一種提高肽段離子化效率的方法
2023-09-15 04:43:25 4
專利名稱：一種提高肽段離子化效率的方法
技術領域：
本發明屬生化分析領域，涉及一種提高肽段離子化效率的方法。具體涉及利 用鹼性和疏水性有機化合物對多肽和蛋白樣品的羧基進行衍生，使得其質譜離子 化效率得到提高，並對所衍生的樣品直接進行質譜分析和鑑定。
背景技術：
伴隨著人類基因組計劃(HGP)的實施和推進，生命科學研究已進入了後基因 組時代。現階段，生命科學的主要研究對象是功能基因組學，包括結構基因組研 究和蛋白質組研究等。闡明基因組所表達的真正執行生命活動的全部蛋白質的表 達規律和生物功能，與在基因組整體水平上闡明基因活動的規律相比，任務更為 複雜，也更加艱巨。
本領域公知，蛋白質組學研究包括樣品或組織中的蛋白質分離和鑑定兩個關 鍵步驟。隨著新的軟電離方式——基質輔助雷射解析電離(MALDI)和電噴霧電離 (ESI)的產生，生物質譜已經成為蛋白質組學技術平臺中最為重要的技術手段之 一。蛋白質組是一個在時間和空間動態變化著的整體，樣品體系極其複雜，蛋白 動態分布範圍非常廣。與疾病和信號傳導相關的蛋白質往往屬於低豐度的蛋白質， 這些重要的蛋白質由於本身存在的量極少而很難得以有效鑑定，而樣品中廣泛存 在的翻譯後修飾特別是磷酸化修飾由於其本身離子化效率低和容易受到非磷酸化 肽段的壓制等原因，使得對於磷酸化肽段和蛋白質的直接鑑定存在著很大的困難。
隨著蛋白質組研究的進一步拓展和深入，尤其是對磷酸化修飾等難電離肽段 和低豐度蛋白質的分析鑑定對質譜離子化技術提出越來越高的要求。現有的針對 難電離磷酸化肽段的方法主要是對於磷酸化肽段進行特異性富集，比如採用IMAC， Ti02等富集材料選擇並濃縮磷酸化肽段，從而達到去除非磷酸化肽段的壓制以及 提高濃度的目的。然而，這些方法的特異性並不夠高，步驟繁瑣，耗時也長，大 大增加了樣品損失、汙染的可能性，並不適用於高通量的蛋白質鑑定。而對於低 豐度蛋白質，富集仍然是最主要的方法，而這種方法需要大量的樣品做支持，且 高豐度蛋白質的壓制也很難去除，導致對其的質譜檢測目前仍然沒有很好的改善。
發明內容
本發明的目的在於提供一種從根本上提高肽段質譜離子化效率的方法。具體 涉及一種通過肽段羧基衍生提高肽段離子化效率的方法。本方法操作簡單、靈敏 度高、重現性好、經濟、省時、適應於高通量蛋白質組學研究要求，能對磷酸化 肽段或低豐度蛋白質直接進行質譜分析。
為實現上述目的，本發明採用如下的技術方案 1、利用鹼性和疏水性有機化合物，對多肽或蛋白質樣品(簡稱肽段)的羧基進 行衍生，實現提高多肽質譜離子化效率，其特徵是通過下述方法和步驟
1) 將鹼性和疏水性有機化合物、肽鍵縮合試劑和催化劑分別溶解於有機溶劑 中，所述三種試劑按順序依次加入所述的肽段水溶液中形成反應體系，用 酸調節pH值7.5 7.8，將上述反應體系置室溫下混懸；
2) 去除上述反應體系中的所述的溶劑，終止衍生反應，得衍生產物；
3) 將上述衍生產物溶解，直接用於MALDI-MS或ESI-MS檢測。 本發明所述的多肽和蛋白質樣品的羧基包括碳末端羧基和酸性胺基酸側鏈羧基。
本發明所述的鹼性和疏水性有機化合物是含嘧啶基的化合物，選自2-肼基嘧 啶，1-(2-嘧啶基)哌嗪，4-氨基-2- (1-哌嗪基)嘧啶或4-氨基-6-氯嘧啶。
本發明所述的肽鍵縮合試劑選自N，N-二環己基碳二亞胺、N,N-二異丙基碳、 二亞胺1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽或碳醯二咪唑。
本發明所述的催化劑選自1-羥基苯並三唑、6-氯-1-羥基苯並三唑或l-羥基 -7-氮雜苯並三唑。
本發明所述的酸採用三氟乙酸、鹽酸、甲酸或乙酸等酸。
本發明通過去除反應體系中的溶劑達到終止反應的目的，採用室溫自然乾燥、 烘乾、真空乾燥或氮氣吹乾等手段去除反應溶劑。
本發明直接將衍生產物用含5%乙腈0. 1%甲酸的水溶液溶解用於電噴霧離子源 質譜檢測，或將衍生產物用含50%乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶液溶解用於基質輔助激 光解吸離子源質譜檢測。
本發明方法通過鹼性和疏水性有機化合物改變肽段中帶負電、親水性的羧基 從而有效改變了肽段的性質，使其電離效率得到提高，大大提高了其質譜檢測靈
敏度。例如對於磷酸化肽段(TPpTAPSLG)，經過衍生後離子化效率提高了101倍。 本發明選用的含有嘧啶基的一類化合物作為衍生羧基的有機化合物，由於嘧 啶基氣相鹼性度高、疏水性強、在紫外端有吸收，所以一旦應用於MALDI離子化， 它可以有效促進肽段與基質的相互作用，輔助吸收雷射；而對於ESI離子化，高的 氣相鹼性度也可以有效改善肽段的電離效率。因此，採用含嘧啶基的化合物作為 衍生羧基的有機化合物可以有效的實現提高肽段的離子化效率的作用。
圖1為肽段KRGSGAW經過衍生後的MALDI-TOF-MS譜圖， 其中，顯示出反應效率近100%。
圖2為肽段RPPGFSP和TPpTAPSLG的MALDI-TOF-MS譜圖， 其中，肽段RPPGFSP的離子化效率提高了 12.1倍，肽段TPpTAPSLG的離子化 效率提高了 101倍。
圖3為七條標準肽段的離子化效率提高的倍數，
其中，顯示了非磷酸化肽段的離子化效率提高了 10到50倍，磷酸化肽段的離 子化效率提高了50至U01倍。
圖4為標準磷酸肽與胰蛋白酶酶解的牛血清白蛋白混合後的MALDI-TOF-MS譜 圖，其中(a)是未經過衍生的譜圖，(b)是經過衍生的譜圖；星號表示在衍生前 未被鑑定出的牛血清白蛋白的肽段；編號表示前後都被鑑定出的牛血清白蛋白的 肽段；顯示出，經過衍生，所有肽段的信號強度都得到提升，而其中磷酸化肽段 提高的幅度最大，衍生前難以檢測到，衍生後成為強度最強的一條肽段。
