。得到充分表徵的gp41的兩個融合缺陷型突變是V2E和G10V(Kliger Y等，1998,J Biol Chem.272:13496-505)。前者涉及疏水肽的極性取代，而後者可影響推定的脂質雙分子層的螺旋結構。通過定點誘變或本領域已知的任何方法可將這些突變引入168P包膜蛋白基因(gp41:ala-val-gly-ile-gly-val-leu-phe-leu-gly-phe-leu-gly...)，並測試包膜蛋白的表達和融合性。
此外，具有改變gp41捲曲螺旋核心區的突變的包膜蛋白可用來構建本主題發明結構。高度保守的捲曲螺旋基元可見於參與許多病毒科融合的蛋白，而在介導囊泡融合的細胞蛋白中鑑定到相似的結構。模擬N-或C-螺旋區的合成肽(例如DP107和DP178)(Furuta等，1998,Nature Structural Biology 5:276-279)有效中和病毒感染性，推測是通過結合相關螺旋區並幹擾前髮夾結構中間體的摺疊起作用。除了從結晶學可獲得詳細的結構信息之外，還可通過誘變充分了解N-和C-螺旋區。鑑定了數種突變(例如V590R和Y586E)，儘管推測它們破壞N-和C-螺旋捲曲之間的界面，但是保有正常包膜蛋白表達和裝配，它們仍然是非融合性的(Weng等，1998,Joumal of Virology 72:9676-9682)。
感受態或突變病毒包膜蛋白以及細胞受體和/或共同受體可通過本領域已知的方法導入病毒載體或二倍體細胞，所述方法包括本文所述的方法。常規克隆編碼病毒蛋白的病毒基因，以在細菌細胞、原核生物細胞或真核生物細胞，或在病毒或DNA載體中表達。同樣，可克隆並表達人細胞受體，以產生用其研究危險性病理性疾病的模型。病毒基因或宿主受體可通過轉染或利用病毒載體導入外源DNA中。
5.1.5．形成FRMS的其它方法此外，設計了引發形成本主題發明結構的其它方法，包括調節pH條件、溫度和鹽濃度。另外，足夠強地結合包膜蛋白的單克隆抗體可引發形成本主題發明結構必須的構象變化。因此，本主題發明的FRMS可因為病毒蛋白和各種動物細胞組分(包括但不限於以上所列的組分)相互作用而形成。
5.2．捕獲FRMS形成FRMS後，可用各種方法來保存或「捕獲」對初級病毒分離株具有疫苗作用的免疫原形式的FRMS。
在一個實施方案中，本主題發明的FRMS的產生是因為一種或多種病毒包膜蛋白與一種或多種細胞受體和/或共同受體作用。在一個實施方案中，通過固定或交聯FRMS「捕獲」複合物。例如在分別表達形成FRMS的病毒組分和細胞組分的共培養細胞中形成的FRMS可通過用交聯劑固定所述細胞捕獲。
在一個具體的實施方案中，將用表達病毒包膜蛋白的核酸轉化的細胞和用表達宿主細胞受體和共同受體的核酸轉化的細胞一起培養。在第一種細胞表面表達的病毒蛋白與在第二種細胞表面表達的受體結合。在該細胞-細胞相互作用開始時固定所述細胞。儘管不希望受限於機理，但是交聯「捕獲」所述中間融合複合物並提供可分離的融合相關決定簇，並可用作例如疫苗組分。可應用本領域已知的任何方法表達細胞中的融合複合物的病毒組分或細胞組分(參見例如本文5.1.1小節)。
捕獲FRMS時，可用本領域已知的任何方法固定或交聯融合細胞或融合缺陷型突變細胞。可用的交聯融合劑包括但不限於甲醛戊二醛、福馬林、對疊氮苯甲醯肼、N-(4-[p-疊氮水楊醯氨基]-丁基)-3』(2』-吡啶二硫代)-丙醯胺、二(β-[4-疊氮水楊醯氨基]-乙基)二硫化物、1,4-二馬來醯亞胺基-2,3-二羥基丁烷、1,6-二馬來醯亞胺基己烷、1,5-二氟-2,4-二硝基苯、己二亞氨酸二甲酯(dimethy adipimidate)-2HCl、辛二亞氨酸二甲酯(dimethyl suberimidate)-2HCl、Dimethyladipodimidate-2HCl、庚二亞氨酸二甲酯(dimethyl pimelimidate)-2HCl、戊二酸二琥珀醯亞胺酯(disuccinimidyl glutarate)、酒石酸二琥珀醯亞胺酯、1-乙基-3-[3-二甲基anono丙基]碳二亞胺鹽酸鹽、(N-羥基丁二醯亞胺基(succinimidyl)-4-疊氮水楊酸、硫丁二醯亞胺基2-[7-疊氮基-4-甲基-香豆素-3-乙醯氨基甲基-1,3-氨基丙酸酯、N-丁二醯亞胺基-4-碘乙醯氨基苯甲酸酯、N-丁二醯亞胺基-3-[2-吡啶基硫代]丙酸酯和丁二醯亞胺基6-[3-(2-吡啶基去硫代)-丙醯胺]己酸酯(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)。
在本發明的一個優選實施方案中，所述交聯劑為甲醛。在一個具體的實施方案中，使用低水平甲醛(0.2％)以保持抗原性。在其它實施方案中，即使較高濃度甲醛也可以使用，以使穩定性最佳。可使用約0.01％-約8％濃度甲醛製備本主題發明的複合物。可用於交聯融合細胞的其它交聯劑包括但不限於戊二醛(0.05-0.5％)。了解本文所包含的公開內容的本領域技術人員知道，可改變固定或交聯條件(例如使用的試劑、試劑濃度、時間和溫度)以確定FRMS免疫原性的最佳條件。
在再一實施方案中，本主題發明的複合物的製備可用例如表達病毒包膜蛋白和CD4/共同受體(如果不是內源性存在的話)的重組痘苗病毒感染細胞培養物中的人二倍體細胞。融合期間，交聯所述細胞以捕獲融合相關結構和決定簇。
在本發明又一實施方案中，當直接用活病毒或減毒病毒感染表達所述細胞受體和/或病毒共同受體的細胞時，可交聯發生感染的細胞以捕獲FRMS。
在本發明其它實施方案中，可工程一個細胞表達對形成FRMS重要的所有組分。在該實施方案中，可交聯或固定這個細胞或這些細胞以捕獲FRMS。在該實施方案中，固定時沒有必要發生細胞-細胞相互作用，因為所有組分均表達在單個細胞上。
本發明提供在病毒包膜上表達對形成FRMS重要的細胞組分或蛋白的工程病毒顆粒。在該實施方案中，可交聯重組病毒顆粒以捕獲在病毒顆粒包膜上形成的FRMS。
在本發明的一個替代實施方案中，不需要固定或交聯所述複合物。因為發現本主題發明複合物在細胞裂解溶液中形成。所以，例如通過簡單裂解用HIV-1包膜蛋白以及CD4/共同受體轉染或感染的細胞產生本主題發明複合物，其中FRMS在細胞裂解溶液中形成。細胞裂解方法是本領域周知的(參見例如Sambrook等，同上)。細胞裂解方法包括去垢劑裂解(例如1％NP40)、凍融裂解、超聲裂解或本領域已知的任何方法。在本發明的一個具體實施方案中，在細胞-細胞相互作用開始時通過在冰冷的0.2％甲醛的磷酸緩衝鹽水溶液中固定，固定細胞培養物。在本發明的另一實施方案中，去垢劑裂解細胞包括使用去垢劑Brij 97。
因此，本發明提供為交聯細胞分子結構或從細胞裂解物分離的分子結構。在本發明的其它實施方案中，提供允許累積FRMS和捕獲FRMS的融合缺陷型突變。
5.3．分離FRMS在一個實施方案中，表達其結合產生FRMS的組分的細胞(例如交聯細胞)可用作本發明疫苗中的免疫原。或者，可分離包含FRMS的分子結構作免疫原。
一旦形成FRMS，可分離並用標準方法包括層析(例如離子交換層析、親和層析和大小排阻層析)、離心、不同溶解度或任何其它蛋白質純化標準技術純化FRMS。此外，可合成對形成FRMS重要的組分，該組分包含有助於回收和純化的親和標記物。肽標記物可與所述蛋白的任何部分結合，只要這樣的結合不改變通過所修飾的組分和所述複合物的其它成分結合產生的表位形成。在各種實施方案中，包含親和標記物的這種嵌合蛋白的製備可通過以合適的讀框連接編碼所述組分的基因序列和編碼所述肽標記物的序列並重組表達所述蛋白實現。注意保證修飾基因保持在同一翻譯讀框內，而不被翻譯中止信號間斷。
本領域已知的各種肽標記物可用來修飾蛋白，例如但是不限於聚組氨酸序列(Petty,1996,Metal-chelate affinity chromatography，述於Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，Ausubel等編輯，Greene Publish.Assoc. Wiley Interscience)、穀胱甘肽S-轉移酶(GST；Smith,1993,Methods Mol.Cell Bio.4:220-229)、大腸桿菌麥芽糖結合蛋白(Guan等，1987,Gene 67:21-30)和各種纖維素結合域(美國專利第5,496,934、5,202,247、5,137,819號；Tomme等，1994,ProteinEng.7:117-123)、S TAGTM系統(Novagen,Inc.)等。其它可用的肽標記物是適用於單克隆抗體的短胺基酸序列，例如但是不限於以下周知的實例FLAG表位、胺基酸408-439的myc表位、流感病毒血細胞凝集素(HA)表位。其它肽標記物由特異的結合配偶體識別，並因此有助於通過親和結合結合配偶體分離，結合配偶體優選固定在固相表面和/或位於固相表面上。本領域技術人員已知，許多方法可用來獲得上述肽標記物的編碼區，包括但不限於DNA克隆、DNA擴增和合成方法。某些肽標記物和其檢測和分離試劑可市售獲得。
已知或容易從實驗室或商業供應商獲得的所需肽標記物的DNA編碼序列適於實施本發明。特異性結合配偶體識別這些和其它肽標記物，因此有助於通過與結合配偶體親和結合而分離，該結合配偶體可固定在固相表面上。用重組DNA技術可製備嵌合蛋白基因產物。例如可將編碼對形成FRMS重要的組分的基因序列導入含有肽標記物序列的載體中，使得所述組分基因表達為肽標記的嵌合蛋白。特異性結合配偶體識別的肽標記物可用於親和結合固定在固相表面上的結合配偶體。
在一個優選實施方案中，聚組氨酸標記的融合相關蛋白的構建是將融合相關蛋白基因或基因片段插入表達載體(例如一種pET15序列的載體(Novagen))中，該表達載體將插入序列表達為具有N-末端聚組氨酸標記的嵌合蛋白。在其氨基末端或羧基末端具有連續的6個或更多組氨酸殘基的蛋白對鎳具有強結合親和性。聚組氨酸標記的嵌合蛋白特異性地與包被螯合鎳的固相表面結合。在一個具體的實施方案中，包被金屬鎳的微量滴定板用來分離聚組氨酸標記的嵌合蛋白(Pierce)。
或者，例如Janknecht等描述的系統可用來純化在人細胞系中表達的非變性嵌合蛋白(Janknecht等，1991,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,8972-8976)。在該系統中，將目的基因亞克隆入牛痘重組質粒中，使得所述基因的可讀框可翻譯性融合至6個組氨酸殘基組成的氨基末端標記。將用重組牛痘病毒感染的細胞的提取物上樣到Ni2+氮川乙酸瓊脂糖柱上，用含有咪唑的緩衝液選擇性洗脫組氨酸標記的蛋白。
在另一具體實施方案中，表達構建物的製備是使融合相關蛋白亞克隆入三個pGEX載體的每一個的EcoRI限制位點(穀胱甘肽S-轉移酶表達載體；Smith等，1988,Gene 7:31-40)中。使得可表達包含融合相關蛋白的嵌合蛋白，此嵌合蛋白與全部三個讀框的GST結合域連接，這樣，GST結合活性就以同一個讀框保持在所產生的嵌合蛋白中。GST嵌合肽對其底物穀胱甘肽具有強結合親和性。在一個具體的實施方案中，通過使結合混合物(包括細胞裂解物或固定細胞)與穀胱甘肽連接的固相表面如穀胱甘肽瓊脂糖珠接觸，從所述混合物中分離包含GST標記的FRMS。例如，GST-嵌合蛋白可結合在穀胱甘肽-瓊脂糖珠或穀胱甘肽瓊脂糖柱上。然後以使其可相互作用並結合的方式將所述混合物加至柱或珠中。反應結束時，可洗去未結合的物質。嵌合蛋白和穀胱甘肽瓊脂糖珠之間的相互作用使得可以分離所述複合物。
在另一實施方案中，利用對所表達的嵌合蛋白特異性的抗體可容易地純化嵌合蛋白。
在又一實施方案中，可通過親和化合物與融合相關蛋白結合構建親和標記的FRMS。可使用的親和化合物例如但是不限於生物素、光生物素或本領域已知的其它化合物。在一個實施方案中，親和化合物或親和標記物可通過多功能交聯劑(優選雙功能分子)與融合相關蛋白結合。本文使用的術語多功能交聯劑包括具有一個以上與融合相關蛋白上的功能基團反應的功能基團的分子。通常這樣的交聯劑與多肽上的氨基或巰基形成共價鍵。例如可用生物素N-羥基琥珀醯亞胺酯。
在本發明的一個優選實施方案中，通過與趨化因子共同受體的CD4或包膜蛋白結合分離FRMS的高度特異的方法是使用S肽利用RNA酶A的15個胺基酸的S肽和稱為RNA酶S的較大的枯草桿菌蛋白酶消化片段(S-蛋白；RNA酶A的胺基酸21-124)之間的特異性高親和力的相互作用(Kd=10-9M)親和標記分子(Potts等，1963；Dorai等，1994)。Novagen,Inc.商業性開發的S·TAGTM系統用於檢測和分離在細菌和杆狀病毒系統中表達的重組嵌合蛋白，而且最近擴展至哺乳動物嵌合蛋白。用S-肽標記FRMS的融合相關蛋白。本發明例舉用在CD4、CCR5或包膜蛋白分子的C末端標記S-肽的複合物組分。所標記的複合物易於用S-蛋白瓊脂糖親和層析分離純化。
在一個實施方案中，可使用不可透過膜的交聯劑固定含有標記複合物的細胞。在一個具體的實施方案中，用不可透過膜的交聯劑固定含有標記複合物的細胞有利於避免胞質S-肽標記物的失活。或者，可改變S-肽序列(ala-glu-thr-ala-ala-ala-ala-phe-glu-arg-gln-his-met-asp-ser)，使得它不再含有易被破壞的賴氨酸殘基，因此可用甲醛固定而不會導致胞質標記物失活。發生融合的細胞可用各種不可透過膜的交聯劑固定，包括但不限於BS3和DTSSP(分別通過胺反應形成不可裂解或可逆鍵的同型雙功能N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯)；Sulfo-SMPB(不可逆轉地交聯胺和巰基的異型雙功能NHS酯和馬來醯亞胺)；Sulfo-SANPAH和SASD(分別形成不可裂解或可逆轉鍵的異型雙功能NHS酯和光反應性疊氮基苯交聯劑)(Pierce Chemical Company)。
標記的複合物易於純化，使得可提供用於例如疫苗製劑組分的融合相關組分的分離製劑。純化或分離的標記複合物也可用作體外分析的診斷標準品。此外，標記的複合物容許進行包膜介導的融合的功能分析。
因此，本發明提供純化包含1型人類免疫缺陷病毒的包膜蛋白的蛋白複合物的方法，所述蛋白與人CD4和人CCR5有效作用，該方法包括以下步驟a)用肽序列標記所述複合物以有助於隨後的純化；和b)分離標記的複合物。
在其它具體實施方案中，本發明提供分離的蛋白複合物，它含有與人CD4和人CCR5有效作用的1型人類免疫缺陷病毒的包膜蛋白。
5.4．FRMS的類型對於本領域技術人員顯而易見的是，任何包膜病毒可用於本發明的方法，以構建或應用FRMS。例如本發明FRMS的一個重要用途是用作疫苗免疫原。包含FRMS的疫苗的一個優點是，這些免疫原對初級分離株提供高得多的中和率。可使用的包膜病毒包括但不限於以下病毒科逆轉錄病毒科、彈狀病毒科、日冕形病毒科、線狀病毒科、沙粒病毒科(Arenaviridae)、痘病毒科、本揚病毒科、黃病毒科、披蓋病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、皰疹病毒科和虹彩病毒科(Iridoviridae)。
在本發明的一個實施方案中，用本發明的方法形成逆轉錄病毒的FRMS。例如在一個優選的實施方案中，本發明的FRMS包含1型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)的主要病毒包膜免疫原，而且產生自HIV-1的宿主細胞受體和宿主細胞共同受體的相互作用。宿主細胞共同受體可以是CCR5、CXCR4、CCR3、CCR2b或本領域已知的任何其它宿主細胞共同受體。本發明的典型FRMS的產生緣於HIV-1分離株168P的病毒包膜蛋白和宿主細胞共同受體CCR5的相互作用，所述病毒包膜蛋白產生於該病毒與宿主細胞受體CD4的相互作用。對於本領域技術人員顯而易見的是，其它重組HIV包膜蛋白，包括獨立作用於CD4的包膜蛋白，可用來製備本主題發明範圍內的FRMS。
在一個具體的實施方案中，作為舉例而不限於，用於HIV疫苗的本主題發明的免疫原的製備如下共培養表達包膜蛋白的COS-7細胞(LaCasse等，1998,Science,283:357-360)和表達人CD4受體和CCR5共同受體的細胞(U87-CD4-CCR5)。在該實施方案中，轉染(30-60％轉染效率)後24小時用0.5mMEDTA收穫包膜表達細胞，並與相同數量的U87-CD4-CCR5靶細胞共培養。融合進程的評價是染色包膜表達細胞並在顯微鏡下檢測其摻入多核合胞體的情況。融合在12-24小時內完成。立即形成複合物。共培養1-5小時後固定的細胞估計為最大合胞體形成的10-30％。最初選擇融合的早期時間點以捕獲導致融合的過渡中間體。其它時間點(例如10小時、24小時或更長)也可用來獲得本主題發明的融合相關複合物。融合過程的晚期時間點的複合物可進一步顯現中和表位，並可用來對重要免疫原的外形和時間過程作圖。
在其它實施方案中，用本發明方法產生黃病毒FRMS。屬於黃病毒科的病毒包括例如C型肝炎病毒(HCV)、登革病毒、黃熱病病毒、蜱傳腦炎病毒和牛病毒性腹瀉病毒。黃病毒科類似於披蓋病毒科，披蓋病毒科包括甲病毒屬病毒(例如委內瑞拉型馬腦脊髓炎病毒、新培斯病毒、賽姆利基森林病毒)和風疹病毒。與HIV相反，黃病毒通過受體介導的胞吞作用、然後是pH誘導的內體融合，從而進入靶細胞。
屬於黃病毒科的病毒編碼包膜(E)蛋白，它在許多病毒科病毒中被蛋白水解為成熟的E1和E2蛋白。在特定的HCV(C型肝炎病毒)時，E2蛋白是受體結合部分(結合細胞膜蛋白CD81)，而E1是推定的病毒融合蛋白。
在本發明的另一實施方案中，用本發明方法形成黃病毒或披膜病毒FRMS。例如本發明的HCV FRMS因為E1、E2和CD81結合而形成。在一個具體實施方案中，HCV E1和E2蛋白可共表達在可接受的細胞底物上，並將位於細胞內質網(ER)上而不是主要在細胞表面上。在一個實施方案中，這些細胞培養物在緩衝至pH 5-6.8的培養基中溫育，以便激發細胞內膜上的E1E2融合。用交聯劑處理培養物，以捕獲具有融合作用的中間體結構，並直接(或在分離細胞內ER膜時)用作疫苗免疫原。
在另一具體實施方案中，將含有E1E2蛋白的破壞的細胞內ER膜以反卷微團(everted micelle)分離，然後與表達E2受體CD81的合適容許細胞溫育。含有E1E2的微團內化，並在內體內發生E1介導的融合。然後交聯細胞，並用作例如疫苗免疫原。或者，工程E1E2蛋白以改變ER定位信號，因此使得E1E2蛋白表達在細胞表面上，因而消除了分離ER膜的需要。
