一種微生物轉化製備(s)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈的方法

2023-12-12 21:49:52 1

專利名稱：一種微生物轉化製備(s)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈的方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物轉化製備⑶-3-羥基-3- (2-噻吩基)-丙腈的方法，特別涉及一種以釀酒酵母CGMCC No. 2266發酵獲得的含酶菌體細胞再製備的固定化細胞顆粒為生物催化劑，以3-羰基-3- (2-噻吩基)-丙腈為底物製備(S) -3-羥基-3- (2-噻吩基)-丙腈的方法。
背景技術：
(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈((S)-3-hydroxy-3-(2-thienyl) propanenitrile)，分子式C7H7NOS,分子量153。(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)_丙腈是合成抗抑鬱藥物度洛西汀的關鍵手性中間體之一。度洛西汀是一種新型抗抑鬱藥，是人腦中兩種重要的神經遞質五羥色胺和去甲腎上腺素再攝取的雙重抑制劑，能夠有效地治療抑鬱的情緒症狀和軀體症狀。抑鬱症是一種嚴重的身心疾患，在全球的患病率呈不斷上升趨勢。現有的抗抑鬱藥物對於治療抑鬱的情緒症狀，如哭泣、悲傷等療效比較顯著，但對於治療抑鬱症軀體症狀的治療不是十分理想。度洛西汀的雙通道作用機制使它在有效控制患者情緒症狀的同時，還能有效緩解由抑鬱引起的軀體疼痛症狀。彌補了當前主流抗抑鬱藥在軀體疼痛症狀治療方面的不足，是一種作用全面的新型抗抑鬱藥物。文獻報導中(S)-3_羥基-3-(2-噻吩基)_丙腈可以通過脂肪酶拆分外消旋體 3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈來獲得。例如，2006年美國專利US7045341中Kamal等人採用脂肪酶催化轉酯化拆分3-羥基-3-(2-噻吩基)_丙腈合成(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈，固定化pseudomonas cepacia脂肪酶500mg在溶劑異丙醚IOOmL中拆分5mmoL 外消旋3-羥基-3- (2-噻吩基)-丙腈，醯基供體乙酸乙烯酯25mmoL，溫度25°C，時間14h， 產物(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈產率為42%，光學純度大於99% ee。該過程底物外消旋體3-羥基-3- (2-噻吩基)-丙腈的理論最高拆分效率只有50 %，反應過程中產生的副產物為分離提取帶來困難，因此外消旋體拆分法製備( -3-羥基-3- (2-噻吩基)-丙腈不是理想的工業化過程。而採用不對稱還原3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙腈製備(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)_丙腈理論上可以將底物100%地轉化為產物，沒有副產物的生成，因此羰基不對稱還原過程是製備(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)_丙腈的理想途徑。採用化學法和生物法都可以實現3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈的不對稱還原。採用化學法進行羰基不對稱還原反應需要化學催化劑，這類具有手性不對稱還原能力的化學催化劑製備過程中均需要價格昂貴的金屬，催化劑的製備過程價格昂貴而繁瑣， 催化劑的製備成為了制約生產成本的關鍵因素。生物法包括酶法和微生物法兩種。酶法中所需要的不對稱還原酶要經過分離提取純化等工藝過程，較為繁瑣和麻煩，不對稱還原酶應用於還原反應過程時要添加價格昂貴的輔酶NAD(P)H,因此酶法不對稱還原製備-3-羥基-3- (2-噻吩基)-丙腈成本較高。採用微生物法不對稱還原3-羰基-3- (2-噻吩基)_丙腈是利用微生物產生的不對稱還原酶還原3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈，微生物容易實現大規模培養，成本較低，環境友好，生產效率高，理論上可以將底物100%地轉化為(S) -3-羥基-3- (2-噻吩基)-丙腈，沒有副產物生成，微生物法不對稱還原3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈是製備(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)_丙腈的較佳途徑。