圖5是ESI-MS檢測中肽段經過衍生後離子化效率大幅度提高結果圖，
其中，5a是肽段TPpTALSLG ， 5b是肽段YMQSpTPLl ， 5c是肽段QYGSGAW。
具體實施例方式
下面的實例是對本發明提出的利用鹼性和疏水性有機化合物對多肽和蛋白樣 品的羧基進行衍生，使得其質譜離子化效率得到提高，並對所衍生的樣品直接進 行質譜分析和鑑定的進一步說明。
實施例1驗證衍生反應的反應效率接近100%
將1-(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N，N-二甲基甲醯胺中，將1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和卜羥基-7-偶氮苯並三氮唑分別溶解於N，N-二甲基甲
醯胺中，配製成2毫克每毫升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50 微升濃度約為100納克每微升的肽段KRGSGAW水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶 液調節pH值至7.5和7.8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真空 離心乾燥，去除所有溶劑。將上述乾燥後產物用含50%乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶 液溶解用於MALDI-MS檢測，結果顯示，衍生反應效率約為100% (圖1)。
實施例2驗證衍生反應的反應效率接近100%
將1-(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N，N-二甲基甲醯胺中，將l- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和1-羥基-7-偶氮苯並三氮唑分別溶解於N，N-二甲基甲 醯胺中，配製成2毫克每毫升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50 微升濃度約為100納克每微升的肽段DRVYIHPF水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶 液調節pH值至7.5和7.8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真空 離心乾燥，去除所有溶劑。將上述乾燥後產物用含50%乙腈0.1%三氟乙酸的水溶 液溶解用於MALDI-MS檢測，得出兩位點衍生反應效率接近100%。
實施例3肽段RPPGFSP經過衍生後離子化效率提高的倍數 將1-(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N,N-二甲基甲醯胺中，將1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和1-輕基-7-偶氮苯並三氮唑分別溶解於N，N-二甲基甲 醯胺中，配製成2毫克每毫升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50 微升濃度約為100納克每微升的肽段RPPGFSP水溶液中，用0.1%的三氟乙酸水溶 液調節pH值至7.5和7.8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真空 離心乾燥，去除所有溶劑。將每一種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍生 肽段，將上述產物用含50%乙腈0.1%三氟乙酸的水溶液溶解用於MALDI-MS檢測， 結果顯示，肽段的離子化效率提高12. 1倍(圖2a)。
實施例4肽段TPpTAPSLG經過衍生後離子化效率提高的倍數 將l-(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N，N-二甲基甲醯胺中，將1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和1-羥基-7-偶氮苯並三氮唑分別溶解於N,N-二甲基甲 醯胺中，配製成2毫克每毫升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50
微升濃度約為100納克每微升的肽段TPpTAPSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水 溶液調節pH值至7.5和7.8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真 空離心乾燥，去除所有溶劑。將每一種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍 生肽段,將上述產物用含50%乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶液溶解用於MALDI-MS檢測， 結果顯示，肽段的離子化效率提高101倍(圖2b)。