在另一具體實施方案中，可產生源自HCV病毒樣顆粒或含有HCV E1E2的假型病毒體(例如甲病毒屬或VSV)的重組DNA，並通過與受體表達細胞在pH調節至5-6.8的培養基中培養激發融合。用交聯劑如甲醛處理培養物，FRMS用作疫苗免疫原。或者，病毒體可與CD81表達細胞溫育；誘發內化病毒體發生內體內融合，並可用交聯劑處理進行捕獲以用作本發明疫苗免疫原。
在本發明的又一實施方案中，正粘病毒FRMS可用本發明方法產生。正粘病毒科包括所有流感病毒，包括但不限於流感病毒A、流感病毒B和流感病毒C。因此，在一個優選的實施方案中，流感病毒FRMS引發抗各種各樣的流感病毒株的中和抗體，因而應該可製得漂移獨立性流感病毒疫苗。
與黃病毒和披膜病毒一樣，正粘病毒通過受體介導的胞吞作用和內體內的融合進入靶細胞。在這種情況下，病毒神經氨酸酶(NA)蛋白起唾液酸受體結合蛋白(遍在性表達的細胞表面碳水化合物)的作用，血細胞凝集素(HA)蛋白在pH誘導的融合中起作用。與黃病毒相比，流感病毒從細胞表面出芽，因此重組NA和HA蛋白表達於細胞表面。
在其它實施方案中，用本發明方法產生流感病毒FRMS。用類似於上述黃病毒的方法產生流感病毒FRMS，包括pH激發的HA介導的合適細胞之間或細胞和分離的細胞膜或病毒體顆粒之間的融合，複合物捕獲例如可用交聯劑進行，交聯劑使得發生NA介導的胞吞作用，然後產生所要捕獲的內體融合。
在本發明另一實施方案中，用本發明方法製備副粘病毒FRMS。副粘病毒科包括幾個在醫學和獸醫學上具有明顯重要意義的亞組，包括但不限於麻疹病毒屬(麻疹病毒、犬瘟熱病毒、牛瘟病毒)、Rubulaviruses(腮腺炎病毒、新城疫病毒)、副粘病毒屬(人和牛副流感病毒)和肺病毒屬(Pneumoviruses)(呼吸道合胞病毒)。這些病毒類似於正粘病毒屬，只是副粘病毒融合發生於細胞表面而不是內體，而且它是非pH依賴性的。副粘病毒屬的神經氨酸酶血細胞凝集素(HN)(或就是血細胞凝集素(H))蛋白介導細胞粘附，而融合(F)蛋白介導病毒-細胞或細胞-細胞融合。例如如果是麻疹病毒，則H蛋白結合細胞CD46受體，而F蛋白介導膜融合。在一個具體實施方案中，將表達MV的H和F蛋白的細胞與表達CD46細胞共培養(目前仍未鑑定共同受體)，產生細胞-細胞融合，可用交聯劑或本文所述的其它方法捕獲融合。或者，在另一實施方案中，共同受體可表達在表達外源CD46的可融合細胞上。也可使用具體實施方案(如以上對HIV和其它病毒的描述)。
在本發明的一個具體實施方案中，用本發明方法製備皰疹病毒FRMS。皰疹病毒由一個大的家族組成，包括多個具有醫學和獸醫學重要意義的成員。人類皰疹病毒包括但不限於HSV1和HSV2、水痘-帶狀皰疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨細胞病毒和Kaposi皰疹病毒HHV8。
例如如果是HSV1時，結合和進入是一個複雜的過程，包括幾種病毒糖蛋白(gD、gC和gH/gL)和幾種細胞受體以及粘附分子(粘多糖和皰疹病毒進入介質(Hve)蛋白A-C)。結合和融合以不依賴pH的方式發生於細胞表面。
在一個具體實施方案中，HSV FRMS的構建是用表達細胞受體和粘附分子的細胞(例如人MRC5細胞)，將這種細胞與表達HSV糖蛋白gD、gC、gH和gL的細胞共培養。優選用交聯劑固定終止細胞-細胞融合，以捕獲FRMS。
如本文所述，病毒蛋白和宿主細胞受體可結合形成本主題發明的病毒的FRMS，所述病毒包括皰疹病毒、痘病毒、副粘病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、風疹病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、C型肝炎病毒、伊波拉病毒(ebola)和黃病毒類，如登革病毒和黃熱病病毒。此外，本主題發明的FRMS可包括獸醫學上重要病毒的病毒蛋白，包括狂犬病病毒、貓白血病病毒、貓免疫缺陷病毒和牛瘟病毒。
表Ⅱ是具體包膜病毒的細胞受體的實例表，當所述細胞受體與病毒包膜蛋白一起表達時，它們可與包膜蛋白結合導致形成FRMS。
表Ⅱ
用本發明方法可治療或預防的其它病毒性疾病包括但不限於由以下病毒引起的疾病C型肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒、Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-Ⅰ)、Ⅱ型單純皰疹病毒(HSV-Ⅱ)、牛瘟病毒、呼吸道合胞病毒、巨細胞病毒、海膽病毒、蟲媒病毒、漢坦病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、Ⅰ型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)、Ⅱ型人類免疫缺陷病毒(HIV-2)、任何披蓋病毒屬病毒(例如登革病毒)、甲病毒屬病毒、黃病毒屬病毒、冠形病毒屬病毒、狂犬病毒、綠猴病毒、伊波拉病毒、副流感病毒、正粘病毒、bunyaviruses、沙粒病毒、Ⅰ型人T細胞白血病病毒、Ⅱ型人T細胞白血病病毒、猿猴免疫缺陷病毒、慢病毒、Epstein-Barr病毒、人皰疹-、彌猴皰疹病毒1(B病毒)和痘病毒。
表Ⅲ是具體包膜病毒科的包膜蛋白的實例表，當所述包膜蛋白與細胞受體蛋白一起表達時，它們可與細胞受體蛋白結合導致形成FRMS。
表Ⅲ
在本發明的其它實施方案中，正粘病毒科(如流感病毒)、黃病毒科(如伊波拉病毒)或逆轉錄病毒科(如HIV)的三鏈捲曲螺旋結構有利於形成FRMS。
在另一實施方案中，可用合成肽抑制病毒感染。舉例來說，含有兩種gp41螺旋捲曲中的任何一種的合成肽能夠結合相關螺旋區並廣泛性抑制病毒感染(參見例如Wild,C.等，1992,Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 89:10537；Furuta,R.A.等，1998,Nature Structural Biology 5:276)。
在其它實施方案中，針對FRMS免疫原的中和抗體同樣可靶向參與融合活化的結構。
在本發明的另一實施方案中，可用不需要宿主細胞受體而只需要宿主細胞共同受體以與病毒結合的病毒株。例如如果是HIV時，在本發明的方法中可使用不需要CD4進行病毒結合的HIV病毒株(參見例如Hoxie等，1998,J.Reprod.Immunol.41:197-211)。所以當使用這種病毒株時，沒有必要表達CD4。
5.5．疫苗製劑和給予方法本主題發明還涉及疫苗接種方法，使得接種個體或動物產生針對病毒的免疫應答並防止病毒感染。可通過數種途徑將本主題發明的FRMS給予疫苗接受者(vaccinee)。上述FRMS可以作為與佐劑混合在一起的固定細胞給予疫苗接受者。此外，可給予疫苗接受者分離純化的FRMS。
通過用表達病毒蛋白的轉染細胞和表達宿主細胞受體和/或共同受體的轉染細胞同時免疫接種疫苗接受者，可原位產生FRMS。同樣，在該免疫接種策略中可同時使用含有編碼病毒蛋白的DNA的載體和含有編碼受體蛋白的DNA的載體。載體可包括病毒載體如痘苗病毒和在DNA免疫接種中使用的載體。在同時免疫接種後，病毒蛋白和宿主細胞受體蛋白在體內相互作用，形成本主題發明的FRMS，因此使疫苗接受者暴露於能夠引發中和抗體的獨特表位。
可原位形成FRMS的另一方法包括使用宿主細胞上的受體和共同受體。例如在製備緣於與CD4和CCR5相互作用產生的典型HIV包膜FRMS時，將表達HIV糖蛋白的轉染細胞或含有編碼該蛋白的DNA的載體注入或導入(例如通過VEE或其它載體)宿主淋巴結。病毒蛋白在體內與病毒受體和共同受體的宿主細胞結合併啟動融合，形成FRMS，因此使疫苗接受者接觸新形成的中和表位。
在一個具體的實施方案中，一種疫苗製劑含有分離的蛋白複合物和藥學上可接受的載體，所述複合物包含可與人CD4和人CCR5有效作用的1型人類免疫缺陷病毒的包膜蛋白。在另一實施方案中，本發明提供一種對動物進行針對病毒的免疫接種的方法，包括以下步驟給予動物疫苗製劑，該疫苗製劑包括含可與一種或多種宿主細胞受體或共同受體有效作用的一種或多種病毒蛋白的蛋白複合物，以介導病毒結合、進入和/或感染；由此產生針對所述病毒的中和抗體。
在一個實施方案中，本發明提供一種疫苗製劑，該疫苗製劑含有(a)編碼包膜病毒包膜蛋白的第一種核酸；和(b)編碼一種或多種細胞膜蛋白的第二種核酸，所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在合適的條件下必須並足以融合所述病毒包膜與含有所述細胞膜蛋白的細胞膜，使得在所述受試者體內表達所述包膜蛋白和細胞膜蛋白，並產生針對所述病毒的中和抗體；和(c)藥學上可接受的載體。
在一個實施方案中，本發明提供治療已接觸某一種病毒的宿主的方法或預防宿主感染所述病毒的方法，該方法包括以下步驟將治療有效量的抗體給予宿主，以治療或預防所述宿主的感染，所述抗體是通過用一種分離的蛋白複合物免疫動物產生的，所述蛋白複合物含有可與人CD4和人CCR5有效作用的1型人類免疫缺陷病毒的包膜蛋白。
在另一實施方案中，本發明提供製備一種蛋白複合物的方法，所述複合物含有一種或多種可與一種或多種宿主細胞受體或共同受體有效作用的病毒蛋白，以介導病毒結合、進入和/或感染，所述方法包括以下步驟；a)培養表達一種或多種病毒蛋白的第一種細胞；b)培養表達所述一種或多種病毒蛋白的一種或多種宿主細胞受體或共同受體的第二種細胞；c)共培養第一種和第二種細胞；d)在細胞-細胞融合過程中固定所述共培養物；以及e)分離所固定的細胞。
許多方法可用來導入本發明的疫苗製劑；這樣的方法包括但不限於口服、皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內途徑和通過劃痕(例如用分叉的針經皮膚表層劃痕)。
給予所述疫苗的患者或對象優選為哺乳動物，最優選人類，但是也可以是人類以外的動物，包括但不限於母牛、馬、綿羊、豬、家禽(例如雞)、山羊、貓、狗、倉鼠、小鼠和大鼠。
給予所述疫苗的患者或對象也可以是人類以外的野生動物，包括但不限於獅子、獵豹、大象、長頸鹿、角馬(wildebeest)、美洲豹、黑豹等。所以在該實施方案中，本發明提供對野生動物的處理方法，並提供預防或治療野生動物或野生動物群的方法，所述野生動物群因為高度近交而高度易感病毒性疾病。
在本文所述方法的數個實施方案中，所述受試者為人類。在其它實施方案中，所述人類對象的HIV感染風險高。在其它實施方案中，所述受試者為家畜。
因此本發明提供免疫動物、或者治療或預防動物病毒性疾病的方法，包括給予所述動物免疫有效量的本發明疫苗。
本發明的疫苗製劑也可用來產生用於被動免疫治療的抗體，其中通過給予針對異源生物體的預製抗體達到對宿主的短期保護。
用包含本主題發明的FRMS的免疫原接種小鼠激發免疫動物產生中和抗體。在一個典型實施方案中，所述複合物以含有用佐劑配製的固定完整細胞的疫苗給予。然而對本領域技術人員顯而易見的是，其它疫苗策略也可用來實施本主題發明。例如分離純化的FRMS和/或其表位可以亞單位疫苗給予。此外如上所述，可構建編碼所述功能複合物的基因，並將其置於載體或質粒中，以用於活載體或DNA質粒疫苗。
本發明的病毒疫苗製劑含有免疫有效量的作為本發明疫苗免疫原的一種或多種FRMS和藥學上可接受的載體或賦形劑。也可以進行加強免疫。在一個實施方案中，本發明的疫苗組合物可含有「藥學上可接受的載體」。在本說明書中使用的藥學上可接受的載體為不會干擾所述免疫原作用而且對所述動物無毒的物質。藥學上可接受的載體是本領域周知的，包括但不限於鹽水、緩衝鹽溶液、葡萄糖、水、甘油、無菌等滲緩衝水溶液、水包油或油包水乳劑、含水組合物、脂質體、微珠、微小體或佐劑化合物或其組合。這種可接受的載體的一個實例是生理平衡培養基，它含有一種或多種穩定劑，例如穩定的水解蛋白、乳糖等。所述載體優選為無菌的。所述製劑應該適合給藥方式。
如果需要的話，所述組合物也可以含有微量溼潤劑或乳化劑或pH緩衝劑。所述組合物可以是液體溶液、懸浮劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、緩釋製劑或散劑。口服製劑可含有標準載體，例如藥用級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
一般而言，所述成分單獨提供或一起混合在單位劑型中提供，例如密封容器中的凍乾粉或無水濃縮物，所述容器如標有活性成分量的安瓿或小藥袋(Sachette)。如果注射給予所述組合物，則可提供一安瓿的無菌稀釋劑，以便可在給藥前混合所述活性成分。
在一個具體的實施方案中，在第一個容器中提供本發明的凍幹的可融合複合物；而第二個容器裝有50％甘油、0.25％苯酚和防腐劑(例如0.005％亮綠)的水溶液組成的稀釋劑。
用於所述製劑的免疫原或FRMS的準確劑量也取決於給藥途徑和患者的情況，而且將根據執業醫師的判斷和根據標準臨床技術的每個患者的情況決定。有效免疫量就是指在給予所述融合依賴性複合物或疫苗免疫原的宿主中足以產生針對所述複合物的免疫應答的量。
在一個具體實施方案中，對於人類個體，本發明疫苗免疫原的有效免疫量範圍為10-100mg/kg體重，更優選0.1-10mg/kg體重。也可以加強免疫，但是不優選。
在特定製劑中使用的疫苗免疫原的準確量不是重要的，重要的是給予激發免疫應答必需的最小免疫原量。劑量範圍可小至約10μg，可高至1mg或更高。作為一個實例，在一個具體實施方案中，個體劑量範圍為每次免疫接種約50-650μg。在其它實施方案中，免疫劑量隨所述疫苗免疫原的製劑(例如純化模擬表位(mimitope)、純化FRMS、完整細胞製劑)而定。
在一個優選的實施方案中，所述疫苗製劑含有免疫有效量的FRMS免疫原、優選與免疫刺激劑組合；和藥學上可接受的載體。本文所用的「免疫刺激劑」包括可增強免疫系統活性的任何化合物或組合物，無論它是聯合特異性免疫原的特異性增強作用，還是只是對免疫應答的一個或多個成分活性的獨立作用。某些在疫苗組合物中更常用的免疫刺激劑化合物是佐劑鋁或胞壁醯二肽(MDP)及其類似物。應用這些物質的方法是本領域周知的，熟練技術人員就可確定特定病毒疫苗的刺激劑最適量。在特定製劑中也可使用一種以上的免疫刺激劑。
可按標準方法應用純化免疫原或複合物疫苗。例如應該將純化的蛋白調節至合適濃度，用任何合適疫苗佐劑配製並包裝備用。合適的佐劑包括但不限於礦物凝膠，例如氫氧化鋁；表面活性物質，例如溶血卵磷脂、多聚醇；聚陰離子；肽類；油性乳劑；明礬和MDP。所述免疫原也可摻入脂質體中或與多糖和/或其它聚合物結合，以用作疫苗製劑。如果所述複合物是半抗原，即其抗原性可選擇性地與相關抗體反應，而其免疫原性不能引發免疫應答的分子，半抗原可與載體或免疫原性分子共價結合；例如大蛋白如血清白蛋白可賦予與其連接的半抗原免疫原性。可配製半抗原-載體用作疫苗。
本發明疫苗的有效劑量(免疫量)也可根據動物模型測試系統的劑量反應曲線推定。
因此，本發明提供治療或預防受試對象病毒感染的方法，包括給予所述對象免疫有效量的FRMS，以治療或預防所述病毒感染。在一個具體實施方案中，本發明提供治療或預防人類HIV感染的方法，包括給予所述人類個體免疫有效量的FRMS，以治療或預防HIV感染。
本發明還提供治療或預防受試者病毒感染的方法，包括給予所述受試者有效量的FRMS，以治療或預防所述病毒感染。在一個具體實施方案中，本發明提供治療或預防人類HIV感染的方法，包括給予所述人類個體有效量的單克隆抗體，以治療或預防HIV感染。
5.6．產生的抗體本發明涉及製備與本發明FRMS反應的多克隆抗體和單克隆抗體。按照本發明，FRMS、其片段或其它衍生物、或其類似物可用作免疫原，以產生免疫特異性結合這種免疫原的抗體。這類抗體包括但不限於多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫。
本主題發明還涉及產生免疫應答的方法，例如在動物中產生抗體。在一個實施方案中，給予動物本發明的FRMS。所述FRMS優選包含HIV包膜蛋白並產生於CD4和CCR5的相互作用。所述FRMS的給予方式使得在所述動物中產生針對所述免疫原的免疫應答。優選產生針對所述FRMS表位的抗體。更優選所產生的抗體包括中和抗體。在一個高度優選的實施方案中，所產生的抗體能夠中和各種各樣的初級病毒分離株。
本領域已知的各種方法可用於產生針對FRMS或衍生物或類似物的多克隆抗體。在一個具體實施方案中，可獲得抗FRMS表位、其亞序列的兔多克隆抗體。為了產生抗體，用天然FRMS、或其合成形式、或其衍生物(例如片段或嵌合型)注射免疫各種宿主動物，包括但不限於兔子、小鼠、大鼠等。根據宿主物種，可用各種佐劑來增強免疫應答，所述佐劑包括但不限於弗氏佐劑(完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑)；礦物凝膠如氫氧化鋁；表面活性物質如溶血卵磷脂、多聚醇；聚陰離子；肽類；油性乳劑；匙孔血藍蛋白；二硝基酚和有效的人類佐劑如BCG(卡介苗)和小棒狀桿菌。
為了製備針對FRMS、或其衍生物或類似物的單克隆抗體，可用通過培養的傳代細胞系產生抗體分子的任何技術。例如最初由Kohler和Milstein(Kohler等，1975,Nature 256:295-497)開發的雜交瘤技術，和三瘤技術(trioma technique)、人B細胞雜交瘤技術(Kozbor等，1983,Immunology Today 4:72)，以及產生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(Cole等，1985，單克隆抗體和癌症治療，Alan R.Liss,Inc.，第77-96頁)。在本發明的另一實施方案中，可在無菌動物中產生單克隆抗體(參見例如PCT/US90/022548)。按照本發明，可使用人類抗體，並可用人雜交瘤(Cole等，1983,Proc.natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2026-2030)或用EBV病毒體外轉化人B細胞(Cole等，1985，單克隆抗體和癌症治療，Alan R.Liss,Inc.，第77-96頁)獲得人類抗體。