在微生物催化的不對稱還原反應過程中，底物3-羰基-3- (2-噻吩基)-丙腈和產物(S) -3-羥基-3- (2-噻吩基)-丙腈均為水不溶性化合物，微生物細胞在水相中轉化3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈的過程存在著物質在相界面傳遞的阻力，同時有機底物會對微生物細胞存在一定的毒害而降低反應速率。微生物細胞在生物相容性較好的有機溶劑中同樣具有較高的生物活性，因此選用合適的生物相容性的有機溶劑做為反應介質，可以提高催化效率，簡化分離提取工藝。採用固定化微生物細胞應用於有機介質中催化羰基不對稱還原反應有利於實現反應過程的連續化，有利於實現產物的後續分離提取，有利於實現微生物細胞的重複利用，是實現工業化製備(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)_丙腈的一種新方法。

發明內容
本發明目的是提供一種微生物轉化製備(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)_丙腈的方法，該方法環境友好、反應條件溫和；微生物易於大規模培養，成本低廉，生產菌株安全無毒，提高了生物轉化的生產效率。本發明採用的技術方案是一種微生物轉化製備(S)-3_羥基-3-(2-噻吩基)_丙腈的方法，所述方法是以 3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈為底物，以釀酒酵母菌株CGMCC No. 2266發酵獲得的發酵液再製得的固定化細胞顆粒為生物催化劑，進行轉化反應製得(S)-3-羥基-3-(2-噻吩
基)_丙月青。進一步，所述的⑶-3-羥基-3- (2-噻吩基)-丙腈的製備方法為以3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙腈為底物，以釀酒酵母菌株CGMCC No. 2266發酵獲得的發酵液再製得的固定化細胞顆粒為生物催化劑，以鄰苯二甲酸二丁酯為溶劑組成生物轉化體系，於20 40°C轉化反應8 72小時，轉化液經分離純化得到產物(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈。所述的3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙腈的初始濃度為0.01 3mol/L，優選為 0. 01 lmol/L，更優選 0. 2mol/L。本發明所述的生物轉化體系中每升鄰苯二甲酸二丁酯含有的菌體乾重相當於以包埋法將0. 330L菌體濃度為3. 0 10. Og/L的發酵液製成固定化細胞顆粒在發酵培養基中20 40°C增殖培養16 72小時後獲得的增殖培養後的固定化細胞顆粒的菌體乾重； 所述發酵液中菌體濃度定義為單位體積發酵液中所含有的菌體的乾重。所述的生物催化劑按以下方法製備將經釀酒酵母菌株CGMCCNo. 2266發酵培養獲得的發酵液與等體積質量濃度1 5%的海藻酸鈉水溶液混合，攪拌均勻，得到含有菌體的海藻酸鈉混合液，將含有菌體的海藻酸鈉混合液逐滴滴入質量濃度為2. 5 4. 0%的氯化鈣水溶液中，連續攪拌，獲得固定化懸浮液，將懸浮液於35 38°C下固化，獲得固定化細胞顆粒，所述的固定化細胞顆粒用無菌生理鹽水洗滌後分散於發酵培養基中20 40°C增殖培養16 7 獲得增殖培養後的固定化細胞顆粒，以增殖培養後的固定化細胞顆粒為生物催化劑，所述的發酵液中菌體濃度為2. 0 25. Og/L ；所述氯化鈣水溶液的體積用量以能使固定化細胞顆粒懸浮為宜，一般推薦每10 400mL含有菌體的海藻酸鈉混合溶液中氯化鈣水溶液的體積用量為100 IOOOmL ；所述的用於固定化細胞顆粒增殖培養的發酵培養基的用量以使固定化細胞顆粒懸浮為宜，發酵培養基的體積用量一般推薦為每10 300g固定化細胞顆粒加入100 IOOOmL發酵培養基。所述的固定化細胞顆粒的直徑為1 5mm，優選為2mm，增殖培養後的固定化細胞
顆粒的直徑基本沒有變化。微生物在固定化細胞顆粒中的增殖培養不會導致固定化細胞顆粒的大小發生太大變化，本發明所述增殖培養後的固定化細胞顆粒大小與增殖培養前固定化細胞顆粒大小相比，變化不大，對本發明結果沒有影響。進一步，所述的生物催化劑具體按照如下方法獲得將發酵液與等體積2%的海藻酸鈉水溶液混合，所述的發酵液菌體濃度為4. 3g/L，攪拌均勻得到含有菌體的海藻酸鈉混合液，將含有菌體的海藻酸鈉混合液逐滴滴入質量濃度為3. 5%的氯化鈣水溶液中，連續攪拌，含有菌體的海藻酸鈉混合液固化形成凝膠珠固定化顆粒，獲得固定化懸浮液，將固定化懸浮液在37°C條件下固化，獲得固定化細胞顆粒，所述的固定化細胞顆粒用無菌生理鹽水洗滌後分散於發酵培養基中30°C進行增殖培養Mh，過濾，獲得增殖培養後的固定化細胞顆粒，以增殖培養後的固定化細胞顆粒作為生物催化劑。