實施例5肽段KRGSGAW經過衍生後離子化效率提高的倍數 將1-(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N,N-二甲基甲醯胺中，將1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和1-羥基-7-偶氮苯並三氮唑分別溶解於N,N-二甲基甲 醯胺中，配製成2毫克每毫升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50 微升濃度約為100納克每微升的肽段KRGSGAW水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶 液調節pH值至7. 5和7. 8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真空 離心乾燥，去除所有溶劑。將每一種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍生 肽段，將上述產物用含50%乙腈0.1%三氟乙酸的水溶液溶解用於MALDI-MS檢測， 結果顯示，肽段的離子化效率提高40倍(圖3)。
實施例6肽段NRGSGAW經過衍生後離子化效率提高的倍數 將1-(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N，N-二甲基甲醯胺中，將l- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和1-輕基-7-偶氮苯並三氮唑分別溶解於N,N-二甲基甲 醯胺中，配製成2毫克每毫升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50 微升濃度約為100納克每微升的肽段NRGSGAW水溶液中，用0.1%的三氟乙酸水溶 液調節pH值至7.5和7.8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真空 離心乾燥，去除所有溶劑。將每一種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍生 肽段，將上述產物用含50%乙腈0.1%三氟乙酸的水溶液溶解用於MALDI-MS檢測， 結果顯示，此肽段的離子化效率提高15倍(圖3)。
實施例7肽段DPpTALSLG經過衍生後離子化效率提高的倍數 將1-(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N,N-二甲基甲醯胺中，將1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和1-羥基-7-偶氮苯並三氮唑分別溶解於N,N-二甲基甲
醯胺中，配製成2毫克每毫升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50 微升濃度約為100納克每微升的肽段DPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水 溶液調節pH值至7. 5和7. 8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真 空離心乾燥，去除所有溶劑。將每一種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍 生肽段,將上述產物用含50%乙腈0. W三氟乙酸的水溶液溶解用於MALDI-MS檢測， 結果顯示，此肽段的離子化效率提高99倍(圖3)。
實施例8肽段TPpTAPpSLG經過衍生後離子化效率提高的倍數 將1-(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N，N-二甲基甲醯胺中，將1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和1-羥基_7-偶氮苯並三氮唑分別溶解於N,N-二甲基甲 醯胺中，配製成2毫克每毫升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50 微升濃度約為100納克每微升的肽段DPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水 溶液調節pH值至7. 5和7. 8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真 空離心千燥，去除所有溶劑。將每一種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍 生肽段，將上述產物用含50%乙腈0.1M三氟乙酸的水溶液溶解用於MALDI-MS檢測， 結果顯示，此肽段的離子化效率提高47倍(圖3)。
實施例9肽段TPpTAPSLG採用N， N-二環己基碳二亞胺作為肽鍵縮合試劑衍生 後離子化效率提高的倍數
將l-(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N，N-二甲基甲醯胺中，將N,N-二環己基碳二亞胺 和1-羥基-7-偶氮苯並三氮唑分別溶解於N，N-二甲基甲醯胺中，配製成2毫克每 毫升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50微升濃度約為100納克 每微升的肽段DPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶液調節pH值至7. 5 和7.8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真空離心乾燥，去除所有 溶劑。將每一種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍生肽段，將上述產物用 含50%乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶液溶解用於MALDI-MS檢測，此肽段的離子化效率 提高94倍,說明N， N-二環己基碳二亞胺作為肽鍵縮合試劑可以達到同樣效果。