在一個具體實施方案中，取出用FRMS免疫的小鼠脾臟，在培養基中撥離脾臟從而分離脾細胞。用聚乙二醇(PEG)將脾細胞與HPRT-陰性小鼠骨髓瘤細胞融合。將含有4∶1的脾細胞與骨髓瘤細胞的細胞沉澱在含有50％預試驗的PEG-4000D無血清培養基中重懸浮並進行處理(接觸2.5分鐘)。然後將所述細胞懸浮液在無血清培養基中緩慢地稀釋，將細胞接種在96孔培養板的HAT選擇培養基中，該選擇培養基為含有以下成分的DMEM培養基20％預試驗的胎牛血清、10％NCTC-109(Gibco)、1％非必需胺基酸、1×穀氨醯胺和1×Pen-Strep、1×OPI(15mg/ml草醯乙酸鹽、5mg/ml丙酮酸鈉和20單位/ml胰島素)、100μM次黃嘌呤、0.4μM氨基喋呤和16μm胸腺嘧啶。顯微鏡下監測含有雜交瘤的各孔，適當/必要時收集上清液用於抗體產生分析。
實際上按照本發明，可使用為製備「嵌合抗體」而開發的技術(Morrison等，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851-6855；Neuberger等，1984,Nature 312:604-608；Takeda等，1985,Nature314:452-454)，該技術是剪接FRMS特異性的小鼠抗體分子基因和具有合適生物活性的人抗體分子基因；這類抗體屬於本發明範疇。在另一實施方案中，本發明還提供「人源化」抗體(美國專利第5,225,539號)。
按照本發明，可用產生單鏈抗體所述的技術(美國專利第4,946,778號)產生FRMS特異性單鏈抗體。本發明的另一實施方案採用關於構建Fab』表達文庫所述的技術(Huse等，1989,Science 246:1275-1281)，使得可快速簡便地鑑定具有所需要的腫瘤阻抑蛋白、衍生物或類似物特異性的單克隆Fab片段。
用已知技術可產生含有獨特型所述分子的抗體片段。例如這類片段包括但不限於可用胃蛋白酶消化所述抗體分子產生的F(ab』)2片段、可通過還原所述F(ab』)2片段的二硫鍵產生的Fab』片段、可用木瓜蛋白酶和還原劑處理所述抗體分子產生的Fab片段和Fv片段。
在本發明中也可設計來自組合文庫的Fab片段(參見例如Chanock等，1993,Infect Agents Dis.2:118-31)。
製備抗體時，可用本領域已知的技術(例如酶聯免疫吸附測定或ELISA)篩選所需要的抗體。例如為了選擇特異性識別FRMS的抗體，人們可分析產生可結合FRMS表位而不結合其它蛋白產生的表位的產物的雜交瘤。為了選擇特異性結合第一FRMS同系物而不特異性結合不同FRMS同系物的抗體，人們可根據陽性結合第一FRMS同系物而不結合第二FRMS同系物進行選擇。也可用功能性分析進行抗體篩選，例如病毒中和分析，如本領域已知或本文所描述的病毒中和分析。
還提供FRMS結構域特異性抗體。也提供FRMS蛋白表位特異性抗體。
所產生的抗體可用本領域已知的標準技術(例如免疫親和層析、離心、沉澱等)分離，並可用於診斷性免疫分析。所述抗體也可用來監測治療和/或疾病進展。本領域已知的任何免疫分析系統如以上所列的免疫分析系統，均可用於此目的，包括但不限於採用諸如以下技術的競爭性和非競爭性分析系統放射免疫分析、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、「夾層」免疫分析、沉澱反應、凝膠擴散沉澱反應、免疫擴散分析、凝集分析、補體固定分析、免疫放射分析、螢光免疫分析、A蛋白免疫分析和免疫電泳分析，這僅是列舉幾個實例。
本主題發明的FRMS當用作免疫原時可引發針對病毒病原體的中和抗體。在一個優選的實施方案中，所述FRMS激發產生針對各種初級病毒分離株的中和抗體。在一個具體實施方案中，所述FRMS激發產生針對HIV-1初級分離株的中和抗體。靜態HIV包膜蛋白不能引發的中和抗體能夠至少較弱地結合靜態包膜，而且中和抗體在整個結合和融合過程中均由所述包膜蛋白攜帶，在所述過程中所述抗體完成其與重要中間體結構的高親和性結合。這類中和抗體可有效地運送到在關鍵時刻可用的重要部位，而與細胞作用部位無關，尤其是與膜融合的細胞部位(細胞表面膜或內膜如內體膜)無關。因此，病毒包膜蛋白可用作將抗體(例如與毒素、其它蛋白、疫苗免疫原連接)導入細胞、胞質或組織相容性複合物提呈途徑的載體。
可分析本發明雜交瘤細胞上清液中和同源病毒的能力以及中和一系列遺傳學不同的病毒的能力。中和遺傳學不同的病毒的能力說明，由保守決定簇的mAb識別。此外，可測試mAb對包膜介導的細胞-細胞融合的抑制。也可分析mAb結合和/或免疫沉澱包膜蛋白和含包膜蛋白的結合受體的複合物的能力。特別令人感興趣的是，這些mAb是融合依賴表位特異性的，而且如果有的話，只較弱地結合靜態包膜蛋白。
在一個實施方案中，用高效篩選分析鑑定雜交瘤，以檢測PI病毒中和作用，並表徵mAb以確定PI病毒中和的範圍和分子靶。
在本發明的各種實施方案中，用本發明方法產生的抗體單獨(例如單一mAb)或聯合(例如一種或多種針對相同或不同表位的mAb)使用。抗體的聯合使用可包括針對相同病毒或不同病毒的多種mAb。在本發明的某些實施方案中，可能最好使用針對相同病毒的多種mAb或針對病毒相同FRMS的多種mAb。
5.7．抗體結合的分析以及對病毒感染的抑制可用各種方法分析本發明抗體或其衍生物或類似物結合本發明FRMS，而由此幹擾病毒感染的能力。
可用本領域周知的方法分析結合能力。例如可進行生物分析，其中使已知表達趨化因子受體的細胞與所述mAb衍生物或類似物接觸，檢測並分析其已知作用(例如信號轉導)。或者，可檢測mAb、衍生物或類似物結合趨化因子受體、宿主細胞受體或病毒包膜蛋白的能力，使用的方法包括但不限於蛋白質親和層析、親和印跡、免疫沉澱、交聯和基於文庫的方法如蛋白質探測、噬菌體展示和雙雜交系統(一般參見Phizicky等，1995,Microbiol.Rev.59:94-123)。
可用本領域已知的方法進行mAb、衍生物或類似物結合的高效篩選，包括但不限於流式細胞法。在一個具體實施方案中，用生物素化mAb、衍生物或類似物處理表達人CD4和一種HIV共同受體(例如CCCKR-5、CxC CKR4、CCR5、CXCR4等)的細胞，用抗生物素蛋白FITC綴合物檢測與所述FRMS結合的細胞表面。或者可用本發明的單克隆抗體以下述方式在競爭性結合分析中應用流式細胞儀系統或用本領域已知的任何方法應用流式細胞儀系統。在一個具體實施方案中，標記本發明的mAb，並檢測結合本發明FRMS的能力，與試驗抗體結合相同FRMS的能力進行比較。本發明的試驗抗體可從標本例如受試對象的血清獲得，或者可從生產樣品如雜交瘤上清液獲得。
在另一實施方案中，例如用容易進行的體外分析檢測本發明的mAb、mAb衍生物和/或類似物的抗病毒活性，所述體外分析可測試所述化合物抑制合胞體形成或抑制無細胞病毒感染的能力，並可評價所述化合物對細胞增殖和活力的作用。應用這些分析可測定mAb、衍生物和/或類似物具有的、相對於最適於病毒和病毒株特異性抑制活性的特定病毒或免疫缺陷病毒病毒株製劑的相對抗病毒活性。
在一個實施方案中，細胞融合分析用來測試mAb、衍生物或類似物體外抑制病毒誘導合胞體形成的能力。在一個具體實施方案中，細胞融合分析用來測試本發明mAb衍生物或類似物體外抑制HIV誘導合胞體形成的能力。在該實施方案中，這種分析包括在慢性HIV感染細胞和含有需要分析的mAb、衍生物或類似物的組合物存在下培養未感染的CD4+細胞。對於每一種受試品，測試其一定範圍的濃度。該測試範圍包括沒有加入mAb、衍生物和/或類似物的對照培養。可用本領域一般技術人員周知的標準培養條件。在37℃下培養適當時間例如24小時後，顯微鏡下檢測培養物中存在的多核巨細胞情況，多核巨細胞說明發生了細胞融合和合胞體形成。
在另一實施方案中，用初級巨噬細胞和首次描述的嗜巨噬細胞HIV-1分離株即嗜巨噬細胞分離株HIV-1BaL進行體外感染性分析(參見Gartner等，1986,Science 233:215)。按照該分析，用HIV-1BaL感染按照本領域已知的方法分離的初級巨噬細胞，HIV-1BaL只在初級巨噬細胞中繁殖和維持。所加入的免疫缺陷病毒與初級巨噬細胞在各種濃度受試mAb、衍生物或類似物存在下培養。感染一定時間後，洗滌去除未結合的病毒，培養所述細胞。用本領域已知的技術評價該分析中的病毒複製水平，所述技術包括但不限於測定逆轉錄酶(RT)水平或在感染後不同天數釋放的胞外p24核心抗原。相對於沒有mAb、衍生物或類似物進行的對照分析而言，通過檢測產出的HIV p24水平(或另一病毒感染或複製指標如RT)確定抑制病毒感染或複製的恆定水平。優選所述mAb、衍生物或類似物降低病毒水平，例如相對於在沒有受試化合物進行的對照分析，測得的p24大於或等於50％。用本領域已知的方法如市售的酶聯免疫吸附測定(Coulter,Hialeah,Florida；AbbottLaboratories,Hvalstad,Norway)可確定p24的存在。另一方面，採用標準技術如Goff等(Goff等，1981,J.Virol.38:239-248)和Willey等(Willey等，1988,J.Virol.62:139-147)描述的方法通過監測無細胞上清液可測試RT活性。
在本發明的其它實施方案中，本發明的mAb用初級分離株中和分析進行分析。各種中和分析是本領域已知的，而且屬於本發明範圍。在一個實施方案中，用轉化灶分析mAb。在一個轉化灶分析的實施方案中，在將所述病毒加入宿主細胞中之前使受試抗體與測定量的病毒溫育。用所述病毒蛋白特異性抗體經本領域已知的免疫組化方法染色所述細胞，檢測所述宿主細胞感染。一般而言，平行進行不加入受試抗體的對照分析。與對照感染相比，抑制(例如預防或減輕)感染的受試抗體為中和抗體。在本發明的另一實施方案中，可用PBL測定分析受試抗體的中和作用。在一個PBL測定的實施方案中，使受試抗體與測定量病毒溫育，然後將所述病毒加入宿主細胞中。使宿主細胞培養物培養一定時間後，通過測定宿主細胞上清液樣品中存在的病毒體分析感染情況。一般來說，平行進行其中不加入受試抗體的對照測定。與對照感染相比，抑制(例如預防或減輕)感染的受試抗體為中和抗體。
5.7.1．轉基因小鼠模型本發明包括應用非人類轉基因動物，所用轉基因動物表達其結合導致形成本發明的FRMS的一種或多種組分。在具體的實施方案中，其結合導致形成FRMS的組分可包括本文表Ⅱ和表Ⅲ所列組分。本發明的轉基因動物模型可用作耐受模型和/或感染模型。如果為耐受模型，優選對形成FRMS重要的全部細胞組分都在轉基因動物中表達。如果為感染模型，一種或多種對形成FRMS重要的組分的表達使得，所述轉基因動物能夠感染產生FRMS的病毒。
可應用任何物種的動物來產生表達導致形成FRMS的組分的轉基因動物，所述動物包括但不限於小鼠、大鼠、兔、豚鼠、豬、小豬、山羊、綿羊和非人類靈長類動物，例如狒狒、猴子和猩猩。本文使用的術語「轉基因的」是指以下動物及其子代表達一種或多種其結合導致形成不同物種的FRMS基因序列的組分的動物(例如表達編碼一種或多種其結合導致形成FRMS的組分的人序列的小鼠)；以及經遺傳工程操作，過量表達編碼一種或多種其結合導致形成FRMS的組分的內源性(即相同物種)序列的動物；或者經遺傳工程操作不再表達編碼一種或多種其結合導致形成FRMS的組分的內源性基因序列的動物(即「失效」動物)。
本領域已知的任何技術可用來將其結合導致形成FRMS轉基因的一種或多種組分的編碼基因導入動物，以產生本發明者的轉基因動物品系。這類技術包括但不限於原核微注射(Hoppe和Wagner,1989，美國專利第4,873,19l號)；逆轉錄病毒介導基因導入生殖系(Van derPutten等，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 82,6148-6152)；基因靶入胚胎幹細胞(Thompson等，1989,Cell 56,313-321)；胚胎的電穿孔(Lo,1983,Mol.Cell.Biol.3,1803-1814)；和精子介導的基因轉移(Lavitrano等，1989,Cell 57,717-723)。(這類技術的綜述見Gordon,1989，轉基因動物，Intl.Rev.Cytol.115,171-229)。
本領域已知的任何技術可用來產生轉基因動物克隆，該動物克隆含有一種或多種其結合導致形成FRMS轉基因的組分，例如將誘導至靜止期的培養胚胎、胎兒或成人細胞核核移植入無核卵母細胞中(Campbell等，1996,Nature 380,64-66；Wilmut等，Nature 385,810-813)。
本發明提供在其所有細胞中攜帶一種或多種組分的轉基因的轉基因動物，所述組分的結合導致形成FRMS；以及提供在其部分細胞而不是全部細胞攜帶所述轉基因的動物，即嵌合動物。所述轉基因可以單一轉基因或多聯體例如頭對頭串聯或頭對尾串聯進行整合。按照例如Lasko等(Lasko等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,6232-6236)所述方法也可將所述轉基因選擇性導入特定細胞類型並在其中激活。這種細胞類型特異性激活需要的調節序列取決於特定目的細胞類型，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。當需要將所述轉基因整合入內源性基因的染色體位點時，優選基因靶入。簡而言之，當使用這種技術時，設計含有與所述內源性基因同源的某些核苷酸序列的載體用於整合目的，該整合是通過與染色體序列的同源重組整合入內源性基因並破壞所述內源性基因核苷酸序列的功能。按照例如Gu等(Gu等，1994,Science 265,103-106)所述方法也可將所述轉基因選擇性導入特定細胞類型，因此只在所述細胞類型中失活其結合導致形成FRMS的一種或多種組分的內源性編碼基因。這種細胞類型特異性失活所需要的調節序列取決於特定的目的細胞類型，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。
一旦產生轉基因動物，就可用標準技術分析其結合導致形成FRMS基因的重組組分的表達。可用分析動物組織的DNA印跡分析或PCR技術進行初篩，以分析所述轉基因是否發生整合。採用以下技術也可評價所述轉基因在轉基因動物組織中的mRNA表達水平，所述技術包括但不限於對得自所述動物的組織標本的RNA印跡分析、原位雜交分析和RT-PCR(逆轉錄酶PCR)。也可用所述組分轉基因產物特異性抗體對所述組分基因表達組織標本進行免疫細胞化學評價。
在一個具體實施方案中，本發明包括應用轉基因小鼠開發模型系統，該模型系統使得可篩選用作非小鼠物種疫苗的受試疫苗。在一個優選的實施方案中，所述受試疫苗為用於人類的疫苗。
本發明的轉基因小鼠模型包括構建的這樣的小鼠表達宿主細胞受體和/或小鼠非天然病毒的另一物種的共同受體。這種小鼠用於分析病毒中和作用最好，因為它消除了針對所述宿主細胞受體的中和抗體的作用。這種小鼠提供病毒耐受性模型系統。例如可構建或使用表達人宿主細胞受體的轉基因小鼠，以用於能夠感染人的病毒(例如HIV)。
在本發明的一個實施方案中，疫苗研究利用轉基因小鼠，該轉基因小鼠在將共表達限於胸腺細胞和T輔助淋巴細胞的CD4調節元件控制下表達人CD4和CCR5共同受體(Killeen等，1993,EMBO J.,12:1547-53)。應用這些小鼠，以便可分析病毒中和作用而沒有針對CD4或CCR5的中和抗體的混雜作用。在這方面，所述免疫應答類似於人類；免疫原性表位限於包膜和CD4和共同受體的HIV依賴性構象。雖然對進入後HIV複製的限制迄今限於利用這些小鼠進行感染性研究，但是本發明提供作為HIV疫苗分析系統的一個新用途。在該模型中，所述轉基因的作用僅在於提供對所述疫苗的人CD4和CCR5組分的耐受性。
為了進行所述分析，用本發明的FRMS免疫轉基因小鼠一次或多次。對照免疫原任選用來免疫接種用作對照的其它小鼠。FRMS免疫原可以是本文所述的任何形式，包括細胞裂解物、溶液、交聯結構、分離物、純化物等。FRMS免疫原也可以疫苗製劑導入所述小鼠。
此後，收集FRMS或對照免疫原免疫小鼠產生的血清或抗體並分析其中和PI病毒的能力。在免疫後可在小鼠產生免疫應答的適當時間收集血清。這樣的時間是本領域周知的。在一個實施方案中，每次免疫接種後2周獲取血清。
優選測試血清或抗體中和所述病毒的兩種、三種或四種初級分離株的能力。更優選測試血清或抗體中和所述病毒的四種、六種、八種初級分離株的能力。最優選測試血清或抗體中和所述病毒的10-15、15-25或更多初級分離株的能力。
可用本領域已知的方法分析初級分離株的中和作用，所述方法包括本文所述的方法。在一個實施方案中，通過將所述受試抗體與感染中使用的病毒樣品培養產生的對感染性的抑制作用確定病毒中和作用。抑制(例如減輕或阻止)病毒感染的抗體為中和抗體。在其它實施方案中，測試血清或抗體抑制合胞體形成或抑制無細胞病毒感染的能力，並評價所述化合物對細胞增殖和活力的影響。在本發明的一個優選實施方案中，所述受試抗體為單克隆抗體。在本發明一個更優選的實施方案中，所述受試抗體為在應答FRMS免疫原中產生的人單克隆抗體。對於本領域技術人員顯而易見的是，預期採用得自用對照免疫原免疫小鼠的血清或抗體幾乎不能或不能觀測到抑制感染或中和活性。
在本發明其它實施方案中，對一種以上的初級分離株進行病毒中和分析。在優選的實施方案中，對2-5、5-10、10-15種初級分離株進行病毒中和分析。在一個更優選的實施方案中，對15-20、20-30或30或更多種初級分離株進行中和分析。在另一優選實施方案中，所分析的初級分離株來自一個以上病毒進化枝。
可利用對許多初級分離株的中和百分率表徵中和作用。一般而言，在該實施方案中，用一個分析來評價抗體中和作用。在一個實施方案中，本發明的抗體中和所述病毒的30-40％、40-50％或50-60％初級分離株。在一個優選的實施方案中，本發明的抗體中和所述病毒的60-75％、70-85％或80-90％初級分離株。在一個最優選的實施方案中，本發明的抗體中和所述病毒的90-95％、95-98％或99-100％初級分離株。在優選的實施方案中，當測試mAb對初級分離株的中和作用時，中和作用表示為相對於單獨培養基時的轉化灶數的存在mAb(或雜交瘤上清液)情況下的轉化灶數。
在一個具體實施方案中，用HIV FRMS免疫原(與U87-CD4-CCR5細胞共培養的交聯COS-env)或細胞對照(單獨或與模擬轉染的COS細胞共培養的U87-CD4-CCR5細胞)免疫轉基因小鼠(hu CD4+,huCCR5+，小鼠CD4+)。用表達CCR5或CXCR4共同受體的U87-CD4細胞測定同源168P病毒對疫苗血清的中和作用的敏感性(參見LaCasse等，1998,Science 72:2491；Follis,K.E.等，1998,Journal ofVirology 72:7603)。