所述的反應結束後，從生物轉化體系中獲得(S) -3-羥基-3- (2-噻吩基)-丙腈純品的方法為反應結束後，將轉化液過濾除去固定化細胞顆粒，將濾液旋轉蒸發除去溶劑鄰苯二甲酸二丁酯得到混合物，將混合物採用矽膠柱層析分離，矽膠型號100目，柱床高徑比 10 1，先採用體積比為80 20石油醚和丙酮的混合液洗脫至無雜質峰出現棄去洗脫液， 再用體積比70 30石油醚和丙酮的混合液洗脫至無目標產物吸收峰出現為止，收集洗脫液，乾燥，即可獲得產物(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈，用體積比60 40的石油醚和丙酮的混合液洗脫矽膠層析柱回收利用。所述的發酵液按照以下步驟製備(1)斜面培養將釀酒酵母CGMCC No. 2266菌體接種到斜面培養基，沈 35°C培養 4 6天，得菌體斜面；所述的斜面培養基終濃度組成麥芽汁0. 5 1. 5g/L，酵母粉0. 2 0. 4g/L，蛋白腖0. 4 0. 6g/L，葡萄糖0. 7 1. 2g/L，瓊脂1. 5 2. 5g/L，自然pH值，溶劑為水；(2)種子培養從菌體斜面取一接種環菌體轉接到種子培養基，26 35°C， 150 200r/min，搖床培養18 2 得種子液；所述的種子培養基終濃度組成為葡萄糖 2. 6 3. 2g/L，酵母粉 0. 2 0. 4g/L，硫酸銨 0. 3 0. 6g/L，無水 MgSO4O. 02 0. 04g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 05 0. 15g/L，KH2PO4O. 06 0. 15g/L，自然 pH 值，溶劑為水；(3)發酵培養取種子液，以體積分數10 20%的接種量接種於發酵培養基中， 26 35°C，150 200r/min，搖床培養18 30h得發酵液；所述發酵培養基終濃度組成為葡萄糖2. 6 3. 2g/L，酵母粉0. 2 0. 4g/L，硫酸銨0. 3 0. 6g/L，無水MgSO4O. 02 0. 04g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 05 0. 15g/L, KH2PO4O. 06 0. 15g/L,自然 pH 值，溶劑為水。所述的(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)_丙腈的製備方法推薦按照以下步驟進行(1)斜面培養將釀酒酵母CGMCC No. 2266菌體接種到斜面培養基，沈 35°C培養 4 6天，得菌體斜面；所述的斜面培養基終濃度組成麥芽汁0. 5 1. 5g/L，酵母粉0. 2 0. 4g/L，蛋白腖0. 4 0. 6g/L，葡萄糖0. 7 1. 2g/L，瓊脂1. 5 2. 5g/L，自然pH值，溶劑為水；(2)種子培養從菌體斜面取一接種環菌體轉接到種子培養基，26 35°C， 150 200r/min，搖床培養18 2 得種子液；所述的種子培養基終濃度組成為葡萄糖 2. 6 3. 2g/L，酵母粉 0. 2 0. 4g/L，硫酸銨 0. 3 0. 6g/L，無水 MgSO4O. 02 0. 04g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 05 0. 15g/L，KH2PO4O. 06 0. 15g/L，自然 pH 值，溶劑為水；(3)發酵培養取種子液，以體積分數10 20%的接種量接種於發酵培養基中， 26 35°C，150 200r/min，搖床培養18 30h得到發酵液；所述發酵液菌體濃度為3 10g/L ；所述的發酵培養基與步驟( 所述的種子培養基相同；(4)細胞固定化將步驟C3)製備的發酵液與等體積2%的海藻酸鈉水溶液相混合，攪拌均勻得到含有菌體的海藻酸鈉混合液，將含有菌體的海藻酸鈉混合液逐滴滴入質量濃度為3. 5%的氯化鈣水溶液中，連續攪拌，含有菌體的海藻酸鈉混合液固化形成凝膠珠固定化細胞顆粒，獲得固定化懸浮液，將固定化懸浮液在37°C條件下固化，獲得固定化細胞顆粒，所述的固定化細胞顆粒用無菌生理鹽水洗滌後分散於發酵培養基中30°C進行增殖培養Mh，過濾，獲得增殖培養後的固定化細胞顆粒，以增殖培養後的固定化細胞顆粒作為生物催化劑；(5)生物轉化以增殖培養後的固定化細胞顆粒作為生物催化劑，以3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈為底物，以鄰苯二甲酸二丁酯為溶劑組成生物轉化體系，於30°C、 180r/min條件下轉化反應72小時，轉化液經分離純化得到(S) -3-羥基-3- (2-噻吩基)-丙腈；在鄰苯二甲酸二丁酯中底物3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙腈的初始濃度為0.01 lmol/L，所述的生物轉化體系中每升鄰苯二甲酸二丁酯含有的菌體乾重相當於以包埋法將 0. 