實施例10肽段TPpTAPSLG採用N， N-二異丙基碳作為肽鍵縮合試劑衍生後離
子化效率提高的倍數
將l- (2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N, N-二甲基甲醯胺中，將N, N-二異丙基碳和1-羥 基-7-偶氮苯並三氮唑分別溶解於N， N-二甲基甲醯胺中，配製成2毫克每毫升的溶 液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50微升濃度約為100納克每微升的 肽段DPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶液調節pH值至7. 5和7. 8之間。 將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真空離心乾燥，去除所有溶劑。將每一 種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍生肽段，將上述產物用含50%乙腈0. 1% 三氟乙酸的水溶液溶解用於MALDI-MS檢測，此肽段的離子化效率提高90倍，說明 N， N-二異丙基碳作為肽鍵縮合試劑可以達到同樣效果。
實施例11肽段TPpTAPSLG採用碳醯二咪唑作為肽鍵縮合試劑衍生後離子化 效率提高的倍數
將l-(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N,N-二甲基甲醯胺中，將碳醯二咪唑和1-羥基 -7-偶氮苯並三氮唑分別溶解於N，N-二甲基甲醯胺中，配製成2亳克每毫升的溶 液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50微升濃度約為100納克每微升的 肽段DPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶液調節pH值至7. 5和7.8之間。 將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真空離心乾燥，去除所有溶劑。將每一 種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍生肽段，將上述產物用含50%乙腈0.1% 三氟乙酸的水溶液溶解用於MALDI-MS檢測，此肽段的離子化效率提高85倍,說明 碳醯二咪唑作為肽鍵縮合試劑可以達到同樣效果。
實施例12肽段TPpTAPSLG採用6-氯-1-羥基苯並三唑作為催化劑衍生後離子 化效率提高的倍數
將卜(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N,N-二甲基甲醯胺中，將N，N-二環己基碳二亞胺 和6-氯-l-羥基苯並三唑分別溶解於N， N-二甲基甲醯胺中，配製成2毫克每毫升 的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50微升濃度約為100納克每微 升的肽段DPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶液調節pH值至7. 5和7. 8 之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真空離心乾燥，去除所有溶劑。 將每一種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍生肽段，將上述產物用含50%
乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶液溶解用於MALDI-MS檢領lj，此肽段的離子化效率提高 87倍，說明用6-氯-1-羥基苯並三唑作為催化劑可以達到同樣的效果。
實施例13肽段TPpTAPSLG採用1-羥基-7-氮雜苯並三唑作為催化劑衍生後離 子化效率提高的倍數
將1-(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N,N-二甲基甲醯胺中，將N,N-二環己基碳二亞胺 和l-羥基-7-氮雜苯並三唑分別溶解於N，N-二甲基甲醯胺中，配製成2毫克每毫 升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50微升濃度約為100納克每 微升的肽段DPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶液調節pH值至7. 5和 7.8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真空離心乾燥，去除所有溶 劑。將每一種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍生肽段，將上述產物用含 50%乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶液溶解用於MALDI-MS檢測，此肽段的離子化效率提 高93倍，說明用1-羥基-7-氮雜苯並三唑作為催化劑可以達到同樣的效果。
實施例14肽段TPpTAPSLG採用2-肼基嘧啶作為衍生試劑衍生後離子化效率 提高的倍數