在本發明的另一具體實施方案中，其中在中和分析中使用HIV初級分離株，這類初級分離株可包括但不限於92US657、92US660、92TH014、89.6、320NSI、320SI、SHIV89.6P、168P、92RW023、92UG031、92UG037、92RW008、93IN101、93IN999、93IN905、93IN904、92UG035、92UG021、92UG024、92UG046、92TH023、92TH024、93TH051和93TH053。
在本發明的一個實施方案中，用本發明方法(參見5.6小節)產生的抗HIV FRMS的抗體能夠中和60-70％、70-80％、80-85％這類HIV初級分離株。在一個優選的實施方案中，產生的抗HIV FRMS的抗體能夠中和80-90％、90-95％或95-99％這類HIV初級分離株。在一個最優選的實施方案中，產生的抗HIV FRMS的抗體能夠中和100％這類HIV初級分離株。
在另一具體實施方案中，HIV初級分離株可包括進化枝A、B、C、D、E、F、G、H或I的一種或多種分離株。在其它實施方案中，HIV初級分離株可包括M組、O組或N組中的一種或多種分離株。
在另一實施方案中，用本領域已知的方法可證實中和活性是抗體介導的。例如可將血清吸附在含有A蛋白和G蛋白的固體支持物上。在抗體與所述血清的病毒中和活性有關時，預期去除A蛋白和G蛋白結合蛋白的血清幾乎沒有或沒有病毒中和活性，而預期A蛋白和G蛋白固體支持物的洗出液具有病毒中和活性。
因此，本發明提供篩選具有疫苗作用的分子結構的方法，包括用所述分子結構免疫轉基因非人類哺乳動物，其中所述轉基因非人類哺乳動物由一個或多個轉基因表達人CD4和HIV共同受體；然後檢測所述哺乳動物產生的抗HIV的任何中和抗體。
本發明還提供篩選具有疫苗作用的分子結構的方法，包括用所述分子結構免疫轉基因非人類哺乳動物，其中所述轉基因非人類哺乳動物由一個或多個轉基因表達所述一種或多種宿主細胞膜蛋白；以及檢測所述哺乳動物產生的抗所述病毒的任何中和抗體。
5.7.2．疫苗效能的測定可用本領域已知的任何免疫測定通過監測用所述FRMS免疫接種後的受試動物的免疫應答，測定所述一種或多種本發明免疫原的免疫效力。體液(抗體)應答和/或細胞介導的免疫性的產生可說明發生了免疫應答。受試動物可包括小鼠、倉鼠、狗、貓、猴子、兔子、黑猩猩等，甚至人類受試者。
如本文5.10小節所述，導入疫苗的方法可包括口服、腦內、皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內免疫接種或任何其它標準免疫接種途徑。可用各種方法分析受試者的免疫應答，所述方法例如用已知技術如酶聯免疫吸附測定(ELISA)、免疫印跡、放射免疫分析(RIA)、放射免疫沉澱等測定獲得的免疫血清對本發明所述免疫原的反應性。另一方面，保護免疫宿主避免感染所述病原體和/或減輕免疫宿主感染所述病原體產生的症狀可用作疫苗效能的證據。
作為測試病毒疫苗的合適動物的一個實例，可測試本發明疫苗在兔體內誘導抗所述FRMS免疫原的抗體應答的能力。可使用雄性沒有特定病原體(SPF)剛成年的紐西蘭白兔。各試驗組接受固定濃度的疫苗。對照組注射不含FRMS免疫原的1mM Tris-HCl pH9.0。每周或每隔一周從兔子取血樣，並分析血清中的抗FRMS抗體。例如用ELISA分析所述免疫原特異性抗體的存在情況。
在本發明的一個優選實施方案中，測試病毒疫苗效能的動物是應用本文5.7.1小節所述的轉基因小鼠模型。
本發明還提供優化和定量含有所述主題FRMS的疫苗的方法。優選用對宿主細胞組分無反應性的自體細胞製備所述主題複合物。但是，可用經遺傳工程後對所述複合物的宿主細胞組分耐受的轉基因動物，評價含有用非自體細胞製備的複合物的疫苗組合物。用這些轉基因動物，可確定用本主題發明的融合複合物免疫接種獲得的成功免疫是否是由所述複合物提供的新型可融合表位產生的。例如在一個優選實施方案中，所述FRMS產生自HIV(168P)病毒包膜蛋白和人蛋白CD4及CCR5的相互作用。如小節6所述，可在經遺傳工程後對所述疫苗的人類組分耐受的轉基因小鼠體內測試疫苗組合物。同時表達人CD4受體和人CCR5共同受體的小鼠用來評價所述複合物，證實所產生的中和抗體針對限於包膜蛋白或HIV依賴性CD4和共同受體的構象的免疫原性表位。值得注意的是，這些轉基因小鼠最初是用作HIV感染小鼠模型。利用轉基因動物篩選疫苗免疫原是這些小鼠的一個新用途。對疫苗的宿主部分耐受的轉基因小鼠可用來優化疫苗組分、測試變異因素和評價佐劑。
此外，對本領域技術人員顯而易見的是，此原理適用於任何病毒模型，以提供快速安全的篩選病毒疫苗的方法。另外，顯而易見的是，轉基因小鼠以外的轉基因動物也可用來篩選候選疫苗。
在一個實施方案中，本發明提供篩選具有疫苗效力的分子結構的方法，包括用分子結構免疫轉基因非人類哺乳動物，所述分子結構含有因為(a)包膜病毒的包膜蛋白和(b)一種或多種細胞膜蛋白結合形成的表位，所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在合適的條件下必須並足以融合所述病毒包膜與含有所述細胞膜蛋白的細胞膜，其中所述轉基因非人類哺乳動物由一種或多種轉基因表達所述一種或多種宿主細胞膜蛋白；以及檢測由所述哺乳動物產生的抗所述病毒的任何中和抗體。在一個優選的實施方案中，分離所述分子結構。
在一個具體實施方案中，本發明提供篩選具有疫苗效力的分子結構的方法，包括用分子結構免疫轉基因非人類哺乳動物，所述分子結構含有因為(a)裝配入所述病毒包膜的HIV包膜蛋白或其突變體；和(b)人CD4和HIV融合的共同受體結合形成的表位，其中所述轉基因非人類哺乳動物由一種或多種轉基因同時表達人CD4和HIV共同受體；以及檢測由所述哺乳動物產生的抗HIV的任何中和抗體。在一個優選實施方案中，所述哺乳動物是小鼠。在另一優選實施方案中，分離所述分子結構。
5.8．抗體的用途用本發明抗體的疫苗製劑產生的抗體可用於本領域已知的方法。例如用本發明FRMS免疫接種產生的抗FRMS或疫苗免疫原的抗體也具有以下潛在用途診斷性免疫分析、被動免疫療法、去病毒汙染、抗病毒治療以及預防和產生抗獨特型抗體。
本主題發明還包括用本主題發明的FRMS的新表位引發的抗體，包括可用作參考標準品和診斷檢測和試劑盒組分的抗體。此外，抗本主題發明FRMS的mAb可用作參考標準品、體外和體內生物檢測的診斷試劑和用作結合和融合中的重要決定簇的標記物。例如在大規模生產本發明的FRMS的過程中，本發明的mAb可用於測定每批產生的FRMS量。在該實施方案中，mAB可用來測定批與批之間的變異量(例如利用mAb的ELISA或RIA)。另一方面，可使用標記FRMS，用於和受試FRMS進行結合FRMS特異性mAb的競爭性測定。
相似的分析可用來測定受試者血清標本的抗體滴度。在這種測定中，在給予本發明疫苗後某一時間取受試者血清標本。然後測試血清標本中和病毒的能力。也可測試血清結合免疫原FRMS或與結合免疫原FRMS的中和mAb競爭的能力。如果血清標本中和病毒或結合FRMS的能力沒有或較弱，說明需要用FRMS免疫原加強免疫接種所述受試者。因此，本發明提供在預先給予一定量的所述分子結構的受試者中監測抗所述分子結構的抗體的產生的方法，包括從所述受試者分離標本包括血清；和檢測所述血清中存在的抗所述分子結構的任何抗體。在一個實施方案中，用一種方法進行檢測，所述方法包括用抗所述分子結構的標記抗體進行競爭性免疫測定。
此外，可將多克隆血清或單克隆抗體給予各種個體，以治療或預防病毒感染及其病症。在具體實施方案中，可通過被動免疫給予這種抗體，用於接觸病原體後的預防或防止母親將病毒傳染給新生兒。本發明的人源化mAb可用於對母嬰病毒傳遞的保護或接觸後的預防或治療。本發明的mAb也可用於HIV感染的hu-PBL-scid小鼠模型的被動免疫研究以及恆河猴(rhesus macaques)的SHIV研究。所以，本發明提供在人類胎兒治療或預防HIV感染的方法，包括給予懷有所述胎兒的妊娠婦女治療或預防所述胎兒HIV感染的有效量的所述單克隆抗體。
抗本主題發明的FRMS的mAb的產生可用來進一步闡明感染的生化和免疫化學途徑，以及定義PI病毒中和作用的重要表位。所產生的抗本主題發明的FRMS的單克隆抗體(mAb)可用來解析結合和進入的生物化學基礎和初級分離病毒的中和作用的免疫化學基礎。在該實施方案中，應該選擇免疫原用於產生適用於在免疫接種模型的免疫原性研究的MAb，該免疫原是有效的免疫原並激發產生初級分離病毒的各種中和抗體。
本發明的抗體也可用於產生抗獨特型抗體。然後抗獨特型抗體可再用於免疫接種，產生結合致病微生物的初始抗原的亞群抗體(Jerne,1974,Ann.Immunol.(Paris)125c:373；Jerne等，1982,EMBO J.1:234)。
另外，mAb也可用作血液和血液製品的抗病毒劑。本發明提供可用作血液或血液製品去除汙染的添加劑的中和抗體，所述血液或血液製品汙染或懷疑汙染病毒。例如本發明的mAb可用作獻血者血液(例如血庫血液)的添加劑，所述血液將用於治療患者。本發明的mAb可用作血液收集袋、手套、血液標本收集器等的添加劑。在所述實施方案的具體實施中，本發明的一種或多種mAb用來在生產前清洗產道，以防止產期感染。用於血液和血液製品添加劑的本發明的mAb的有效量為1μg/ml-10mg/ml。對本領域技術人員顯而易見的是，有效量受抗體親和力、添加劑和製劑的影響。所以可使用任何量，使得所述有效量能夠抑制(例如減輕或預防)病毒感染。在一個優選的實施方案中，抗各種病毒的中和mAb的混合物可用於消除汙染。在一個具體實施方案中，在人血液輸入接受的患者之前在這種人血標本中加入有效量的HIV免疫特異性的本發明的中和mAb。在該實施方案中，所述mAb中和HIV。因此，本發明提供其中加入抑制或減輕所述病毒感染的有效量的抗體的哺乳動物血液標本。在一個具體實施方案中，本發明提供其中加入抑制或減輕HIV感染有效量的抗體的人血液標本。本發明還提供抑制血液標本中的病毒感染的方法，包括使所述血液標本接觸抑制所述病毒感染的有效量的所述單克隆抗體。在一個具體實施方案中，本發明提供抑制人血液標本中的HIV感染的方法，包括使所述人血液標本與抑制HIV感染有效量的所述單克隆抗體接觸。
本發明的中和抗體也可用於接觸了所述抗體針對的病毒的任何物體的去除汙染。可用本發明的mAb去除汙染的物體包括但不限於外科和牙科器械(例如鑽機、拔牙器、解剖刀等)。在一個優選的實施方案中，抗各種病毒的中和mAb混合物用於去除汙染。在一個優選的實施方案中，用本發明的一種或多種mAb去除不容易處理的物體(例如計算機輔助工具、機器人輔助工具、特殊工具等)的汙染。本發明的mAb去除汙染的有效量範圍為1μg/ml-10mg/ml。對本領域技術人員而言顯而易見的是，有效量受抗體親和力、添加劑和製劑的影響。可使用任何量，使得所述有效量能夠在去汙染後抑制病毒感染。在一個具體實施方案中，在去汙染中中和HIV。因此，本發明提供去除外科或牙科工具汙染的方法，包括使所述工具與抑制所述病毒感染有效量的所述單克隆抗體接觸。在一個具體實施方案中，本發明提供去除外科或牙科工具汙染的方法，包括使所述工具與抑制HIV感染有效量的所述單克隆抗體接觸。
在本發明的另一實施方案中，針對FRMS的抗體可用來篩選包含所述抗體識別的表位的分子。例如本發明的mAb可用來篩選存在抗體識別表位的小分子。在一個實施方案中，所述mAb結合所述小分子說明，所述小分子上存在這種表位。還可測試作為有效免疫原或治療藥物的所述小分子。在另一實施方案中，本發明的mAb可用來鑑定與所述抗體結合的肽(例如得自噬菌體展示文庫)。可測試這類肽的例如免疫原性(即模擬表位(mimetope))。
本發明的mAb也可用作避孕產品或殺微生物產品的抗病毒劑。對於已知性傳播的病毒而言，特別優選在避孕產品或殺微生物產品中加入一種或多種本發明的mAb。因此，本發明提供含有有效量的一種或多種本發明中和mAb的避孕產品。其中可加入本發明的mAb的避孕產品或殺微生物產品包括但不限於乳膏、泡沫狀物、凝膠、軟膏、保險套、隔膜等。所述避孕產品可還含有殺精子劑。在一個優選的實施方案中，在所述避孕產品中使用抗各種病毒的中和mAb的混合物。避孕產品或殺微生物產品中的本發明mAb的有效量為1μg/ml-10mg/ml。對本領域技術人員而言顯而易見的是，有效量受抗體親和力、添加劑和製劑的影響。可使用任何量，使得所述有效量能夠抑制(例如減輕或防止)病毒感染。例如用於抗病毒的避孕產品的有效量為當接觸性傳播病毒時能夠抑制感染的劑量。在一個具體實施方案中，所述避孕產品或殺微生物產品含有HIV或其它性傳播病毒免疫特異性的本發明的mAb。所以，本發明提供含有抑制或減輕所述病毒感染的有效量的本發明抗體的避孕產品或殺微生物劑，其形式為凝膠、泡沫狀物、乳膏或軟膏。在一個具體實施方案中，本發明提供含有抑制或減輕HIV感染的有效量的本發明的抗體的避孕產品或殺微生物劑，其形式為凝膠、泡沫狀物、乳膏或軟膏。
5.9．治療組合物本發明提供通過給予FRMS在受治療者激發產生抗FRMS抗體的方法。本發明的任何一種FRMS及其功能活性片段、類似物和衍生物；編碼本發明FRMS及其功能活性片段和衍生物的核酸；以及免疫特異性結合FRMS的抗體均可用作治療藥物(本文稱為「治療藥物」)。
本發明還提供藥用組合物。這類組合物含有治療有效量的治療藥物和藥學上可接受的載體。在一個具體實施方案中，術語「藥學上可接受的」是指通過聯邦政府或州政府管理機構批准或列於美國藥典或其它周知的藥典的適用於動物以及更具體適用於人類。術語「載體」是指與所述治療藥物一起給予的稀釋劑、佐劑、賦形劑或溶媒。這類藥用載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油、動物油、植物油或合成來源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內給予所述藥用組合物時，水為優選載體。鹽水溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液體載體，特別適用於注射溶液。合適藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石粉、氯化鈉、幹脫脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等。必要時，所述組合物還可含有微量溼潤劑或乳化劑或pH緩衝劑。這些組合物可以為溶液、懸浮劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、散劑、緩釋製劑等形式。所述組合物還可以用傳統粘合劑和載體如甘油三酯配製為栓劑。口服製劑可以包含標準載體，例如藥用級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適藥用載體實例描述於E.W.Martin的「Remington’sPharmaceutical Sciences」。這類組合物含有治療有效量的所述治療藥物、優選為純的形式，以及含有適量載體以獲得適合給予所述患者的藥物形式。所述製劑應該適合給藥模式。
在一個優選的實施方案中，按照常規方法將所述組合物配製為適合靜脈內給予人類患者的藥用組合物。通常，用於靜脈內給予的組合物為無菌等滲緩衝水溶液。必要時，所述組合物還可含有增溶劑和局部麻醉劑如利多卡因，以減輕注射部位的疼痛。一般來說，所述成分或者分開提供或者以單位劑型混合在一起提供，例如為標有活性成分量的密封容器如安瓿或小藥袋中的凍乾粉或無水濃縮物。當輸注給予所述組合物時，可將其分散在含有無菌藥用級水或鹽水的輸液瓶中。當注射給予所述組合物時，可提供一安瓿無菌注射用水或鹽水，以便可以在給藥前混合所述成分。
本發明的治療藥物可配製為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括與游離氨基形成的鹽，例如產生自鹽酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等的鹽和與游離羧基形成的鹽，例如產生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、脯氨酸等的鹽。
5.10．基因治療基因治療是指通過給予患者核酸分子進行的治療。在本發明的該實施方案中，所述核酸分子產生其編碼的蛋白，並通過體內形成FRMS介導治療作用。
在一個具體實施方案中，作為基因治療，給予核酸分子產生針對FRMS的免疫應答，所述核酸分子含有其結合產生本發明的FRMS或其功能衍生物的一種或多種組分的編碼序列。在更具體的實施方案中，給予一種核酸或多種核酸進行基因治療，所述核酸編碼包膜病毒的病毒包膜蛋白、宿主細胞受體和宿主細胞共同受體或它們的功能衍生物。在其它實施方案中，給予包膜病毒的病毒包膜蛋白進行基因治療。
可按照本發明使用本領域可用的任何一種基因療法。典型的方法描述如下。
關於基因治療方法的綜述，參見Goldspiel等，1993,ClinicalPharmacy 12:488-505；Wu和Wu,1991,Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan,1993,Science260:926-932；Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；和May,1993,TIBTECH 11:155-215)。可使用的本領域周知的重組DNA技術的方法描述於Ausubel等(編輯),1993,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley Sons,NY)和Kriegler,1990,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY。
在一個優選的具體實施方案中，所述治療藥物在合適宿主體內含有HIV包膜蛋白和人CD4受體以及共同受體(例如趨化因子受體CCR5或CXCR4)。在另一具體實施方案中，使用核酸分子，其中將所述HIV包膜蛋白編碼序列傳遞給患者，所述患者表達天然CD4和天然共同受體。
將所述核酸傳遞給患者可以是直接傳遞或間接傳遞，在直接傳遞的情況下所述患者直接與所述核酸或攜帶核酸的載體接觸，在間接傳遞的情況下首先用所述核酸體外轉化細胞，然後再將轉化細胞植入所述患者體內。這兩種方法分別稱為體內和來自體內的基因治療。
