一種通過花葯培養獲得百脈根再生植株的方法
2023-12-12 07:18:37 3
專利名稱：一種通過花葯培養獲得百脈根再生植株的方法
技術領域：
本發明涉及一種通過花葯培養獲得百脈根(Lotus corniculatus Linn)再生植株的方法，屬於牧草育種技術領域。
背景技術：
百脈根(Lotus corniculatus Linn)原產於歐、亞溫暖地帶,是豆科百脈根屬多年生牧草。具有產草量高、綠期長、蛋白含量高(孕蕾期粗白質含量在26. 15%)、營養豐富、適口性好且家畜採食後不發生鼓脹等優點。百脈根具有耐熱、耐水淹、耐瘠薄、耐酸等特點，是我國溫暖溼潤地區極有希望的優良牧草。因此，開展百脈根的育種研究工作對於南方草地畜牧業的發展具有十分重要的意義。
栽培百脈根為同源四倍體，自交不親和，具有高度的雜合性，採用常規育種進程緩慢、效率差。利用花葯培養技術不僅可以縮短育種周期、提高選擇效率且可以得到性狀豐富的單倍體或純合二倍體材料。Guha (1964) >MaheshwariC 1966)以毛曼陀羅(Datura innoxiamill.)的花葯為外植體獲得了再生植株，至此花葯培養在植物細胞遺傳學、遺傳學和育種等方面得到了廣泛應用。近年來，花葯培養已與常規雜交育種、誘變育種以及轉基因技術相結合，形成了一套行之有效的育種技術體系，已經成為工程育種的重要組成部分，利用花葯培養產生的DH (加倍單倍體)群體也是構建遺傳圖譜的優良群體。本發明以百脈根花葯為材料，建立了一套適合百脈根簡單、快速、穩定的花葯培養體系，為百脈根的單倍體育種及其遺傳作圖群體DH群體的構建等提供前期準備工作。這對百脈根的遺傳改良、新品種的選育及南方草地畜牧業的發展都有著極其重要的意義。
發明內容
本發明的目的在於提供一種獲得百脈根(Lotus corniculatus Linn)單倍體植株的方法，即以百脈根花葯為外植體，進行離體培養，花葯內的小孢子發育成單倍體植株。本發明方法包括外植體的準備、愈傷組織的誘導、愈傷組織的分化培養、芽生根的步驟，其具體如下a.外植體的準備選單核靠邊期的花葯滅菌處理備用；b.愈傷組織的誘導無菌環境下剝出花葯，接種於愈傷組織誘導培養基上，該培養基的配方為 NB+2，4-DO. 5mg/L+NAA0. 3mg/L+KT2. 0mg/L,蔗糖 90g/L，瓊脂 6g/L，pH5. 8 ;接種密度為40-50個/皿，用封口膜封口後，放置於生化培養箱25°C暗培養至長出愈傷組織，然後利用ΝΒ+ΝΑΑ0. 3mg/L+2, 4-DO. 3mg/L,蔗糖30g/L，瓊脂6g/L，pH5. 8繼代培養，培養條件溫度25±2°C，16h光照、8h黑暗，溼度50-70%，光照強度1500-20001x。其中NB為培養基代號，表I為配方成分；2，4-D為2，4- 二氯苯氧乙酸；NAA為α -萘乙酸；KT為激動素。c.愈傷組織的分化培養將愈傷組織繼代2-3次，每次15d ;然後轉入愈傷組織分化培養基，誘導芽的分化；分化培養基的配方為MS+KT1. 5mg/L+NAA0. 5mg/L,蔗糖30g/L,瓊脂6g/L，pH5. 8 ;培養條件溫度25±2°C，16h光照、8h黑暗，溼度50_70%，光照強度2000-25001x ；d.生根培養分化培養30d後，將產生的不定芽轉入MS基本培養基進行不定芽復壯培養；不定芽長至2-3cm時轉入1/2MS+0. 5mg/L NAA，蔗糖10g/L，瓊脂6g/L，pH5. 8的培養基進行生根培養；培養條件為溫度25±2°C，16h光照、8h黑暗，溼度50-70%，光照強度2500-30001x。其中MS為培養基代號，表2為配方成分。f.再生苗的獲得轉入生根培養基15-20d後，開始煉苗。先將封口揭開，在人工氣候箱中煉苗3d，保證每天澆適量蒸餾水；然後在光照培養間(溫度(25±2) °C，16h光照、8h黑暗，溼度60-80%，光照強度2500-30001x)煉苗3d後開始移栽，移栽前將苗根部殘留的培養基衝洗乾淨，移栽到已經過滅菌的基質(蛭石珍珠巖營養土 =5:3:2，可加少許O. 5%的標典3721生根液)上室內培養10-15d後便可移栽到大田。本發明以豆科重要牧草百脈根的花葯為外植體，進行離體培養，從而快速高效獲 得具有親本遺傳基因的單倍體植株。單倍體植株加倍後，不僅可以縮短育種周期、提高選擇效率且可以得到性狀豐富、純合原倍性材料。近年來分子生物學的發展，將單倍體作為轉基因受體可以較少多倍體的複雜程度，更好的驗證和分析基因功能；利用基因組學研究百脈根的特異性狀也表現的越來越重要，花葯培養構建DH純系或DH群體是基因組學研究的理想材料。