將2-肼基嘧啶釋於N，N-二甲基甲醯胺中，將卜(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳 二亞胺鹽酸鹽和1-羥基-7-氮雜苯並三唑分別溶解於N，N-二甲基甲醯胺中，配製 成2毫克每毫升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50微升濃度約 為100納克每微升的肽段DPpTALSLG水溶液中，用0.1%的三氟乙酸水溶液調節pH 值至7.5和7.8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真空離心乾燥， 去除所有溶劑。將每一種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍生肽段，將上 述產物用含50%乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶液溶解用於MALDI-MS檢測，此肽段的離 子化效率提高96倍，說明2-肼基嘧啶可以作為衍生試劑。
實施例15肽段TPpTAPSLG採用4-氮基-2- (1-哌嗪基)嘧啶作為衍生試劑衍 生後離子化效率提高的倍數
將4-氨基-2- (l-哌嗪基)嘧啶稀釋於N，N-二甲基甲醯胺中，將1- (3-二甲氨 基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和1-羥基-7-氮雜苯並三唑分別溶解於N, N-二甲
基甲醯胺中，配製成2毫克每毫升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升 於50微升濃度約為100納克每微升的肽段DPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙 酸水溶液調節pH值至7. 5和7. 8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然 後真空離心乾燥，去除所有溶劑。將每一種的肽段衍生產物中加入等物質的量的 未衍生肽段，將上述產物用含50%乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶液溶解用於MALDI-MS 檢測，此肽段的離子化效率提高90倍，說明4-氨基-2- (l-哌嗪基)嘧啶可以作 為衍生試劑。
實施例16肽段TPpTAPSLG採用甲酸調節pH經過衍生後離子化效率提高的倍
數
將1-(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N,N-二甲基甲醯胺中，將l- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和1-羥基-7-偶氮苯並三氮唑分別溶解於N，N-二甲基甲 醯胺中，配製成2毫克每毫升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50 微升濃度約為100納克每微升的肽段TPpTAPSLG水溶液中，用0. 1%的甲酸水溶液 調節pH值至7.5和7.8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真空離 心乾燥，去除所有溶劑。將每一種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍生肽 段，將上述產物用含50%乙腈0. P/。三氟乙酸的水溶液溶解用於MALDI-MS檢測，肽 段的離子化效率提高101倍，說明甲酸可用於調節pH。
實施例17肽段TPpTAPSLG經過衍生後，採用氮氣吹乾，離子化效率提高的倍
似,
數
將1-(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N，N-二甲基甲醯胺中，將l- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和1-羥基-7-偶氮苯並三氮唑分別溶解於N，N-二甲基甲 醯胺中，配製成2毫克每毫升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50 微升濃度約為100納克每微升的肽段TPpTAPSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水 溶液調節pH值至7.5和7.8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後氮 氣吹乾，去除所有溶劑。將每一種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍生肽 段，將上述產物用含50。/。乙腈0.iy。三氟乙酸的水溶液溶解用於MALDI-MS檢測，肽 段的離子化效率提高101倍，說明氮氣吹乾可用於終止反應。
實施例18驗證混合體系下，衍生對酶解蛋白和磷酸化肽段的影響 調整樣品溶液為15nmol牛血清白蛋白酶解肽段與2pmo1的標準磷酸化肽段混 合溶液(溶劑為50%乙腈、50%水、0. 1%三氟乙酸)，重複實例2中的衍生反應與質 譜實驗，結果顯示，在衍生反應前磷酸肽基本無法檢測到，衍生反應後磷酸肽信 號強度最強(圖4)。
實施例19驗證在電噴霧電離源中肽段TPpTALSLG經過衍生後離子化效率大幅 度提高。