在一個具體實施方案中，所述核酸直接給予體內，然後在體內表達產生所編碼的產物。用本領域已知的眾多方法中的任何一種可達到此目的，例如構建其成為合適核酸表達載體的一部分，並將其例如用以下方法給予使其達到細胞內用缺陷型或減毒逆轉錄病毒載體或其它表達載體感染(參見美國專利第4,980,286號)、或直接注射裸DNA、或應用微粒轟擊(例如基因槍；生物彈道(Biolistic),Dupont)、或用脂質或細胞表面受體或轉染劑包衣、或用脂質體、微粒或微膠囊包囊、或將其與已知進入細胞核的肽連接給予、或將其與經受受體介導的胞吞的配體連接給予(參見例如Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)，所述配體可用來靶向特異性表達所述受體的細胞類型，等方法。在另一實施方案中，可製備核酸配體複合物，其中所述配體含有破壞內體的融合病毒肽，防止溶酶體降解所述核酸。在再一實施方案中，通過靶向特異性受體可在體內靶向所述核酸，使得細胞特異性攝取並表達所述核酸(參見例如Wu等的國際專利公開WO 92/06180,Wilson等的WO 92/22635,Findeis等的WO 92/20316,Clarke等的WO93/14188和Young的WO 93/20221)。另一方面，可將所述核酸導入細胞內，並通過同源重組摻入宿主細胞DNA中進行表達(Koller和Smithies,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935,Zijlstra等，1989,Nature 342:435-438)。
在一個具體實施方案中，使用含有編碼病毒包膜蛋白的核酸的表達載體和宿主細胞膜蛋白(例如宿主細胞受體)。5.1.2小節描述的任何一種病毒載體可用於基因治療目的。例如可使用逆轉錄病毒載體(參見Miller等，1993,Meth.Enzymol.217:581-599)。可以對這些逆轉錄病毒載體進行修飾，使其缺失包裝病毒基因組和整合入宿主細胞DNA非必需的逆轉錄病毒序列。說明在基因治療中應用逆轉錄病毒載體的其它參考文獻包括Clowes等，1994,J.Clin.Invest.93:644-651,Kiem等，1994,Blood 83:1467-1473,Salmons和Gunzberg,1993,Human Gene Therapy 4:129-141，以及Grossman和Wilson,1993,Curr.Opin.in Genetics and Devel.3:110-114。
如5.1.2小節所述，腺病毒為可用於基因治療的其它病毒載體。腺病毒是用於傳遞基因至呼吸道上皮的特別引人注目的載體。腺病毒基的傳遞系統的其它靶是肝臟、中樞神經系統、內皮細胞和肌肉。腺病毒的優勢是能夠感染非分裂細胞。Kozarsky和Wilson,1993,CurrentOpinion in Genetics and Development 3:499-503綜述了腺病毒基基因治療。Bout等，1994,Human Gene Therapy 5:3-10，證實應用腺病毒載體將基因轉移入恆河猴呼吸道上皮。腺病毒用於基因治療的其它實例可見於Rosenfeld等，1991,Science 252:431-434,Rosenfeld等，1992,Cell 68:143-155，和Mastrangeli等，1993,J.Clin.Invest.91:225-234。
還建議腺伴隨病毒(AAV)用於基因治療(Walsh等，1993,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300)。
基因治療的另一種方法涉及用以下這類方法將基因導入組織培養細胞中電穿孔、脂質轉染、磷酸鈣介導的轉染或病毒感染。關於本發明的基因治療方面可使用將基因導入細胞的本領域已知的任何一種方法，包括但不限於5.1.2小節所述的方法。一般來說，基因轉移方法包括將選擇標記導入所述細胞。然後使細胞處於選擇狀態下，分離攝取並表達導入基因的細胞。然後將這樣的細胞傳遞給患者。
在該實施方案中，在體內給予獲得的重組細胞之前，將所述核酸導入細胞中。可用本領域已知的任何一種方法進行這種基因導入，所述方法包括但不限於轉染、電穿孔、微注射、用含有所述核酸序列的病毒載體或噬菌體載體感染、細胞融合、染色體介導的基因轉移、微細胞介導的基因轉移、原生質球融合等。本領域已知的許多技術可用於將外源基因導入細胞(參見例如Loeffler和Behr,1993,Meth.Enzymol.217:599-618,Cohen等，1993,Meth.Enzymol.217:618-644,Cline,1985,Pharmac.Ther.29:69-92)，並可按照本發明使用，前提是不能破壞受體細胞的必需的生長和生理功能。應該提供將所述核酸穩定導入細胞的技術，使得所述細胞可表達所述核酸，而且其子細胞可遺傳性獲得並表達所述核酸。
可用本領域已知的各種方法將獲得的重組細胞傳遞給患者。在一個優選的實施方案中，例如通過皮下注射注入上皮細胞。在另一實施方案中，可作為皮膚移植物將重組皮膚細胞移植給患者。優選靜脈內給予重組血液細胞(例如造血幹細胞或造血祖細胞)。預計應用的細胞量取決於所需要的效應、患者病況等，對此本領域技術人員可確定。
用於基因治療的其中可導入核酸的細胞包括任何一種需要的可用細胞類型，而且包括但不限於上皮細胞、內皮細胞、角質細胞、成纖維細胞、肌肉細胞、肝細胞和血液細胞，例如T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨核細胞、粒細胞；各種幹細胞或祖細胞，尤其是造血幹細胞或造血祖細胞例如得自骨髓、臍帶血、外周血、胎兒肝臟等的造血幹細胞或造血祖細胞。
在一個優選的實施方案中，用於基因治療的細胞為所述患者的自體細胞。
在一個其中重組細胞用於基因治療的實施方案中，使用編碼其結合導致形成FRMS的組分的核酸分子。在一個具體實施方案中，例如所述核酸編碼HIV病毒包膜蛋白、人CD4和共同受體(例如趨化因子受體CCR5或CXCR4)。將所述編碼核酸分子導入所述細胞中，使得所述細胞或其子細胞可表達所述基因，然後將所述重組細胞體內給予達到治療的作用。在一個具體實施方案中，使用幹細胞或祖細胞。可按照本發明的該實施方案有效地使用任何一種可分離並體外維持的幹細胞和/或祖細胞。這類幹細胞包括但不限於造血幹細胞(HSC)、諸如皮膚和腸道上皮的上皮組織的幹細胞、胚胎心肌細胞、肝臟幹細胞(國際專利公開WO 94/08598)和神經幹細胞(Stemple和Anderson,1992,Cell 71:973-985)。
在一個具體實施方案中，為基因治療目的導入的核酸含有與所述編碼區有效連接的誘導型啟動子(參見5.1.2小節)，使得所述核酸的表達可受合適轉錄誘導物存在與否的控制。
可用於傳遞編碼導致形成本發明的FRMS的組分的核酸分子的其它方法，對於本領域技術人員而言是顯而易見的，而且屬於本發明範圍。
因此，本發明提供治療或預防受試者病毒感染的方法，包括給予所述受試者(a)第一種編碼包膜病毒的包膜蛋白的核酸；和(b)第二種編碼一種或多種細胞膜蛋白的核酸，所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在合適的條件下必須並足以融合所述病毒包膜與含有所述細胞膜蛋白的細胞膜，這樣使得所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在所述受試者體內表達，並產生針對所述病毒的中和抗體。在一個實施方案中，所述方法中的第一種和第二種核酸是相同的。在另一實施方案中，所述第一種和第二種核酸是不同的核酸載體。在一個具體實施方案中，所述包膜蛋白是HIV包膜蛋白，而所述細胞膜蛋白是CD4和HIV共同受體。
5.11．給予方法本發明提供治療和預防病毒感染和疾病的方法，包括給予需要這種治療的受試者治療或預防有效量的本發明的治療藥物。所述受試者優選動物，包括但不限於如猴子、母牛、豬、馬、雞、貓、狗等動物，優選哺乳動物，最優選人。在一個具體實施方案中，所述受試者為非HIV感染的人類個體。
各種傳遞系統是已知的，並可用來給予本發明的治療藥物，例如脂質體包囊、微粒、微膠囊、能夠表達所述治療藥物的重組細胞、受體介導的胞吞(參見例如Wu等，1987,J.BIol.Chem.262:4429-4432)、構建作為逆轉錄病毒或其它載體的一部分的治療核酸等。導入方法包括但不限於皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口服途徑。可用任何常規途徑給予所述化合物，例如通過輸注或大劑量注射、通過上皮或皮膚黏膜(例如口腔黏膜、直腸和腸道黏膜等)吸收，而且所述化合物可與其它生物活性劑一起給予。給藥可以是系統性給藥或局部給藥。此外，最好是將含有抗體的本發明的藥用組合物通過任何合適途徑導入中樞神經系統，包括腦室內和鞘內注射；採用例如連接於儲存器(例如Ommaya儲存器)腦室內導管有助於腦室內注射。也可以例如應用吸入器或霧化器和含有氣霧劑的製劑進行肺部給藥。
在一個具體實施方案中，最好將含有抗體的本發明的藥用組合物局部給予到需要治療的部位；用下述方法可達到此目的，例如(不是為了限制本發明)局部應用、注射、導管、栓劑或植入物，所述植入物是有孔、無孔或凝膠物質，包括膜(如sialastic膜)，或纖維。在一個高度具體的實施方案中，本發明的藥用組合物給予到懷疑接觸了HIV的人體開放性傷口。
在另一實施方案中，所述治療藥物可用一種載體尤其是脂質體傳遞(參見Langer,1990,Science 249:1527-1533；Treat等，1989，載於Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein和Fidler(編輯)，Liss,New York，第353-365頁；Lopez-Berestein,Science，第317-327頁；全面參閱Science)。
在又一實施方案中，所述治療藥物用控釋系統傳遞。在一個實施方案中，可使用一種泵(參見Langer，同上；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwald等，1980,Surgery 88:507；Saudek等，1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一實施方案中，可使用聚合物(參見Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(編輯)，CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)；Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performanc,Smolen和Ball(編輯),Wiley,New York(1984)；Ranger等，1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；還參見Levy等，1985,Science 228:190；During等，1989,Ann.Neurol.25:351；Howard等，1989,J.Neurosurg.71:105)。在再一實施方案中，可將控釋系統置於治療靶附近，因此只需要所述系統劑量的一部分(參見例如Goodson，載於醫用控釋，1984，同上，第二卷，第115-138頁)。
Langer的綜述討論了其它控釋系統(Langer,1990,Science 249:1527-1533)。
必要時，所述組合物可用一個包裝或分配器提供，所述包裝或分配器可裝有含所述活性成分的一個或多個單位劑型。所述包裝可以例如包括金屬箔或塑料箔，如泡罩包裝。所述包裝或分配器可帶有使用說明書。也可以製備在匹配藥用載體中配製的含有本發明化合物的組合物，將其裝於合適容器中並標示治療適應症。
5.12．證實抗HIV效用本發明提供測試針對HIV-FRMS的抗體的抗HIV作用。本發明還提供通過分析血清標本中的抗體監測FRMS疫苗在患者或受試對象的效用的方法，所述血清標本得自疫苗接種後的所述患者或受試對象。優選體外測試本發明的治療藥物，然後在用於人類之前體內測試其所需要的治療或預防活性。本領域已知的任何檢測病毒感染或產生的體外或體內分析均可用來測試本發明治療藥物的功效。
在本發明的一個實施方案中，提供篩選含有mAb的製劑的抗HIV活性的方法，該測定方法包括分析所述製劑或部分抑制HIV感染的能力。
舉例來說，為了體外測定治療藥物，人們可以檢測所述治療藥物對培養細胞的HIV感染的作用。簡而言之，用本領域已知的體外急性感染細胞的滴度(例如105TCID50/ml)的HIV-1急性感染培養的造血細胞(例如初級PBMC、分離的巨噬細胞、分離的CD4+T細胞或培養的H9人T細胞)。然後在所述細胞培養基中加入適量所述治療藥物。在感染後3天和10天通過用ELISA測定檢測HIV抗原水平，測定培養物的HIV-1產生水平。如果HIV抗原水平較未處理的對照的觀測水平低，則說明所述治療藥物對治療HIV感染是有效的。或者，任何市售HIV ELISA可用作所述治療藥物治療前和治療後的比較分析。
此外，對HIV-1 LTR驅動的轉錄的測定可用於測試本發明治療藥物的功效。具體地說，將報導基因克隆入DNA質粒構建物，使得HIV-1LTR啟動子驅動報導基因的轉錄，報導基因即其編碼蛋白或RNA產物容易檢測的基因，例如但不限於氯黴素乙醯轉移酶(CAT)基因。然後將獲得的構建物通過轉染或本領域已知的任何其它方法導入培養的細胞系，例如但不限於人CD4+T細胞系HUT 78。在所述轉化細胞與所述治療藥物接觸後，通過用本領域常規技術檢測CAT活性，測量HIV-1LTR驅動的轉錄。HIV-1 LTR驅動的轉錄降低，證實所述治療藥物對治療和/或預防HIV感染的功效。
在動物模型中的典型試驗描述於本文5.7.1.小節。
也可用SIV感染的恆河猴(參見Letrin,N.L.等，1990,J.AIDS 3:1023-1040)、尤其是感染SIVmac251的恆河猴確定本發明治療藥物的功效，所述SIV病毒株在實驗性感染猴子誘導非常類似於人類AIDS的症候群(Kestler,H.等，1990,Science 248:1109-1112)。具體來說，用無細胞SIVmac251例如滴度為104.5TCID50/ml感染猴子。根據在PBMC中出現的SIV p27抗原監測感染。所述治療藥物的作用特徵為標準體重增加、PBMC中的SIV滴度降低和CD4+T細胞增加。或者使用SHIV模型，其中HIV env蛋白構建入SIV骨架中。在一個實施方案中，用含有表達HIV env的細胞和表達恆河猴CD4和CCR5共同受體的細胞的FRMS疫苗免疫猴子。如果獲得足夠的體外中和作用，則用帶有中和敏感的HIV env的傳染性SHIV病毒攻擊動物。具體地說，用含有一種或多種FRMS的免疫原免疫猴子，然後用SHIV 89.6P初級分離株攻擊(參見例如Montefiori等，1998,J.Virol.72:3427-31)。
一旦在體外、而且還優選在非人類動物模型測試所述治療藥物後，就可在人類對象確定所述治療藥物的作用。可通過測量HIV感染和HIV相關疾病的各種參數評價治療藥物的治療功效。具體來說，通過利用定量RT-PCR(Van Gemen,B.等，1994,J.Virol.Methods 49:157-168；Chen,Y.H.等，1992,AIDS 6:533-539)定量測定血漿HIV-1RNA或者通過測定分離的PBMC的病毒產生情況，可確定病毒負荷的變化。通過共培養所述對象的PBMC和未感染的PBL細胞，然後用ELISA測定測量p24抗原水平來測定HIV-1滴度，確定PBMC的病毒產生情況(參見例如Wrin,T.等，1995,Science 69:39；Popovic,M.等，1984,Science 204:497-500)。通過評價CD4+T細胞水平變化、體重或任何其它與HIV感染或AIDS或AIDS相關症候群(ARC)相關的生理情況，也可評價給予的所述治療藥物。HIV病毒負荷或產生減少、CD4+T細胞增加或HIV相關症狀緩解證實給予的治療藥物在治療/預防HIV感染中的作用。
5.13．試劑盒本發明還涉及含有可融合蛋白複合物或由這類複合物產生的抗體的試劑盒。包含所述主題複合物或抗體的試劑盒可用來分析各批疫苗品質、進行穩定性研究或制定疫苗合格標準。抗體和所述複合物也可用於檢測在所述宿主系統存在的抗體或病毒的診斷試劑盒。例如抗體或所述主題複合物可用作試劑盒中的底物或試劑，提供標準診斷酶聯免疫吸附測定(ELISA)或競爭性ELISA。
本發明還提供包括一個或多個容器的藥用包裝或試劑盒，所述容器中含有本發明疫苗製劑的一種或多種成分。這類容器附有管理藥品或生物製品的生產、使用或銷售的政府管理機構規定形式的通知，該通知說明本品獲得該機構批准進行用於人類用藥的生產、應用或銷售。
在一個實施方案中，本發明提供在一個或多個容器中含有抗一種分子結構的標記單克隆抗體的試劑盒，所述分子結構含有因為(a)包膜病毒的編碼蛋白，與(b)一種或多種細胞膜蛋白結合形成的表位，所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在合適的條件下必須並足以融合所述病毒包膜和含有所述細胞膜蛋白的細胞膜。在一個進一步的實施方案中，本發明提供在獨立容器中還含有一種分子結構的試劑盒，所述分子結構含有因為(a)包膜病毒的編碼蛋白，與(b)一種或多種細胞膜蛋白結合形成的表位，所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在合適的條件下必須並足以融合所述病毒包膜和含有所述細胞膜蛋白的細胞膜。
在一個具體實施方案中，本發明提供在一個或多個容器中含有抗一種分子結構的標記單克隆抗體的試劑盒，所述分子結構含有因為(a)裝配入病毒包膜的HIV包膜蛋白或其突變體，與(b)人CD4和HIV融合共同受體結合形成的表位。在一個進一步的實施方案中，本發明提供在獨立容器中還含有一種表位的試劑盒，所述表位因為(a)裝配入病毒包膜的HIV包膜蛋白或其突變體；與(b)人CD4和HIV融合共同受體結合而形成。
在一個實施方案中，本發明提供在一個或多個容器中含有一種分子結構的試劑盒，所述分子結構含有因為(a)包膜病毒的編碼蛋白，與(b)一種或多種細胞膜蛋白結合形成的表位，所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在合適的條件下必須且足以融合所述病毒包膜和含有所述細胞膜蛋白的細胞膜。在一個優選的實施方案中，分離所述分子結構。在又一實施方案中，本發明提供還含有藥學上可接受的載體的試劑盒，而且其中所述分子結構的量為免疫劑量。