330L菌體濃度為4. 3g/L的發酵液製成固定化細胞顆粒在發酵培養基中20 40°C增殖培養M 72小時後獲得的增殖培養後的固定化細胞顆粒的菌體乾重；所述的轉化過程中，間隔1 IOh取出ImL轉化液作為樣品，將樣品經有機濾膜過濾後採用高效液相色譜進行檢測，流動相為正己烷/異丙醇(90/10)，在紫外254nm處檢測樣品中產物(S)_3_羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈的產量及對映體過剩值(ee%)；所述的轉化液樣品中含有鄰苯二甲酸二丁酯、底物3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈和產物(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)_丙腈；(6)分離純化反應結束後，從生物轉化體系中獲得(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈純品的方法為反應結束後，將轉化液過濾除去固定化細胞顆粒，將濾液旋轉蒸發除去溶劑鄰苯二甲酸二丁酯得到混合物，將混合物採用矽膠柱層析分離，矽膠型號100目，柱床高徑比10 1，先採用體積比為80 20石油醚和丙酮的混合液洗脫至無雜質峰出現棄去洗脫液，再用體積比70 30石油醚和丙酮的混合液洗脫至無目標產物吸收峰出現為止，收集洗脫液，乾燥，即可獲得產物(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈，用體積比60 40的石油醚和丙酮的混合液洗脫矽膠層析柱回收利用。本發明所述發酵液菌體濃度根據發酵液中菌落數計算，當發酵液中菌落數為 2 X IO11個/mL時，發酵液的菌體濃度為4. 3g/L ；所述含酶菌體發酵液菌體乾重的測定是將發酵液離心分離後，棄去上清液，將溼細胞在120°C烘乾48小時至恆重，測定幹細胞的重量；取部分發酵液中離心所得溼細胞測定細胞乾重，計算出發酵液中單位含酶菌體細胞中幹菌體比率，再以這個比率計算定量菌
8體乾重所需含有含酶菌體細胞發酵液用量。釀酒酵母CGMCC No. 2266，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心，位於北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所內，保藏號CGMCC No. 2266，保藏日期2007年11月洸日。菌株來源本發明中所述的微生物菌株釀酒酵母CGMCC No. 2266是從杭州西湖啤酒廠附近的土壤中篩選得到。將土壤中分離得到的菌株用於轉化3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈，得到釀酒酵母CGMCC No. 2266具有良好的轉化3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈生產(S) -3-羥基-3- (2-噻吩基)-丙腈的能力。所述釀酒酵母CGMCC No. 2266的菌落特徵在瓊脂培養基上呈現出乳白色、有光澤、平坦、邊緣整齊、溼潤、表面光滑，質地均勻的菌落形態。本發明採用固定化細胞顆粒作為催化劑，將3-羰基-3- (2-噻吩基)-丙腈還原為 (S) -3-羥基-3- (2-噻吩基)-丙腈的生物轉化機理如下
權利要求
1.一種微生物轉化製備(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈的方法，其特徵在於所述方法是以3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈為底物，以釀酒酵母菌株CGMCCNo. 2266發酵獲得的發酵液再製得的固定化細胞顆粒為生物催化劑，進行轉化反應製得(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)_丙腈。
2.如權利要求1所述的(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈的製備方法，其特徵在於所述的方法為以3-羰基-3- (2-噻吩基)-丙腈為底物，以釀酒酵母菌株CGMCC No. 2266發酵獲得的發酵液再製得的固定化細胞顆粒為生物催化劑，以鄰苯二甲酸二丁酯為溶劑組成生物轉化體系，於20 40°C轉化反應8 72小時，轉化液經分離純化得到產物(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈。