圖1是本發明方法示意圖。圖2是培養各步驟的照片。A接種花葯；(B-C)暗培養20d的愈傷組織；D愈傷組織的繼代培養；E胚狀體的誘導；F不定芽；G芽的復壯培養；(H-J)芽的生根培養；(K-L)再生苗的獲得。
具體實施例方式實施例1、以百脈根(Lotus corniculatus Linn)單核靠邊期的花葯為外植體,離體培養獲得百脈根再生植株。操作過程如圖1，具體過程如下a.百脈根單核靠邊期花葯的選擇I)、所選百脈根市售品種「裡奧」為材料，於10月初播種，次年4月下旬開始，在晴天上午9:00點-11:00點採集2mm左右、綠色、苞片與花蕾等長、呈刀尖狀的花蕾(使用醋酸洋紅染色壓片法，觀察、確定發育時期)。此時的花蕾大都處於單核靠邊期。2)、將上述花蕾裝入小牛皮紙袋，用冰盒迅速帶至實驗室，放入4°C冰箱中2-3d。b.外植體的滅菌及接種I)、將上述低溫處理過的花蕾包入紗布，放入超淨工作檯滅過菌的培養皿中，然後用無菌水衝洗3次，酒精30s，無菌水衝洗3次，再用5%的次氯酸鈉滅菌15min，無菌水衝洗3次。2)、在超淨工作檯中，將滅過菌的材料轉至滅好菌的培養皿(墊滅菌的濾紙)置於體式顯微鏡下，用滅菌的一次性注射器(5ml)剝離花葯，接種於愈傷組織誘導培養基上。c.愈傷組織的誘導與繼代
I)、愈傷組織誘導培養基的配方為 NB+2，4-DO. 5mg/L+NAA0. 3mg/L+KT2. Omg/L,蔗糖90g/L，瓊脂6g/L，ρΗ5· 8。培養基滅菌條件壓力1. Okg/cm2以上，121°C滅菌22min。2)、愈傷組織誘導培養基接種密度為40-50個/皿(圖2A)，用美國Parafilm封口膜封口後，放置於生化培養箱25°C暗培養20d左右(圖2B，2C)。3)、等長出愈傷組織後利用 NB+NAAO. 3mg/L+2, 4-DO. 3mg/L,鹿糖 30g/L,瓊脂 6g/L，pH5. 8繼代培養(圖2D)。培養基滅菌條件壓力1. Okg/cm2以上，121°C滅菌22min。培養條件溫度(25±2) °C,16h光照、8h黑暗，溼度50-70%，光照強度1500_20001χ。d.愈傷組織的分化培養I)、將愈傷組織繼代2-3次，每次15d。然後轉入愈傷組織分化培養基，誘導芽的分化(圖2E)。 2)、分化培養基的配方為 MS+KT1. 5mg/L+NAA0. 5mg/L,蔗糖 30g/L,瓊脂 6g/L，pH5. 8。培養基滅菌條件壓力1. Okg/cm2以上，121 °C滅菌22min。培養條件溫度(25±2) °C,16h 光照、8h 黑暗，溼度 50-70%，光照強度 2000_25001x。3)、上述分化培養一般需要30d左右，就會有不定芽產生(圖2F)。e.生根培養I)、將上述產生的不定芽轉入MS基本培養基進行不定芽復壯培養(圖2G)。復壯培養的培養基為MS+20g/L蔗糖，瓊脂6g/L，pH5. 8。培養基滅菌條件壓力1. Okg/cm2以上，121°C滅菌22min。培養條件溫度(25±2) °C,16h光照、8h黑暗，溼度50_70%，光照強度2000-25001x。2)、不定芽長至2_3cm時轉入生根培養基(圖2H，21 )，這個過程一般需要6_9d。3)、上述 2)中的生根培養基為 1/2MS+0. 5mg/LNAA，蔗糖 10g/L，瓊脂 6g/L，pH5. 8的培養基。培養基滅菌條件壓力l.Okg/cm2以上，121°C滅菌22min。培養條件為溫度(25±2) °C,16h 光照、8h 黑暗，溼度 50-70%,光照強度 2500_30001χ。4)、在生根培養基中培養15-20d後，便可以產生大量根系(圖2H，2I，2J)。