在另一實施方案中，本發明提供在一個或多個容器中含有(a)第一種編碼包膜病毒包膜蛋白的核酸；和(b)第二種編碼一種或多種細胞膜蛋白的核酸，所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在合適的條件下必須並足以融合所述病毒包膜和含有所述細胞膜蛋白的細胞膜，使得所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在所述對象體內表達，並產生抗所述病毒的中和抗體。
6．實施例本發明的發明者獲得的令人驚奇的發現是，與rgp120疫苗中的包膜蛋白靜止、不能有效提呈相比，中和PI病毒的能力與活動性感染中提呈功能性包膜蛋白有關。
如本文所述，所述HIV包膜蛋白協調產生一系列複雜的蛋白-蛋白相互作用和結構變化，最終導致所述病毒和細胞膜融合以及細胞感染。結合CD4時，所述包膜蛋白發生構象變化，然後促進與數種共同受體分子中的一種相互作用，所述共同受體主要為CC趨化因子受體5(CCR5)或CXC趨化因子受體4(CXCR4)(Berger,E.A.,1997,AIDS 11(增刊A),S3；Moore,J.P.等，1997,Current Opinions in Immunology 9:551；Doranz,B.J.等，1997,Immunology Research 16:15)。不受限於已知機制，我們認為，與其中任何一種共同受體的相互作用進一步誘導所述包膜蛋白的構象變化並暴露跨膜gp41亞單位的疏水性融合域，然後它介導對合的細胞膜和病毒膜融合。根據這種HIV結合和進入的動態模式，用直接摻入這類功能性中間結構的本發明方法開發了HIV疫苗免疫原。
本文所述的實施例用來闡明本發明的方法和組合物。實施例1:HIV-FRMS免疫原對廣泛初級分離株的中和作用作為本發明的一個實例，產生HIV疫苗免疫原，它捕獲HIV結合和融合期間產生的中間過渡結構。在轉基因小鼠免疫模型中，甲醛固定的完整細胞疫苗激發產生能夠中和從不同地理位置和遺傳進化枝A-E分離的24個初級HIV分離株中的23個的感染性。開發這些融合依賴性的免疫原為臨床提供重要而廣泛有效的HIV疫苗。
如本文所述，所述HIV包膜蛋白協調產生一系列複雜的蛋白-蛋白相互作用和結構變化，最終導致所述病毒和細胞膜融合以及細胞感染。不受限於已知機制，我們認為結合CD4時，所述包膜蛋白發生構象變化，然後促進與數種共同受體分子中的一種相互作用，所述共同受體主要為CC趨化因子受體5(CCR5)或CXC趨化因子受體4(CXCR4)(綜述於Berger,E.A.,1997,AIDS 11(增刊A),S3；Moore,J.P.等，1997,Current Opinions in Immunology 9:551；Doranz,B.J.等，1997,Immunology Research 16:15)。與其中任何一種共同受體的相互作用進一步誘導所述包膜蛋白的構象變化並暴露跨膜gp41亞單位的疏水性融合域，然後它介導對合的細胞膜和病毒膜融合。本實施例說明開發直接摻入這類功能性中間結構的HIV疫苗免疫原的方法。
包膜蛋白功能的一種測量指標為其介導細胞與細胞融合的能力。當共培養表達包膜蛋白的細胞和表達CD4和共同受體的細胞時，在6-24小時內形成多核合胞體。在本實施例中，在廣泛合胞體形成之前通過甲醛交聯捕獲正在進行的結合和融合過程。FRMS的製備在這些研究中，所述功能性包膜蛋白從得自Amsterdam Cohort的嗜T淋巴細胞的PI病毒(ACH168.10；168P)獲得。採用pCR3.1-Uni質粒(Invitrogen)通過PCR分離ACH168.10的分子克隆的包膜基因(Tersmette,M.等，1989,Journal of Virology 63:2118；Wrin,T.等，1995,Science 69:39；LaCasse,R.A.等，1998,Jouranl of Virology 72:2491)。所述分子克隆的包膜蛋白以及原合胞體誘導(SI)的病毒同時利用CCR5和CXCR4共同受體。
轉染Cos-7細胞以表達所述包膜蛋白(COS-env)，然後與表達CD4和CCR5共同受體的人U87神經膠質瘤細胞(U87-CD4-CCR5)共培養。用本領域已知的方法(參見例如Jordan,M.等，1996,NucleicAcids Research 24:596)通過磷酸鈣沉澱法(20μg DNA/106細胞/10cm培養皿)將功能性168P(168P23)包膜基因轉染入COS-7細胞(AmericanType Culture Collection,Manassus,VA)。2天後用0.5mM EDTA的磷酸緩衝鹽溶液收穫瞬時表達的COS-7細胞，並用0.1mM EDTA的PBS製備U87-CD4-CCR5融合配偶體(Hill,C.M.等，1997,Journal ofVirology 71:6296)。通過在10cm培養皿中混合所述兩種細胞類型(每個培養皿1.5×106細胞)開始共培養。用顯微鏡和免疫化學染色(HIVIG)平行共培養物監測細胞與細胞融合的時程(LaCasse,R.A.等，1998,Science 72:2491)。通常當幾乎沒有或沒有明顯合胞體形成時，在4-5小時用甲醛固定收穫共培養物。捕獲FRMS為了捕獲在結合和融合過程中的過渡中間體，5小時後當即使有明顯多核細胞也極少時，用0.2％甲醛固定共培養物。具體地說，用本領域已知的方法利用0.2％甲醛的PBS於4℃原位固定培養物過夜(參見例如Yamamoto,J.K.等，1991,AIDS Research and HumanRetroviruses 7:911；Verschoor,E.J.等，1995,Veterinary Immunologyand Immunopathology 46:139)。然後刮脫細胞，用PBS洗滌兩次，用含有10％DMSO的PBS以標準密度3×106細胞/0.1ml重懸浮，於-80℃冷凍保藏或立即用作免疫原，如下文所述。用FRMS免疫原免疫接種甲醛處理的完整細胞製劑用作可融合(FC)免疫原或FRMS免疫原。為了測試這些免疫原激發產生中和抗體的能力，必須將免疫應答限於病毒和病毒誘導的表位。否則，將產生抗CD4和CCR5的抗體，它們本身就會阻斷感染性。所以應用對所述疫苗的人(hu)CD4和CCR5組分免疫耐受的動物模型。因此，用表達hu CD4和hu CCR5共同受體的轉基因小鼠進行免疫原性研究。
已有關於構建CD靶缺失和hu CD4轉基因小鼠的描述(Killeen,N.等，1993,EMBO Journal 12:1547)。hu CCR5轉基因小鼠的設計概述如下將1.15kb hu CCR5 cDNA分子克隆入鼠CD4表達盒的外顯子2中的SalI工程位點(構建物c述於(Sawada等，1994,Cell 77:917)。該微小基因含有鼠CD4增強子、CD4啟動子、第一(非編碼)外顯子和具有去除CD4沉默子的內缺失的內含子1。用本領域已知的方法利用mAb通過流式細胞法鑑定轉基因小鼠。繁殖這些動物成為表達hu CD4的轉基因小鼠，以獲得表達hu CD4、hu CCR5和小鼠CD4的子代。採用Coulter EPICS ELITE流式細胞儀經流式細胞法篩選表達hu CD4、hu CCR5和小鼠CD4的幼鼠。使用以下抗體試劑小鼠α-人CD4/CyChrome(Pharmingen)、具有山羊α-小鼠Ig/FITC(Caltag)的小鼠α-人CCR5 MAB 180(R D系統)和大鼠α-小鼠CD4 L3T4/PE。
用FRMS免疫原或細胞對照(單獨的或與模擬轉染的COS細胞共培養的U87-CD4-CCR5細胞)免疫表達hu CD4、hu CCR5和小鼠CD4的轉基因小鼠。用等體積的Ribi佐劑(R-700；用1/2推薦體積的PBS重構)配製由甲醛固定的完整細胞(3×106細胞/0.1ml)組成的疫苗；在某些試驗中，初次免疫接種用含有佐劑的細胞壁物質(R-730)進行。在小鼠4個皮下部位接種0.05ml疫苗。間隔3周加強免疫，免疫接種後10-28天從鼠尾取血。按照本領域已知的方法經gp120 ELISA定量抗gp120的血清抗體(參見Moore,J.等，1989，AIDS 3:155)。對病毒的中和作用用表達CCR5或CXCR4共同受體的U87-CD4細胞測定同源168P病毒對疫苗血清的中和作用的敏感性。相對於PBL培養物的標準中和測定，已經證實該PI病毒中和測定有效(LaCasse,R.A.等，1998,Science 72:2491；Follis,K.E.等，1998,Journal of Virology 72:7603)，並確定它可在存在小鼠血清的情況下良好進行。所有血清在中和測定使用前進行熱滅活。
如下進行同源168P PI病毒與可融合(FC)疫苗血清和融合缺陷型(FI)疫苗血清的中和測定。用FC免疫原(COS-env和U87-CD4-CCR5；方框；n=3隻小鼠)或細胞對照(單獨或與模擬轉染的COS細胞共培養的U87-CD4-CCR5細胞；圓形；n=3隻小鼠)免疫轉基因小鼠(hu CD4+,hu CCR5+，小鼠CD4+)。也使用未免疫的小鼠(三角形；n=2隻小鼠)。採用表達CXCR4(黑色符號)或CCR5(白色符號)的U87-CD4細胞測試血清對168P的中和作用。數據為用第二次和第三次免疫接種後2周獲得的血清的3-6個中和測定的平均值。
如圖1所示，病毒中和測定的結果表明，在用細胞對照免疫的小鼠的血清中沒有觀察到對感染性的抑制，說明所述轉基因小鼠實際上對hu CD4和CCR5是耐受的，而且其它外來細胞反應性不會干擾所述病毒感染性測定(圖1)。用FRMS免疫原免疫小鼠的血清中和同源168PPI病毒。進一步證實中和活性是抗體介導的，而且活性本身可吸附至含有A蛋白和G蛋白的固體支持物上，然後從其洗出。具體地說，血清可在4℃下依次吸附至A蛋白瓊脂糖(Sigma)和G蛋白瓊脂糖(Sigma)上。用gp120 ELISA證實抗體的吸附。與固體支持物結合，用100mM甘氨酸pH2.5洗脫抗體。通過離心超濾(Microcon-100；Amicon)中和和透析洗出液。測得PBL測定中的FC血清的中和作用為大於99％，而測得U87-CD4-coR細胞測定中的FC血清的中和作用為80-90％。
值得注意的是，在敏感的PBL中和測定中確實證實『融合缺陷型』疫苗血清對PI病毒複製的一定抑制作用，儘管該作用較『可融合』疫苗血清要低得多(參見LaCasse,RA等，1999,Science 283:357-62)。這種基本作用可解釋偶有文獻要求保護的rgp120疫苗血清對PI病毒的中和作用(Devico,A,A Silver等，1996,Virology 218:258-63；Berman,PW等，1998,AIDS Res Hum Retrovirus 14(增刊3)S277-S89)。目前不了解PI病毒中的中和敏感性差異的分子基礎，可能與系統進化枝分組本身相關或不相關。在多個進化枝中可能獨立產生血清型不同的決定簇。因此，得自進化枝B以外的進化枝的『可融合』env可用來經驗性確定原型env的數目，所述原型env代表『可融合』中和血清型。不管HIV血清型的總數目，重要的是用單一代表但是適當提呈的進化枝B env可強烈中和(＞70％)80％所測試的PI病毒。CXCR4共同受體可取代CCR5不管在U87-CD4細胞感染測定中使用什麼共同受體，均觀測到FC血清對168P病毒的中和作用(圖1)。幾個報告已經證實，在一般中和作用中敏感性與使用的具體共同受體無關(LaCasse,R.A.等，1998,Science 72:2491；Trkola,A.等，1998,Journal of Virology 72:1876；Montefiori,D.C.等，1998,Journal of Virology 72:3427；Follis,K.E.等，1998,Science 72:7603)。
用所述動物未接觸過的共同受體CXCR4在本文中觀測到的中和作用的事實說明，中和作用不會直接針對疫苗中的CCR5組分。此外，CXCR4共同受體可取代CCR5。融合缺陷型免疫原檢測融合依賴性決定簇在誘導PI病毒中和作用中的作用。融合缺陷型(FI)免疫原-表達env但是不發生細胞與細胞融合的共培養物。包括與U87細胞(無CD4或CCR5共同受體)共培養的COS-env、與U87-CD4細胞共培養的COS-env和可溶性CD4(sCD4)與其複合的COS-env細胞。具體來說，將表達包膜的培養物與sCD4培養(Berger,E.A.等，1988,Proceedings of the National Academy of Sciences USA85:2357)(5μg/ml；1小時，37℃)，然後洗滌去除未結合的sCD4。用甲醛如上固定所有FI免疫原。其它FI免疫原包括在配製疫苗的過程中於混合之前分別用甲醛固定的COS-env和U87-CD4-CCR5細胞。
與FC或FRMS免疫原明顯不同，所有FI免疫原不能觸發產生對同源PI病毒的明顯中和作用(圖2A)。具體來說，FC中和P168，而FI免疫原不能中和P168。如圖2A所示，用以下免疫原免疫轉基因小鼠FC免疫原(黑色方框；n=4)、FI免疫原(COS-env和U87細胞，灰色圓形，n=4；COS-env和U87-CD4細胞，灰色菱形，n=3；COS-env和sCD4，白色菱形，n=2；COS-env和U87-CD4-CCR5細胞，均在混合用於免疫接種前分別固定，灰色方框，n=2)或模擬轉染的cos細胞免疫原(與U87-CD4-CCR5細胞共培養，白色圓形，n=2)。也使用未免疫的小鼠(白色三角形，n=2)。中和作用與具體的共同受體應用無關，在此的數據為U87-CD4-CXCR4或-CCR5細胞的3-6次中和測定的平均值。在某些情況下，合併各個試驗組所有動物的血清。這些結果與許多文獻記載一致，即rgp120疫苗不能觸發產生PI病毒中和作用。在利用人的初級血液淋巴細胞(PBL)的測定中也觀測到FC和FI疫苗的中和作用差異(圖2B)。
還證實FC對人PBL培養物中的同源168P PI病毒的中和作用，而FI免疫原不具有此作用。如圖2B所示，分離淋巴細胞，用植物凝集素刺激，在白介素-2存在下培養；如本文所述測定中和作用。培養5天後用ELISA(Coulter Corporation)測定HIV p24抗原，測定值用病毒對照(36ng/ml)歸一化。*表示p24抗原水平在ELISA中使用的稀釋度下低於檢測下限。疫苗分組見圖2A定義，而且合併血清用於此測定。FRMS免疫原的特異性為了排除FC疫苗血清以非特異性方式抑制病毒感染性的可能性，證實FC疫苗血清不會抑制帶有兼嗜性鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白的假型HIV病毒體(用兼嗜性MLV包膜蛋白假型化包膜缺陷型HIVNL4-3-Luc-R-E-原病毒)的感染性(Deng,H.等，1996,Nature 381:661)。此外，證實FC疫苗血清不會中和猿猴免疫缺陷病毒SIVmac251的初級分離株。使用在恆河猴PBL中產生的VIVmac251初級分離株(Langlois,A.L.等，1998,Journal of Virology 72:6950)(圖3)。
如圖3所示，FC疫苗血清不中和攜帶兼嗜性MLV包膜蛋白的假型化HIV病毒體或初級SIVmac251。在採用以U87-CD4-CXCR4細胞測定的合併的FC和FI抗血清的中和敏感性中使用攜帶兼嗜性MLV包膜蛋白的HIV(兼嗜性MLV假型)。用U87-CD4-CCR5細胞測定初級分離株SIVmac251的中和作用。符號同圖2的FC免疫原(黑色方框)和FI免疫原(Cos-env+U87細胞，黑色圓形)的定義。對實驗室使用的分離株中和作用與常規的rgp120疫苗一樣，FI疫苗能夠觸發產生對相關的實驗室使用的HIV分離株(即T細胞系適用的168P、168C的衍生物)的中和作用，(描述於Wrin,T.等，1995,Science 69:39；LaCasse,R.A.等，1998,Science 72:2491)。用U87-CD4-CXCR4細胞測試168P PI病毒及其TCLA衍生物168C的中和敏感性。疫苗分組和符號定義同圖2；合併血清用於該測定。圖4的結果表明，FI疫苗血清中和TCLA 168C病毒。對TCLA 168C病毒的中和滴度在FC或FI疫苗血清中均相近，如同抗gp120抗體的滴度，說明所述疫苗中的固有免疫原性的程度相似。
FI疫苗不能在轉基因小鼠模型中觸發產生PI病毒中和作用，突出了FC疫苗觸發產生的中和作用的特異性。對所述數據組進行統計學比較，包括所有試驗動物和所有病毒中和測定。病毒抗體結合的單一模型用來計算每個測定的『結合常數』k，並測定每隻小鼠的平均K值。對後續測試方差的分析證實，FC和FI免疫原在平均中和作用上具有顯著差異(p＜0.01)。在所有試驗中，試驗組內的反應是恆定一致的。
此外，FI疫苗血清始終不能抑制PI病毒感染性強烈說明，所述免疫應答可能不是針對人的外來細胞靶，例如失活SIV疫苗的早期研究錯認的那些細胞靶(參見Cranage,M.P.等，1993,AIDS Researchand Human Retroviruses 9:13；Putkonen,P.等，1993,Journal ofMedical Primatology 22:100；Arthur,L.O.等，1992,Science 258:1935)。相反，本發明認為，FC或FRMS免疫原存在介導PI病毒中和作用的獨特決定簇。FRMS免疫接種血清對初級分離株的中和作用HIV疫苗開發的關鍵問題集中在疫苗抗血清中和廣泛不同的PI病毒的能力。為了證實FRMS免疫原如FC免疫原觸發產生的PI病毒中和作用的廣泛度，我們檢測了一組5種盛行的不同地理位置的系統進化枝的典型PI病毒的敏感性。通過NIBSC(UK)AIDS ReangentProgram獲得傳染性原病毒ACH320.2A.1.2(320SI)和ACH320.2A.2.1(320NSI)(Groenink,M.等，1991,Journal of Virology 65:1968；Guillon,C.等，1995,AIDS Research and Human Retroviruses 11:1537)。還使用HIV89.6(Collman,R.等，1992,Journal of Virology 66:7517)、SHIV89.6和SHIV89.6P(Reimann,K.A.等，1996,Journal of Virology70:3198)。所有其它初級分離株得自NIH AIDS Research and ReferenceReagent Program以及UNAIDS Network for HIV-1 Isolation andCharacterization。使PI病毒在PHA活化的PBL中有限增殖(Wrin,T.等，1995,Science 69:39)。