3.如權利要求1所述的(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈的製備方法，其特徵在於所述3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈的初始濃度為0. 01 3mol/L。
4.如權利要求1所述的(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈的製備方法，其特徵在於所述的生物轉化體系中每升鄰苯二甲酸二丁酯含有的菌體乾重相當於以包埋法將0. 330L菌體濃度為3. 0 10. Og/L的發酵液製成固定化細胞顆粒在發酵培養基中20 40°C增殖培養16 72小時後獲得的增殖培養後的固定化細胞顆粒的菌體乾重；所述發酵液中菌體濃度定義為單位體積發酵液中所含有的菌體的乾重。
5.如權利要求1所述的(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈的製備方法，其特徵在於所述的生物催化劑按以下方法製備將經釀酒酵母菌株CGMCC No. 2266發酵培養獲得的發酵液與等體積質量濃度1 5%的海藻酸鈉水溶液混合，攪拌均勻，得到含有菌體的海藻酸鈉混合液，將含有菌體的海藻酸鈉混合液逐滴滴入質量濃度為2. 5 4. 0%的氯化鈣水溶液中，連續攪拌，獲得固定化懸浮液，將懸浮液於35 38°C下固化，獲得固定化細胞顆粒，所述的固定化細胞顆粒用無菌生理鹽水洗滌後分散於發酵培養基中20 40°C增殖培養16 72h，過濾，獲得增殖培養後的固定化細胞顆粒，以增殖培養後的固定化細胞顆粒為生物催化劑，所述的發酵液中菌體濃度為2. 0 25. Og/L。
6.如權利要求5所述的(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈的製備方法，其特徵在於所述的固定化細胞顆粒的直徑為1 5mm。
7.如權利要求5所述的(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈的製備方法，其特徵在於所述的生物催化劑具體按照如下方法獲得將發酵液與等體積2%的海藻酸鈉水溶液相混合，所述的發酵液菌體濃度為4. 3g/L，攪拌均勻得到含有菌體的海藻酸鈉混合液，將含有菌體的海藻酸鈉混合液逐滴滴入質量濃度為3. 5%的氯化鈣水溶液中，連續攪拌，含有菌體的海藻酸鈉混合液固化形成凝膠珠固定化顆粒，將得到的固定化懸浮液在37°C條件下固化， 獲得固定化細胞顆粒，所述的固定化細胞顆粒用無菌生理鹽水洗滌後分散於發酵培養基中 30°C進行增殖培養Mh，過濾，獲得增殖培養後的固定化細胞顆粒，以增殖培養後的固定化細胞顆粒作為生物催化劑。
8.如權利要求1所述的(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈的製備方法，其特徵在於所述的分離純化方法為反應結束後，將轉化液過濾除去固定化細胞顆粒，將濾液旋轉蒸發除去溶劑鄰苯二甲酸二丁酯得到混合物，將混合物採用矽膠柱層析分離，矽膠型號100目，柱床高徑比10 1，先採用體積比為80 20石油醚和丙酮的混合液洗脫至無雜質峰出現棄去洗脫液，再用70 30石油醚和丙酮的混合液洗脫至無目標產物吸收峰出現為止，收集洗脫液，乾燥，即可獲得產物(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈，用體積比60 40的石油醚和丙酮的混合液洗脫矽膠層析柱回收利用。
9.如權利要求1所述的(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈的製備方法，其特徵在於所述的發酵液按照以下步驟製備(1)斜面培養將釀酒酵母CGMCCNo. 2266菌體接種到斜面培養基J6 35°C培養 4 6天，得菌體斜面；所述的斜面培養基終濃度組成麥芽汁0. 5 1. 5g/L，酵母粉0. 2 0. 4g/L，蛋白腖0. 4 0. 6g/L，葡萄糖0. 7 1. 2g/L，瓊脂1. 5 2. 5g/L，自然pH值，溶劑為水；(2)種子培養從菌體斜面取一接種環菌體轉接到種子培養基，26 35°C，150 200r/min，搖床培養18 2 得種子液；所述的種子培養基終濃度組成為葡萄糖 2. 6 3. 2g/L，酵母粉 0. 2 0. 4g/L，硫酸銨 0. 3 0. 6g/L，無水 MgSO4O. 02 0. 04g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 05 0. 15g/L，KH2PO4O. 06 0. 15g/L，自然 pH 值，溶劑為水；(3)發酵培養取種子液，以體積分數10 20%的接種量接種於發酵培養基中，26 35°C，150 200r/min，搖床培養18 30h得發酵液；所述發酵培養基終濃度組成為葡萄糖 2. 6 3. 2g/L，酵母粉 0. 2 0. 4g/L，硫酸銨 0. 3 0. 6g/L，無水 MgSO4O. 02 0. 04g/ L, K2HPO4 · 3H20 0. 05 0. 15g/L, KH2PO4O. 06 0. 15g/L,自然 pH 值，溶劑為水。