f.再生苗的獲得I)、將產生根系的再生苗封口膜揭開，在人工氣候箱中培養3d，保證每天澆適量蒸餾水。培養條件培養間溫度(25±2) °C,16h光照、8h黑暗，溼度60-80%，光照強度2500-30001x2)、經過I)的步驟後，轉入光照培養間培養3d，保證每天澆適量蒸餾水。培養條件:溫度(25±2) °C,16h光照、8h黑暗，溼度60-80%，光照強度2500_30001χ。3)、經過2)的步驟後，將苗根部殘留的培養基衝洗乾淨，移栽到已經過滅菌的基質(蛭石珍珠巖營養土 =5:3:2，可加少許0. 5%的標典3721生根液)上室內培養10_15d後便可移栽到大田(圖2K，2L)。其中，①.醋酸洋紅染色過程將花蕾用卡諾固定液固定20_24h，保存在70%的酒精中，1%的醋酸洋紅染色，染色l_5min。顯微觀測。(卡諾固定液無水乙醇3份，冰醋酸I份；1%的醋酸洋紅洋紅lg，45%醋酸IOOml。)②.以上操作中b_d需在無菌環境下進行。③.無菌水製作過程超純水壓力1. Okg/cm2以上，121°C滅菌25分鐘。在操作者雙手需75%酒精消毒(75%的酒精用無水乙醇配製)。反覆使用的器皿同樣需壓力l.Okg/cm2以上，121°C滅菌25min。④.培養基配方如表1，表2 ；1/2MS即為在MS的基礎上大量元素減半，其他成分不變。大量元素、微量元素及有機成分均訂購於上海國藥集團，激素為Sigma進口分裝。表INB培養基配方
權利要求
1.一種通過花葯培養獲得百脈根再生植株的方法，包括外植體的準備、愈傷組織的誘導、愈傷組織的分化培養、芽生根的步驟，其特徵在於a.外植體的準備選單核靠邊期的花葯滅菌處理備用；b.愈傷組織的誘導無菌環境下剝出花葯，接種於愈傷組織誘導培養基上，該培養基的配方為 NB+2，4-D 0.5 mg/L+NAA 0.3 mg/L +KT 2.0 mg/L，蔗糖 90 g/L，瓊脂 6 g/L，pH 5.8 ;接種密度為40-50個/皿，用封口膜封口後，放置於生化培養箱25 1暗培養至長出愈傷組織，然後利用 NB+NM 0.3 mg/L + 2，4-D 0.3 mg/L，蔗糖 30 g/L，瓊脂 6 g/L, pH 5.8 繼代培養，培養條件溫度25±2 °C, 16 h光照、8 h黑暗，溼度50-70 %，光照強度1500-2000 Ix ；c.愈傷組織的分化培養將愈傷組織繼代2-3次，每次15d ;然後轉入愈傷組織分化培養基，誘導芽的分化；分化培養基的配方為MS+ KT 1.5 mg/L+ NAA 0.5 mg/L，蔗糖30 g/ L，瓊脂6 g/L,pH 5.8 ;培養條件溫度25±2 °C, 16 h光照、8 h黑暗，溼度50_70%，光照強度 2000-2500 Ix ；d.生根培養分化培養30d後，將產生的不定芽轉入MS基本培養基進行不定芽復壯培養;不定芽長至2-3 cm時轉入1/2 MS+0. 5 mg/L NAA，蔗糖10 g/L，瓊脂6 g/L, pH 5. 8 的培養基進行生根培養；培養條件為溫度25±2 °C, 16 h光照、8 h黑暗，溼度50-70 %，光照強度 2500-3000 Ix。
全文摘要
本發明涉及一種通過花葯培養獲得百脈根再生植株的方法，屬於牧草育種技術領域。本方法的步驟為A)取單核靠邊期花蕾，用冰盒帶至實驗室後4℃冷藏2-3d；B)次氯酸鈉消毒後利用體式顯微鏡剝離後置於愈傷組織誘導培養基上培養；C)暗培養20d後，繼代3-4次，每次間隔15d。將繼代後的愈傷組織置於不定芽誘導培養基上培養，誘導愈傷組織形成芽；D)芽復壯培養後，置於生根培養基上培養15-20d，誘導根，E)煉苗後移栽可獲得再生苗。以上操作中，B)-D)均在無菌環境中進行，C)中的暗培養需藉助生化培養箱，C)中不定芽的形成和D)中根的形成均需要人工氣候箱。
文檔編號A01H4/00GK103004599SQ20121055830
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者魏臻武, 武自念, 鄭曦, 陳斐, 朱平華 申請人:揚州大學