如圖5所示，功能性進化枝B包膜蛋白產生的FC血清能夠中和所測試的24種PI病毒中的23種病毒，它們是來自北美/歐洲(進化枝B)、非洲(進化枝A和D)、泰國(進化枝B和E)和印度(進化枝C)的嗜單核細胞/NSI和嗜T淋巴細胞/SI病毒。疫苗組別和符號定義同圖2；合併血清用於本試驗。
儘管這些分離株之間存在序列差異性，但是大多數分離株對FC疫苗血清的中和作用的敏感性相似。一種分離株(92RW008)不能達到中和作用＞50％，兩種其它分離株(93IN904和92UG024)顯示＞50％的有限中和作用；與主要的中和作用不同的這些例外進一步說明，本發明的FC免疫原可能主要針對病毒決定簇。
FI血清不能均一地中和這些異源PI病毒。FRMS免疫原對各種PI病毒的廣泛均一中和作用說明，FRMS免疫原(例如FC免疫原)提供的關鍵決定簇是高度保守的，而且在結合和融合時緊密依賴於包膜蛋白的基本功能。中和抗體為了更準確地明確FC疫苗中和PI病毒的分子靶，當與表達在轉染COS細胞表面上的包膜蛋白溫育時，試圖從FC疫苗血清去除中和抗體。
因此，將表達168P包膜蛋白的甲醛固定的COS細胞與FC血清溫育，然後測試回收血清對PI病毒的中和作用。再後用約106表達168P包膜的甲醛固定的COS細胞連續吸附FC疫苗血清4次。於4℃振搖溫育1小時。對照包括前血清和甲醛固定的模擬轉染COS細胞。用gp120 ELISA監測對大量抗gp120抗體的吸附。用U87-CD4-CXCR4細胞測試最終的血清對HIV 168P的中和作用。通過與表達包膜的細胞溫育去除FC疫苗血清的中和活性，但是與COS細胞對照溫育的活性降低最少(圖6和圖7)。具體來說，將FC疫苗血清反覆與甲醛固定的COS-env或對照COS細胞溫育，並用U87-CD4-CXCR4細胞測試對168P的殘餘中和作用。用相似方法吸附FC免疫接種前獲得的血清。產生中和抗體為了證實本發明的方法可用於產生中和抗體，用本發明的方法(用交聯的COS-env+U87-CD4-CCR5作免疫原)製備雜交瘤上清液，它能夠中和初級分離株。簡而言之，如上所述用U87-CD4-CXCR4細胞測定測定雜交瘤對病毒的中和作用。測試雜交瘤上清液中和兩種典型的HIV進化枝B分離株(ACH168.10(168P)和92US657)的能力。中和作用表示為相對於只有培養基時的轉化灶數目的存在雜交瘤上清液情況下的轉化灶數目。如圖8所示，發現大多數雜交瘤中和兩種PI病毒高達60-80％(殘餘感染性部分分別為0.4-0.2)。
因此，本發明的FRMS免疫原能夠激發抗初級分離株病毒的中和單克隆抗體。總之，本實施例說明適當提呈的進化枝B包膜蛋白可激發針對多個HIV進化枝的大多數PI病毒的有效中和作用，表明廣泛的疫苗保護不需要無限數量的HIV血清型。
另外，儘管靜態形式的包膜蛋白不能用作有效免疫原，但是本發明認為，在所述靜態蛋白上存在重要的融合相關表位，足以允許發生結合。當用於疫苗製劑時，本發明的FRMS免疫原對各種各樣的病毒血清型和進化枝提供廣泛保護。實施例2融合缺陷型突變檢測了各種用於本發明方法的突變。
如果為HIV時，3類包膜蛋白突變包括但不限於(1)消除對gp160前體蛋白的蛋白酶裂解的突變；(2)影響N-末端gp41融合肽域的突變；和(3)改變捲曲螺旋結構域的突變。
消除gp160前體蛋白蛋白酶裂解的突變包括某些改變gp120 C末端的高度保守的K/R-X-K/R-R位點的突變，它們防止gp160多蛋白的蛋白酶裂解而且還消除了融合性(Freed,E.O.等，1989,J.Virol.63:4670-5；Guo H.G.等，1990,Virology,174:217-24；Bosch V.等，1990,J.Virol.1990:2337-44；Dubay,J.W.等，1995,J.Virol.,69:4675-82)。
利用定點誘變(QuikChange,Stratagene)將文獻記載的裂解位點突變導入168P包膜蛋白(REKR變為REKT)。裂解缺陷型168P包膜蛋白gp160表達在細胞表面，但是不能介導細胞與細胞的融合或假型化HIV病毒體的感染。
影響N-末端gp41融合肽域的突變包括gp41的疏水性N-末端區的突變，據認為所述區通過插入細胞膜並使脂質雙分子層不穩定，從而介導融合。在該區的某些胺基酸變化使所述包膜蛋白成為非融合性合成肽。
已充分表徵gp41 N-末端融合肽的突變V2E(Freed,E.O.等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992:70-4；Pereira,F.B.等，1997,AIDS Res. Hum Retrovirus 13:1203-11)和G10V(Delahunty,M.D.等，1996,Virology 218-94-102)。前者在疏水性肽中含有極性取代，而後者可能影響推定的脂質雙分子層中的螺旋結構。這些突變通過定點誘變導入168P包膜基因(gp41:AVGIGVLFLGFLG..)，並測試包膜蛋白的表達和融合性。在pAbT4587-168Penv中導入這些突變可促進產生本發明的相關重組牛痘病毒。
改變捲曲螺旋區的突變包括高度保守的捲曲螺旋基元中的突變，它們見於許多病毒科的融合蛋白(Weissenhorn,W.等，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:6032-6)，例如HIV的V570R和Y586E。在一個實施方案中，在168P包膜基因中導入變化，用細胞測定測試其表達和融合性，然後將其導入pAbT4587-168Penv，以產生相關重組牛痘病毒。實施例3製備FRMS通過將表達分子克隆的HIV 168P包膜蛋白(得自ACH168.10，它為同時利用CCR5和CXCR4的誘導合胞體的初級分離株)(LaCasse,R.A.等，1998,Science 72:2491)的磷酸鈣轉染的COS-7細胞(American Type Culture Collection,Rockville,MD)與等數目的細胞融合配偶體共培養，製備可融合免疫原。細胞融合配偶體為表達CCR5的U87-CD4細胞(U87-CD4-CCR5)(Dan Littman,Skirball Institute ofBiomolecular Medicine,NYU Medical Center)。發生細胞與細胞融合時(3-5小時)用冰冷的0.2％甲醛的磷酸緩衝鹽溶液固定終止培養。定時收穫細胞是為了捕獲導致細胞與細胞融合的過渡中間體。初步的同期免疫染色研究表明，收穫時的最大合胞體形成為10-30％。固定過夜後通過刮撥收穫細胞。實施例4用FRMS免疫小鼠用實施例1製備和收穫的細胞以21天的間隔免疫同時表達人CD4和CCR5共同受體的轉基因小鼠(Dan Littman,Skirball Institute ofBiomolecular Medicine,NYU Medical Center)3次。用Ribi佐劑(RibiImmunoChem Research,Inc.)(2×106細胞/0.2ml/小鼠)將細胞配製為疫苗。從小鼠尾靜脈取血。所獲得的血清用於表達CCR5或CXCR4的U87-CD4細胞系的中和測定中。相對於外周淋巴細胞(PBL)培養物的標準中和測定，已經證實該快速PI病毒中和測定有效(LaCasse,R.A.等，1998,Science 72:2491)，並確定它可在存在小鼠血清的情況下良好進行。在3個獨立試驗中，將可融合疫苗給予3隻小鼠。同時用U87-CD4-CCR5和-CXCR4細胞進行利用同源PI病毒168P的病毒中和測定，在某些情況下，在第二次以及第三次免疫接種後分析血清。在所有情況下，結果均一致，圖9的數據為平均值。一致觀測到對同源168P PI病毒的有效中和作用；通常1∶100小鼠血清稀釋度獲得的中和水平大於或等於80％。用所述動物沒有接觸過的共同受體CXCR4觀測到中和作用。
進行了幾個重要的對照免疫接種。一個基本對照證實非功能性包膜蛋白免疫原在轉基因小鼠免疫模型中不會激發產生PI病毒中和抗體。在一個研究中，一隻小鼠接受了含有168P包膜/已與既不表達CD4也不表達共同受體的U87細胞共培養的COS細胞的疫苗。儘管在兩個血標本的總共3個測定中觀測到一定的對168P PI病毒的中和作用，但是其滴度和程度顯著不同於用可融合疫苗觀測到的結果。
據認為，與CD4結合時誘導的構象變化對隨後與共同受體的相互作用是關鍵性的。所以，針對這些新包膜蛋白的抗體有利於PI病毒的中和作用。在使用包膜蛋白對照疫苗的平行試驗中，另一隻小鼠接受包含已與U87-CD4細胞共培養後的表達168P包膜的COS細胞的對照疫苗。用這種融合缺陷型系統沒有觀測到合胞體形成。顯然，CD4的加入幾乎無助於用單獨的包膜蛋白獲得的極其基本的中和作用。
殘餘的中和作用可能產生於針對所述轉基因不完全耐受的CD4和CCR5的抗體。因此，測試含有單獨的或與模擬轉染的COS細胞共培養的U87-CD4-CCR5細胞的對照疫苗。在3個研究中均未觀測到對病毒感染性的抑制。這些數據證實了這些轉基因小鼠的耐受性和所述免疫接種模型是有效的。特異性免疫應答似乎限於病毒而且可能限於病毒誘導的表位。不僅這些小鼠的確與人類疫苗接受者一樣對人CD4和CCR5耐受，而且針對其它細胞蛋白的抗體似乎不會干擾該測定中的病毒感染性。
探測了所述抗體應答可能部分是由DNA疫苗接種介導的可能性。在轉染期間，使包膜表達細胞接觸μg量的質粒DNA。為了測試動物是否應答DNA疫苗接種，將兩隻小鼠皮下注射20μg 168P23質粒(用pCR3.1-Uni表達載體)。儘管此給予途徑不是DNA疫苗接種優選的，但是它確實反映使用轉染細胞疫苗的情況。在該試驗中所述DNA未用福馬林滅活。在總共8個病毒中和測定中，當用DNA疫苗接種時沒有觀測到PI病毒中和作用。實施例5利用抗FRMS抗體中和其它PIACH320.2A.1.2(320SI)(Amsterdam Cohort)是特別抵抗HIV-IG、CD4-Ig和IgG1-b12的中和作用的分子克隆的嗜T淋巴細胞的PI病毒。實施例3中剩下的殘餘血清用來測試該PI病毒對可融合免疫原和融合缺陷型免疫原的敏感性。儘管限於可融合血清開始的1∶100稀釋度，但是顯然該異源進化枝B分離株對中和作用是敏感的。還令人感興趣的是融合缺陷型血清(env和env+CD4)不能夠中和異源320SI病毒，與觀察到的對同源168P病毒的部分中和作用相反(圖10)。
HIV疫苗開發的關鍵問題集中在疫苗抗血清中和廣泛不同的PI病毒的能力。為了證實可融合免疫原觸發產生的PI病毒中和作用的廣泛度，我們檢測了一組5種盛行的不同地理位置的系統進化枝的典型PI病毒的敏感性。如上所述以及實施例1所述進行用U87-CD4-共同受體細胞的中和測定。功能性進化枝B包膜蛋白產生的FC血清能夠中和所測試的24種PI病毒中的23種病毒，它們是來自北美/歐洲(進化枝B)、非洲(進化枝A和D)、泰國(進化枝B和E)和印度(進化枝C)的嗜單核細胞/NSI和嗜T淋巴細胞/SI病毒。儘管這些分離株之間存在序列差異性，但是大多數分離株對可融合疫苗血清的中和作用的敏感性相似。一種分離株(92RW008)不能達到中和作用大於50％，兩種其它分離株(93IN904和92UG024)顯示＞50％的有限中和作用。對照血清均不能中和這些異源PI病毒，與以上rgp120免疫原陰性結果一致。單一典型的但是適當提呈的進化枝B包膜蛋白激發產生對各種PI病毒的廣泛均一的中和作用，說明可融合免疫原提供的關鍵決定簇是高度保守的，而且在結合和融合時緊密依賴於包膜蛋白的基本功能。這些發現說明對HIV感染的世界性保護需要的不同HIV中和血清型數目可以是有限的。實施例6標記FRMS的製備和分離應用有助於其分離和純化的市售系統標記本主題發明的FRMS。用來構建S-肽標記的CD4、CCR5、CXCR4和HIV包膜的分子工程方法是相似的，將只對CD4-Sprep的該方法進行詳細描述。用S-肽在CD4分子的C末端標記分子。用合成寡核苷酸和高保真的XL PCR(PEApplied Biosystems)將S-肽編碼序列(1ys-glu-thr-ala-ala-ala-lys-phe-glu-arg-gln-his-met-asp-ser)插入CD4 cDNA表達質粒(CD4-Spep)的胞質C-末端異亮氨酸和終止密碼子(TGA)之間。通過感染表達CD4-Spep和CXCR4共同受體的COS-7細胞證實修飾的CD4的有效表達。C-末端標記的CD4能夠支持168P病毒感染，其與天然CD4相當。S-肽標記的CD4也容易用S-蛋白親和層析(Novagen,Inc.)分離。用相似方法，我們構建了相應的S-肽標記的CCR5和CXCR4共同受體和HIV包膜分子。證實所有構建物在結合和融合中是有功能的。用CXCR4和或者CD4-Spep或天然CD4(在pcDNA3.1表達載體中)轉染COS-7細胞，然後用生物素(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin；Pierce Chemical Co.)在細胞表面標記2天。在含有蛋白酶抑制劑的0.5％Triton X-100中製備裂解物。用以下任何一種方法純化CD4分子1)用加載MAB T4(Coulter Corp.,Hialeah,FL)和兔-α-小鼠Ig抗體的A蛋白瓊脂糖免疫沉澱，或者2)用S-蛋白瓊脂糖親和純化。通過在十二烷基硫酸鈉(SDS)樣品緩衝液中煮沸釋放蛋白，通過10％聚丙烯醯胺-SDS凝膠電泳分離，並轉移到硝酸纖維素上。用抗生物素蛋白辣根過氧化物酶(Pierce)和鎳增強的DAB底物檢測生物素化蛋白。S-蛋白瓊脂糖對62kDCD4-Spep的特異性純化的產率和純度均高於α-CD4-抗體介導的免疫沉澱法。
檢測了福馬林交聯後的S-肽分離時程。用CD4-Spep(±CXCR4)轉染COS-7細胞，然後用0.5％Triton X-100裂解緩衝液收穫細胞(對照)，或者在裂解之前用冰冷甲醛進行固定。用S-蛋白瓊脂糖純化CD4-Spep蛋白，用S-蛋白HRP(Novagen,Inc.)的蛋白質印跡法進行分析。用0.2％甲醛固定1小時的S-肽結合(和/或回收)的損失最小；用2％甲醛固定1小時和更多的3小時回收有一定損失。中間反應條件(例如0.2％甲醛固定1-2小時)將使得可以有效地分離有效交聯的複合物。
為了鑑定特異性CD4-Spep複合物，用甲醛固定以及特異性交聯劑DTSSR(Pierce Chemical Company)進行試驗。DTSSP是如甲醛一樣與初級胺反應的同基雙功能N-羥基琥珀醯亞胺酯。因為DTSSP帶有負電荷，所以它不能滲透或穿過細胞膜，因此，與甲醛相反，預期它用不著進行胞質S-肽標記。同樣與甲醛不一樣的是，DTSSP的交聯作用是可逆的；可裂解內部二硫鍵以釋放交聯的組分。
用168P包膜或CD4-Spep質粒轉染COS-7細胞；用總量為1mCi的35S-蛋氨酸和半胱氨酸在10cm培養皿中對包膜表達細胞以及模擬轉染細胞進行代謝性標記8小時。然後共培養包膜(或模擬)表達細胞和CD4-Spep表達細胞4小時，使得細胞與細胞相互作用，以及進行甲醛(0.2％，在冰上1小時)或DTSSP(2mM,2×10分鐘，在冰上)交聯。製備裂解物，並通過S-蛋白瓊脂糖親和層析分離含S-肽的複合物。
通過6％聚丙烯醯胺SDS凝膠電泳分析甲醛交聯的複合物。鑑定了未見於模擬+CD4-Spep對照的高分子量複合物。還可見病毒蛋白gp120和gp160，推測是通過非共價鍵與CD4-Spep結合而分離的。對S-蛋白親和純化(即CD4-Spep)和代謝性標記(即包膜)的高分子量複合物的檢測表明，可分離交聯的複合物用於進一步的研究。
為了繼續分析這些高分子量複合物，檢測了DTSSP交聯的複合物。分析S-蛋白親和純化的複合物，該複合物用或不用50mM DTT進行預處理後通過6％聚丙烯醯胺/SDS凝膠電泳分離。當DTSSP交聯未受損時，包膜特異性複合物不能與分離自模擬+CD4-Spep對照的以上分離物明顯分開。幾乎檢測不到gp120/gp160。但是，可逆的DTSSP交聯產生特異性釋放的gp120和gp160蛋白。這些數據證實用甲醛固定觀測到包膜-CD4複合物的形成，並突出了應用可逆交聯劑的作用。
這些數據支持在分離融合活性的CD4-相關複合物中應用CD4-Spep親和標記和化學交聯法。已經生產了S-肽標記的共同受體CCR5(CCR5-Spep)、CXCR4(CXCR4-Spep)、病毒包膜(Env-Spep)，而且還可用來分離融合活性的複合物。分離的複合物可用來確定與包膜介導的膜融合的發生過程有關的分子結構。
進行研究以確定是否能夠用或者CD4-Spep或者CCR5-Spep共純化包膜蛋白。分別用168P包膜蛋白以及a)CD4-Spep、或b)CCR5-Spep和CD4、或c)模擬物轉染人293T細胞。將包膜表達細胞與融合配偶體(a-c)共培養5小時，用1％ Brij-97去垢劑溶解複合物(Lapham等，1996)，並用S-蛋白親和層析進行分離。通過用針對HIV V3的mAb 50.1的蛋白質印跡分析檢測用Brij-97分離的共純化包膜蛋白(圖11)。正如所預料，與表達CD4-Spep的細胞共培養後，大量168P包膜蛋白是可分離的。與表達CD4和CCR5-Spep細胞共培養後，較少但是顯著量的包膜蛋白也是可分離的。由模擬轉染細胞的共培養物未檢測到汙染的包膜蛋白。在相似的試驗中，從甲醛交聯的可融合共培養物分離到複合物。
這些結果強有力地說明，包膜蛋白、CD4和CCR5的複合物出現在融合早期，並可用S-蛋白親和層析分離。這些S-蛋白純化分子和複合物可用作「片段病毒(split virus)」或亞單位疫苗免疫原。