10.如權利要求1所述的(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈的製備方法，其特徵在於所述的方法按照以下步驟進行(1)斜面培養將釀酒酵母CGMCCNo. 2266菌體接種到斜面培養基，26 35°C培養 4 6天，得菌體斜面；所述的斜面培養基終濃度組成麥芽汁0. 5 1. 5g/L，酵母粉0. 2 0. 4g/L，蛋白腖0. 4 0. 6g/L，葡萄糖0. 7 1. 2g/L，瓊脂1. 5 2. 5g/L，自然pH值，溶劑為水；(2)種子培養從菌體斜面取一接種環菌體轉接到種子培養基，26 35°C，150 200r/min，搖床培養18 2 得種子液；所述的種子培養基終濃度組成為葡萄糖 2. 6 3. 2g/L，酵母粉 0. 2 0. 4g/L，硫酸銨 0. 3 0. 6g/L，無水 MgSO4O. 02 0. 04g/L, K2HPO4 · 3H20 0. 05 0. 15g/L，KH2PO4O. 06 0. 15g/L，自然 pH 值，溶劑為水；(3)發酵培養取種子液，以體積分數10 20%的接種量接種於發酵培養基中，26 35°C，150 200r/min，搖床培養18 30h得到發酵液；所述發酵液菌體濃度為3 IOg/ L ；所述的發酵培養基組成與步驟( 所述的種子培養基組成相同；(4)細胞固定化將步驟C3)所製備的發酵液與等體積2%的海藻酸鈉水溶液相混合， 攪拌均勻得到含有菌體的海藻酸鈉的混合液，將含有菌體的海藻酸鈉的混合液逐滴滴入質量濃度為3. 5%的氯化鈣水溶液中，連續攪拌，含有菌體的海藻酸鈉混合液固化形成凝膠珠固定化細胞顆粒，將得到的固定化懸浮液在37°C條件下固化，獲得固定化細胞顆粒，所述固定化細胞顆粒用無菌生理鹽水洗滌後分散於發酵培養基中30°C進行增殖培養Mh，過濾， 獲得增殖培養後的固定化細胞顆粒，以增殖培養後的固定化細胞顆粒作為生物催化劑；(5)生物轉化以增殖培養後的固定化細胞顆粒作為生物催化劑，以3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈為底物，以鄰苯二甲酸二丁酯為溶劑組成生物轉化體系，於3(TC、180r/min條件下轉化反應72小時，轉化液經分離純化得到(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈；所述的 3-羰基-3-(2-噻吩基)_丙腈的初始濃度為0. 01 0. lmol/L，所述生物轉化體系中每升鄰苯二甲酸二丁酯含有的菌體乾重相當於以包埋法將0. 330L菌體濃度為4. 3g/L的發酵液製成固定化細胞顆粒在發酵培養基中20 40°C增殖培養M 72小時後獲得的增殖培養後的固定化細胞顆粒的菌體乾重；(6)分離純化反應結束後，將轉化液過濾除去固定化細胞顆粒，將濾液旋轉蒸發除去溶劑鄰苯二甲酸二丁酯得到混合物，將混合物採用矽膠柱層析分離，矽膠型號100目，柱床高徑比10 1，先採用體積比為80 20石油醚和丙酮的混合液洗脫至無雜質峰出現棄去洗脫液，再用70 30石油醚和丙酮的混合液洗脫至無目標產物吸收峰出現為止，收集洗脫液，乾燥，即可獲得產物(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈，用體積比60 40的石油醚和丙酮的混合液洗脫矽膠層析柱回收利用。
全文摘要
本發明公開了一種微生物轉化製備(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈的方法，所述方法為以3-羰基-3-(2-噻吩基)-丙腈為底物，以釀酒酵母菌株CGMCC No.2266發酵獲得的含酶菌體細胞再製備的固定化細胞顆粒為生物催化劑，以鄰苯二甲酸二丁酯為溶劑組成生物轉化體系，於20～40℃轉化反應8～72小時，轉化液經分離純化得到產物(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈；本發明採用微生物轉化法製備(S)-3-羥基-3-(2-噻吩基)-丙腈，反應條件溫和、環境友好；微生物易於大規模培養，成本低廉；生產菌株安全無毒；產物易提取；易於實現大規模工業化生產；底物的轉化量和生產效率較高。
文檔編號C12R1/865GK102199637SQ20111006616
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月18日 優先權日2011年3月18日
發明者劉擁, 南穎康, 李仁瑋, 歐志敏, 沈文和 申請人:浙江工業大學