將1-(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N，N-二甲基甲醯胺中，將1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和1-羥基-7-偶氮苯並三氮唑分別溶解於N，N-二甲基甲 醯胺中，配製成2毫克每毫升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50 微升濃度約為100納克每微升的肽段TPpTALSLG水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水 溶液調節pH值至7. 5和7. 8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真 空離心乾燥，去除所有溶劑。將每一種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍 生肽段，將上述產物用含5%乙腈0. P/。甲酸的水溶液溶解用於ESI-MS檢測，結果 顯示，此肽段的離子化效率大幅度提高(圖5a)。
實施例20驗證在電噴霧電離源中肽段YMQSpTPL經過衍生後離子化效率大幅 度提高。
將1-(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N，N-二甲基甲醯胺中，將l- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和1-羥基-7-偶氮苯並三氮唑分別溶解於N，N-二甲基甲 醯胺中，配製成2毫克每毫升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50 微升濃度約為100納克每微升的肽段YMQSpTPL水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶 液調節pH值至7. 5和7. 8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真空 離心乾燥，去除所有溶劑。將每一種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍生 肽段，將上述產物用含5。/。乙腈0.P/。甲酸的水溶液溶解用於ESI-MS檢測，結果顯 示此肽段的離子化效率大幅度提高(圖5b)。
實施例21驗證在電噴霧電離源中肽段QYGSGAW經過衍生後離子化效率大幅度
提高。
將1-(2-嘧啶基)哌嗪稀釋於N，N-二甲基甲醯胺中，將l- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和卜羥基-7-偶氮苯並三氮唑分別溶解於N，N-二甲基甲 醯胺中，配製成2毫克每毫升的溶液。將以上三種試劑依次加6、 4和3微升於50 微升濃度約為100納克每微升的肽段QYGSGAW水溶液中，用0. 1%的三氟乙酸水溶 液調節pH值至7. 5和7. 8之間。將上述混合體系在室溫下混懸30秒。然後真空 離心乾燥，去除所有溶劑。將每一種的肽段衍生產物中加入等物質的量的未衍生 肽段，將上述產物用含5%乙腈0. 1%甲酸的水溶液溶解用於ESI-MS檢測，結果顯 示，此肽段的離子化效率大幅度提高(圖5c)。
權利要求
1、一種提高肽段離子化效率的方法，其特徵是通過下述方法和步驟 1)利用鹼性和疏水性有機化合物，對多肽或蛋白質的羧基進行衍生，採用鹼性和疏水性有機化合物、肽鍵縮合試劑和催化劑分別溶解於有機溶 劑中，上述三種試劑按順序依次加入多肽或蛋白質水溶液中形成反應體系，用 酸調節pH值至7.5～7.8，室溫下混懸； 2)去除上述反應體系中的溶劑，終止衍生反應，得產物 3)將上述產物溶解，直接用於MALDI-MS或ESI-MS檢測。
2、 按權利要求1所述的提高肽段離子化效率的方法，其特徵是所述的多肽或蛋白 質的羧基包括碳末端羧基和酸性胺基酸側鏈羧基。
3、 按權利要求1所述的提高肽段離子化效率的方法，其特徵是所述的鹼性和疏水 性有機化合物是含嘧啶基的化合物，選自2-肼基嘧啶，1-(2-嘧啶基)哌嗪，4-氨基-2- (1-哌嗪基)嘧啶或4-氨基-6-氯嘧啶。
4、 按權利要求3所述的提高肽段離子化效率的方法，其特徵是所述的含嘧啶基的 化合物是1-(2-嘧啶基)哌嗪。
5、 按權利要求1所述的提高肽段離子化效率的方法，其特徵是所述的肽鍵縮合試 劑選自N，N-二環己基碳二亞胺、N,N-二異丙基碳、二亞胺1- (3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽或和碳醯二咪唑。
6、 按權利要求1所述的提高肽段離子化效率的方法，其特徵是所述的催化劑選自 l-羥基苯並三唑、6-氯-1-羥基苯並三唑或1-羥基-7-氮雜苯並三唑。
7、 按權利要求1所述的提高肽段離子化效率的方法，其特徵是所述的酸選自三氟 乙酸、鹽酸、甲酸或乙酸。
8、 按權利要求1所述的提高肽段離子化效率的方法，其特徵是所述的步驟2)的 去除反應體系中的溶劑的方式是室溫自然乾燥、烘乾、真空乾燥或氮氣吹乾方 式。
9、 按權利要求1所述的提高肽段離子化效率的方法，其特徵是所述的步驟3)中 直接將產物用含5%乙腈0.1%甲酸的水溶液溶解用於電噴霧離子源質譜檢測， 或直接將產物用含50%乙腈0. 1%三氟乙酸的水溶液溶解用於基質輔助雷射解吸 離子源質譜檢測。
全文摘要
本發明屬生化分析領域，涉及一種提高肽段離子化效率的方法。本發明利用鹼性和疏水性有機化合物對蛋白質或肽段羧基衍生，提高肽段離子化效率，並對所衍生的樣品直接進行質譜分析和鑑定。本發明選用的有機化合物能高效率、高特異性地與肽段的羧基形成共價鍵，從而有效地提高肽段與質子的結合能力和肽段的疏水性，極大地提高肽段的離子化效率，促使低豐度、難電離的肽段得到檢測。本發明具有反應特異性高、副反應少、步驟簡單、經濟和省時等特點，可廣泛用於蛋白質組學領域，大大提高了質譜對低豐度及難電離肽段的檢測能力。
文檔編號G01N27/64GK101363779SQ200810039698
公開日2009年2月11日 申請日期2008年6月26日 優先權日2008年6月26日
發明者張莉娟, 楊芃原, 許亞偉, 陸豪傑 申請人:復旦大學