實施例7在細胞培養物或疫苗接種部位產生可融合FRMS的重組牛痘病毒將本發明轉化為真正製劑的其它可接受的疫苗方法包括應用病毒載體。例如共同給予分別表達env和CD4/CCR5的重組牛痘病毒，可原位驅動細胞與細胞的融合。在一個實施方案中，構建2種重組牛痘病毒一種表達HIV 168P包膜蛋白(rV-168Penv)，第二種表達CD4和CCR5共同受體(rV-CD4/CCR5)。用rV-168Penv感染的細胞和用rV-CD4/CCR5感染的細胞的共培養物是可融合的，並產生多核合胞體(圖12)。如上所述，rV-168Penv細胞、rV-CD4/CCR5細胞或交聯的共培養的rV-168Penv和rV-CD4/CCR5細胞用作接種轉基因小鼠的FRMS。
用交聯的共培養的rV-168Penv和rV-CD4/CCR5細胞免疫接種小鼠，由其獲得的血清能夠對各種進化枝的HIV產生病毒中和作用，說明在形成FRMS的本發明的方法中可成功使用所述病毒載體。
應該指出的是，本發明所述實施例和實施方案僅僅用於說明本發明，而且本領域技術人員對其可進行各種改進或變更，但是它們將均在本申請宗旨和權限以及所附權利要求書範圍內。
本發明不僅限於本文所述的具體實施方案範圍。實際上，根據上述說明書和附圖，對本發明進行在本文所述內容之外的各種改進對本領域技術人員而言是顯而易見的。這類改進屬於後附的權利要求書範圍內容。
本文以上引用了各種參考文獻，包括專利申請、專利和公開出版物，其內容均通過引用整體結合到本文中。
權利要求
1．一種分離的分子結構，它含有因為(a)包膜病毒的包膜蛋白，和(b)一種或多種細胞膜蛋白結合形成的表位，所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在合適的條件下必須並足以融合所述病毒包膜與含有所述細胞膜蛋白的細胞膜。
2．一種分離的分子結構，它含有因為(a)裝配入HIV病毒包膜的HIV包膜蛋白或其突變體；和(b)人CD4和HIV融合的共同受體結合形成的表位。
3．權利要求2的分子結構，其中所述共同受體是CCR5或CXCR4。
4．權利要求2的分子結構，它形成於融合缺陷型的HIV gp41的突變體的結合。
5．權利要求4的分子結構，其中所述突變體含有一個或多個選自V2E、G10V、V570和Y586E的突變。
6．權利要求2的分子結構，它形成於野生型HIV包膜蛋白的結合。
7．一種分離的分子結構，它含有因為(a)包膜病毒的突變包膜蛋白，該野生型形式的包膜蛋白在所述病毒包膜與宿主細胞膜融合時起作用，而所述突變包膜蛋白是融合缺陷型；和(b)一種或多種起所述包膜蛋白的受體作用的宿主細胞膜蛋白結合形成的表位。
8．權利要求1或7的分子結構，其中所述病毒是選自以下病毒科的病毒逆轉錄病毒科、彈狀病毒科、日冕形病毒科、線狀病毒科、痘病毒科、本揚病毒科、黃病毒科、披蓋病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科和皰疹病毒科。
9．權利要求1或7的分子結構，其中所述包膜蛋白是HCV的E1和E2，而所述細胞膜蛋白是CD81。
10．權利要求1或7的分子結構，它為交聯的細胞分子結構。
11．權利要求2的分子結構，它為交聯的細胞分子結構。
12．權利要求1或7的分子結構，它分離自細胞裂解物。
13．權利要求2的分子結構，它分離自細胞裂解物。
14．權利要求10的分子結構，其中所述細胞分子結構包括重組表達所述包膜蛋白的細胞。
15．權利要求11的分子結構，其中所述細胞分子結構包括重組表達所述包膜蛋白的細胞。
16．權利要求12的分子結構，其中所述細胞裂解物得自多種細胞，包括重組表達所述包膜蛋白的細胞。
17．權利要求14的分子結構，其中所述細胞分子結構還包括重組表達一種或多種宿主細胞膜蛋白的細胞。
18．一種重組包膜病毒，其中所述病毒在其包膜上重組表達所述病毒的天然包膜蛋白的細胞受體。
19．按照權利要求18的病毒，它為HIV，而且其中所述細胞受體為人CD4或HIV的共同受體，或者所述病毒同時重組表達人CD4和所述共同受體。
20．權利要求1的分子結構，其中所述合適條件包括降低pH。
21．權利要求11的分子結構，其中所述交聯的細胞分子結構還包括所述病毒的交聯的病毒顆粒，該病毒顆粒含有所述包膜蛋白。
22．一種疫苗製劑，它含有免疫量的權利要求1-4、6和8任何一項的分子結構；和藥學上可接受的載體。
23．一種單克隆抗體，它針對權利要求1或7的分子結構。
24．一種單克隆抗體，它針對權利要求2的分子結構。
25．對權利要求2的分子結構特異性的純化的多克隆抗血清。
26．一種避孕的凝膠、泡沫狀物、乳膏或軟膏，它們含有抑制或減輕所述病毒感染的有效量的權利要求23的抗體。
27．一種避孕的凝膠、泡沫狀物、乳膏或軟膏，它們含有抑制或減輕HIV感染的有效量的權利要求24的抗體。
28．一種避孕的凝膠、泡沫狀物、乳膏或軟膏，它們含有抑制或減輕HIV感染的有效量的權利要求25的抗體。
29．哺乳動物血液標本，其中已經加入抑制或減輕所述病毒感染的有效量的權利要求23的抗體。
30．人類血液標本，其中已經加入抑制或減輕HIV感染的有效量的權利要求24的抗體。
31．權利要求1或7的分子結構，其中所述包膜蛋白或宿主細胞膜蛋白還含有親和標記物。
32．權利要求2的分子結構，其中所述包膜蛋白、CD4或共同受體還含有親和標記物。
33．權利要求23的抗體，它為標記的抗體。
34．一種試劑盒，它在一個或多個容器中裝有抗權利要求1的分子結構的標記的單克隆抗體。
35．一種試劑盒，它在一個或多個容器中裝有抗權利要求2的分子結構的標記的單克隆抗體。
36．權利要求34的試劑盒，它還在獨立的容器中裝有權利要求1的分子結構。
37．權利要求35的試劑盒，它還在獨立的容器中裝有權利要求2的分子結構。
38．一種細胞系，它重組表達包膜病毒的包膜蛋白或者所述包膜蛋白的突變型，所述包膜蛋白在所述病毒包膜與宿主細胞膜融合時起作用，所述突變型是融合缺陷的，所述細胞系表達一種或多種起所述包膜蛋白受體作用的細胞膜蛋白。
39．權利要求38的細胞系，其中重組表達所述一種或多種起受體作用的蛋白。
40．重組表達HIV gp160的細胞系，該細胞系表達CD4和HIV的共同受體；所述細胞系缺乏裂解gp160產生gp120和gp41的功能蛋白酶。
41．治療或預防受試者病毒感染的方法，包括給予所述受試者治療或預防所述病毒感染的免疫有效量的權利要求1或7的分子結構。
42．治療或預防受試者病毒感染的方法，包括給予所述受試者治療或預防所述病毒感染的免疫有效量的權利要求10的分子結構。
43．治療或預防受試者病毒感染的方法，包括給予所述受試者治療或預防所述病毒感染的免疫有效量的權利要求12的分子結構。
44．治療或預防人類HIV感染的方法，包括給予所述人類對象治療或預防HIV感染的免疫有效量的權利要求2的分子結構。
45．治療或預防人類HIV感染的方法，包括給予所述人類對象治療或預防HIV感染的免疫有效量的權利要求3-6任何一項的分子結構。
46．權利要求41的方法，其中所述受試者是人類。
47．權利要求41的方法，其中所述受試者是家畜。
48．治療或預防受試者病毒感染的方法，包括給予所述受試者治療或預防所述病毒感染的有效量的權利要求23的單克隆抗體。
49．治療或預防人類HIV感染的方法，包括給予所述人類對象治療或預防HIV感染的有效量的權利要求24的單克隆抗體。
50．權利要求49的方法，其中所述人類對象的HIV感染風險高。
51．治療或預防人類胎兒HIV感染的方法，包括將治療或預防所述胎兒HIV感染的有效量的權利要求24的單克隆抗體給予孕育所述胎兒的孕婦。
52．權利要求49的方法，它用於治療所述人類對象的AIDS。
53．抑制血液標本的病毒感染的方法，包括使所述血液標本與抑制所述病毒感染的有效量的權利要求23的單克隆抗體接觸。
54．抑制人類血液標本的HIV感染的方法，包括使所述人類血液標本與抑制HIV感染的有效量的權利要求24的單克隆抗體接觸。
55．外科或牙科工具的去汙染方法，包括使所述工具與抑制所述病毒感染有效量的權利要求23的單克隆抗體接觸。
56．外科或牙科工具的去汙染方法，包括使所述工具與抑制HIV感染有效量的權利要求24的單克隆抗體接觸。
57．一種方法，該方法用於監測在預先給予一定量的權利要求1或7的分子結構的受試對象體內產生的針對權利要求1或7的分子結構的抗體，包括從所述受試者分離包括血清在內的標本；以及檢測所述血清中存在的針對權利要求1或7的分子結構的任何抗體。
58．權利要求57的方法，其中所述檢測用一種方法進行，該方法包括用抗權利要求1或7的分子結構的標記抗體進行競爭性免疫測定。
59．用於疫苗的免疫原的製備方法，所述疫苗用於治療或預防病毒感染，該製備方法包括以下所示順序的步驟(a)使包膜病毒的包膜蛋白或其嵌合型、或所述包膜蛋白的突變型或其嵌合型與一種或多種細胞蛋白或其嵌合型接觸，其中所述包膜蛋白在所述病毒包膜與細胞膜融合時起作用，所述突變型是融合缺陷的，所述細胞膜蛋白起所述包膜蛋白受體的作用；和(b)使所述包膜蛋白或其嵌合型、或其突變型或嵌合型和所述一種或多種宿主細胞蛋白或其嵌合型，與一種交聯劑接觸；和(c)分離含有所述包膜蛋白或其嵌合型、或其突變型或嵌合型的交聯結構。
60．權利要求59的方法，其中所述病毒是HIV，而所述宿主細胞蛋白是人CD4和HIV的共同受體。
61．用於疫苗的免疫原的製備方法，所述疫苗用於治療或預防HIV感染，該製備方法包括以下所示順序的步驟(a)共培養以下第一種和第二種細胞，所述第一種細胞重組表達HIV包膜蛋白或其嵌合型、所述包膜蛋白的突變型或其嵌合型，該突變型是融合缺陷的；所述第二種細胞表達(ⅰ)人CD4或其嵌合型和(ⅱ)HIV的共同受體或其嵌合型；和(b)使所述包膜蛋白或其嵌合型、或其突變型或嵌合型和所述CD4或其嵌合型以及共同受體或其嵌合型，與一種交聯劑接觸；和(c)分離含有所述包膜蛋白或其嵌合型、或其突變型或嵌合型的交聯結構。
62．權利要求61的方法，其中所述第二種細胞重組表達CD4或所述共同受體或同時表達CD4和所述共同受體、或前述任何一種的嵌合型。
63．權利要求61的方法，其中所述第一種和第二種細胞是相同細胞類型。
64．權利要求61的方法，其中所述第一種和第二種細胞為不同細胞類型。
65．權利要求59的方法，其中在步驟(a)中，所述包膜蛋白或其嵌合型、或其突變型或嵌合型存在於病毒顆粒或病毒樣顆粒上。
66．權利要求61的方法，其中所述交聯結構是交聯的細胞複合物。
67．權利要求59的方法，其中所述病毒選自逆轉錄病毒科、彈狀病毒科、日冕形病毒科、線狀病毒科、痘病毒科、本揚病毒科、黃病毒科、披蓋病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科和皰疹病毒科。
68．權利要求65的方法，其中所述接觸步驟的進行是用表達所述包膜蛋白或其嵌合型、或其突變型或嵌合型的所述病毒感染表達所述宿主細胞蛋白的細胞。
69．權利要求59的方法，其中接觸嵌合型的所述包膜蛋白或所述宿主細胞蛋白之一，所述嵌合型含有親和標記物。
70．權利要求61的方法，其中接觸嵌合型的所述包膜蛋白或CD4或所述共同受體，所述嵌合型含有親和標記物。
71．用於疫苗的免疫原的製備方法，所述疫苗用於治療或預防HIV感染，該製備方法包括以下所示順序的步驟(a)共培養以下第一種和第二種細胞，所述第一種細胞重組表達HIV包膜蛋白或其嵌合型、所述包膜蛋白的突變型或其嵌合型，該突變型是融合缺陷的；所述第二種細胞表達(ⅰ)人CD4或其嵌合型和(ⅱ)HIV的共同受體或其嵌合型，其中表達至少一種含有親和標記物的所述嵌合型；和(b)在非變性條件下裂解所述共培養的細胞，形成細胞裂解物；和(c)從所述細胞裂解物分離含有所述包膜蛋白或其嵌合型、或其突變型或嵌合型的分子結構，所用的分離方法包括使所述細胞裂解物與所述親和標記物的結合配偶體接觸，回收與所述親和標記物結合的分子結構。
72．一種交聯結構，它是權利要求59的方法的產物。
73．一種交聯結構，它是權利要求60的方法的產物。
74．一種交聯結構，它是權利要求61的方法的產物。
75．一種交聯結構，它是權利要求62的方法的產物。
76．針對權利要求60的結構的單克隆抗體，它在體外中和以下HIV初級分離株92US657、92US660、92RW023、93IN101、92UG035和92TH023。
77．避孕的凝膠、泡沫狀物、乳膏或軟膏，它們含有抑制或減輕HIV感染有效量的權利要求76的抗體。
78．治療或預防受試者病毒感染的方法，包括給予所述受試者治療或預防所述病毒感染的免疫有效量的權利要求72的結構。
79．治療或預防人類HIV感染的方法，包括給予所述人類對象治療或預防HIV感染免疫有效量的權利要求73的分子結構。
80．治療或預防人類HIV感染的方法，包括給予所述人類對象治療或預防HIV感染免疫有效量的權利要求74的分子結構。
81．去除外科或牙科工具汙染的方法，包括使所述工具與抑制HIV感染有效量的權利要求76的單克隆抗體接觸。
82．去除外科或牙科工具汙染的方法，包括使所述工具與抑制所述病毒感染有效量的權利要求23的單克隆抗體接觸。
83．篩選具有疫苗作用的分子結構的方法，包括用權利要求2的分子結構免疫轉基因的非人類哺乳動物，其中所述轉基因的非人類哺乳動物由一種或多種轉基因同時表達人CD4和HIV的共同受體；以及檢測由所述哺乳動物產生的任何抗HIV的中和抗體。
84．篩選具有疫苗作用的分子結構的方法，包括用權利要求1的分子結構免疫轉基因的非人類哺乳動物，其中所述轉基因的非人類哺乳動物由一種或多種轉基因表達一種或多種宿主細胞膜蛋白；以及檢測由所述哺乳動物產生的任何抗所述病毒的中和抗體。
85．權利要求83的哺乳動物，它為小鼠。
86．權利要求61的方法，其中所述第一種細胞重組表達HIV包膜蛋白或其嵌合型。
87．一種試劑盒，它在一個或多個容器中含有權利要求1的分子結構。
88．權利要求87的試劑盒，它還含有藥學上可接受的載體，而其中所述分子結構的含量為免疫量。
89．一種分離的蛋白複合物，它含有與人CD4和人CCR5有效作用的1型人類免疫缺陷病毒的包膜蛋白。
90．一種疫苗製劑，它含有權利要求89的蛋白複合物和藥學上可接受的載體。
91．免疫動物抵抗病毒的方法，包括以下步驟給予所述動物含有蛋白複合物的權利要求90的疫苗製劑，所述蛋白複合物包含一種或多種與一種或多種宿主細胞受體或共同受體有效作用以介導病毒結合、進入和/感染的病毒蛋白；因此產生抗所述病毒的中和抗體。
92．製備包含一種或多種與一種或多種宿主細胞受體或共同受體有效作用以介導病毒結合、進入和/感染的病毒蛋白的蛋白複合物的方法，包括以下步驟a)培養第一種表達一種或多種病毒蛋白的細胞；b)培養第二種表達一種或多種宿主細胞受體或所述一種或多種病毒蛋白的共同受體的細胞；c)共培養所述第一種和第二種細胞；d)在細胞與細胞融合期間固定所述共培養物；和e)分離所述固定細胞。
93．用權利要求92的方法製備的固定細胞。
94．純化含有與人CD4和人CCR5有效作用的1型人類免疫缺陷病毒的包膜蛋白的蛋白複合物的方法，包括以下步驟a)用有助於隨後的純化的肽序列標記所述複合物；和b)分離所述標記複合物。
95．治療或預防受試者病毒感染的方法，包括給予所述受試者(a)第一種編碼包膜病毒的包膜蛋白的核酸；和(b)第二種編碼一種或多種細胞膜蛋白的核酸，所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在合適的條件下必須並足以融合所述病毒包膜與含有所述細胞膜蛋白的細胞膜，這樣使得所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在所述受試者體內表達，並產生針對所述病毒的中和抗體。
96．權利要求95的方法，其中所述第一種和第二種核酸相同。
97．權利要求95的方法，其中所述第一種和第二種核酸是不同的核酸載體。
98．權利要求95的方法，其中所述包膜蛋白是HIV的包膜蛋白，而所述細胞膜蛋白是CD4和HIV共同受體。
99．一種疫苗製劑，它含有(a)第一種編碼包膜病毒的包膜蛋白的核酸；和(b)第二種編碼一種或多種細胞膜蛋白的核酸，所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在合適的條件下必須並足以融合所述病毒包膜與含有所述細胞膜蛋白的細胞膜，這樣使得所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在所述受試者體內表達，並產生針對所述病毒的中和抗體；和(c)藥學上可接受的載體。
100．治療接觸了病毒的宿主或預防宿主感染所述病毒的方法，該方法包括以下步驟給予所述宿主治療或預防所述宿主感染有效量的抗體，該抗體是用權利要求89的蛋白複合物免疫動物產生的。
101．一種分離的蛋白複合物，它含有與人CD4和人CCR5有效作用的1型人類免疫缺陷病毒的包膜蛋白，其中用肽標記所述包膜蛋白、CD4或CCR5中一種或多種。
102．一種試劑盒，它在一個或多個容器中裝有(a)第一種編碼包膜病毒的包膜蛋白的核酸；和(b)第二種編碼一種或多種細胞膜蛋白的核酸，所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在合適的條件下必須並足以融合所述病毒包膜與含有所述細胞膜蛋白的細胞膜，這樣使得所述包膜蛋白和細胞膜蛋白在所述受試者體內表達，並產生針對所述病毒的中和抗體。
103．一種組合物，它含有(a)權利要求23的單克隆抗體；(b)包膜病毒的所述包膜蛋白；和(c)藥學上可接受的載體。
104．治療或預防受試者病毒感染的方法，包括給予所述受試者治療或預防所述病毒感染有效量的權利要求103的組合物。
105．權利要求92的方法，其中牛痘病毒載體用來在所述第二種細胞中表達所述一種或多種宿主細胞受體或共同受體。
106．權利要求92的方法，其中牛痘病毒載體用來在所述第一種細胞中表達所述一種或多種病毒蛋白。
全文摘要
本發明涉及產生含有一種或多種過渡融合相關決定簇的融合相關分子結構(FRMS)。可構建高效疫苗,它為免疫系統提供所述相關融合決定簇,產生能夠有效中和來自世界各地和不同系統發育病毒進化枝的廣泛的初級分離株的獨特抗體。本發明提供形成、分離和純化FRMS的方法,以及在各種組合物和方法中使用這種FRMS,包括例如用作疫苗免疫原、診斷試劑和治療藥物。本發明涉及能夠激發產生針對病毒病原體和病毒初級分離株的中和抗體的FRMS。針對所述FRMS的抗體可用來研究所述病毒和宿主細胞融合的分子途徑以及鑑定抗體介導的對所述途徑的阻斷的可能位點。本發明還涉及應用本發明抗體用於抗病毒劑、血液製品添加劑、避孕藥添加劑和接觸後治療或胎兒免疫的被動免疫接種。
文檔編號A61P31/18GK1321165SQ9981164
公開日2001年11月7日 申請日期1999年8月3日 優先權日1998年8月3日
發明者J·H·農博格 申請人:蒙他拿州大學