一種豬體細胞誘變方法
2023-09-14 22:08:45 1
專利名稱：一種豬體細胞誘變方法
一種豬體細胞誘變方法本發明涉及細胞誘變技術領域，尤其涉及一種豬體細胞的誘變方法。 [背景技術]慢病毒載體作為一類重組逆轉錄病毒載體在轉基因生產中具有方便、快捷、高效和穩定轉染等優點，目前已成為一種重要的基因轉移工具被廣泛應用於基因導入細胞分子生物學研究領域。慢病毒是逆轉錄病毒家族的成員，病毒能夠利用自身組分將外源基因整合入宿主細胞基因組中，從而使外源基因隨著宿主細胞的分裂增殖和傳代而穩定表達。2006年人類第一次利用逆轉錄病毒介導小鼠皮膚成纖維細胞表達0ct4、SoX2、Klf4和 c-Myc，表達這些外源基因的小鼠成纖維細胞呈現小鼠胚胎幹細胞(Embryonic stem cell, ES)的形態和特徵。來源於外源限定基因誘導的多能性幹細胞具有同ES細胞相似或相同的特性，擁有二倍體生殖系嵌合遺傳和四倍體互補產生後代的能力，這種細胞常被稱為誘導多能性幹細胞anduced pluripotent stem cell, iPS細胞)。來自人體的成纖維細胞通過逆轉錄病毒載體介導表達0ct4、Nanog、Sox2和Lin 28或0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種基因，表達外源基因的人成纖維細胞呈現出人ES細胞的特徵。在家畜方面，Esteban等 2009年分別通過使用逆轉錄病毒或慢病毒載體介導限定因子誘導出豬的iPS細胞。由於豬在解剖學和生理學等方面同人類極為相似，因此，豬是研究人類器官移植和細胞轉基因治療等安全性和應用效率的理想動物模型和試驗材料。在我們的相關試驗中發現，慢病毒感染豬成纖維細胞後能夠引起細胞在形態和生長性能等方面呈現特徵性變化，並呈現出一些幹細胞所具有的特徵，這些現象的發現將會為探討細胞的生長、發育和重構等方面提供理想的材料和手段。然而，到目前關於利用慢病毒誘導豬體細胞為幹細胞的誘導技術國內外尚未有文獻報導。本發明要解決的技術問題是提供一種利用慢病毒對豬體細胞進行誘變的方法。為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是提供一種豬體細胞誘變方法， 步驟如下1)取妊娠約60天左右的豬胎兒，採用組織塊培養法添加胎豬成纖維細胞培養液建立胎豬成纖維細胞系；2)磷酸鈣介導pLentiLox 3. 7慢病毒表達載體及其包裝組分pMDLg、pRSVREV和 PVSVg在細胞中組建成慢病毒顆粒，12-16小時後更換新鮮細胞培養液，病毒包裝48小時後收集含慢病毒的細胞培養液，經超濾濃縮後添加到胎豬成纖維細胞培養板內；3)在胎豬成纖維細胞培養板內添加含終濃度為10 μ g/ml Polybrene的胎豬成纖維細胞培養液，此後，每天收集含慢病毒的細胞培養液，添加到胎豬成纖維細胞培養板中感染胎豬成纖維細胞2-4次；
4)將胎豬成纖維細胞培養板內的培養液更換為含胎牛血清的高糖DMEM培養液的豬誘變細胞培養液，再連續收集含慢病毒的細胞培養液2-4天，並讓所收集的慢病毒感染胎豬成纖維細胞2-4次；5)當胎豬成纖維細胞中的細胞形態出現集落變化後，將細胞集落經Dispase II 消化後接種到經絲裂黴素處理的12. 5天小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上，在飽和溼度培養箱中培養；經4次感染後1周在小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上形成鳥巢狀豬幹細胞集落。上述步驟1)所述的豬胎兒為杜洛克-長白-大約克三元雜交豬胎兒。上述步驟幻所述的胎豬成纖維細胞培養液為含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養液。上述步驟4)所述的豬誘變細胞培養液由高糖DMEM、2mM穀氨醯胺、2mM丙酮酸鈉、 非必須胺基酸、0. ImM β-巰基乙醇、1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF、15% FBS 和 1 %青鏈
黴素組成。本發明的有益效果是1)利用慢病毒對豬體細胞進行誘導，操作簡單方便，誘導周期短，對慢病毒感染的胎豬成纖維細胞進行培養傳代，能夠分離培養出類似胚胎幹細胞的鳥巢狀細胞克隆，細胞集落生長狀態穩定，常規的凍存復甦不影響細胞的生長和形態，並且誘變的細胞核型正常， 高效強表達鹼性磷酸酶及0ct4、NanOg、SSEA-I幹細胞特有的蛋白，在免疫缺陷鼠體內能夠分化形成含有三個胚層的畸胎瘤，結果證實慢病毒能夠誘導胎豬成纖維細胞形成多能性幹細胞；首次成功利用慢病毒誘導產生豬多能性幹細胞；2)採用慢病毒對豬體細胞的誘導和維持幹細胞特徵的培養液兩者的有效結合建立了穩定的誘導幹細胞，對未來從豬自然胚胎中分離培養建立真正的胚胎幹細胞系具有重要的參考價值。轉基因動物的研究和生產是生命科學研究的熱點領域。轉基因動物生產在生物製藥、建立診斷和治療人類疾病的動物模型、生產用於人體器官移植的動物器官、動物抗病育種和改良動物生產性能等方面具有著重要的應用前景和發展潛力。目前轉基因動物的生產存在著目的基因表達率低、表達不穩定，轉基因動物生產效率低等諸多問題。ES細胞是一種來源於囊胚內細胞團的多能性幹細胞群體，具有較強的再生能力和可塑性，在體外培養環境條件下，能夠高效地進行外源基因導入、基因敲除和基因改造等遺傳修飾操作。ES細胞同二倍體胚胎嵌合、四倍體胚胎互補及核移植技術等相結合可以有效地解決動物轉基因效率低和基因表達不穩定等方面的問題。最近研究發現，來源於外源限定基因誘導的多能性幹細胞具有同ES細胞相似或相同的特性，具有二倍體生殖系嵌合遺傳和四倍體互補產生後代的能力，這種細胞被稱作為iPS細胞。iPS細胞的誕生解決了傳統生產家畜ES需要破壞大量優質胚胎的問題。本發明顯示未攜帶外源限定因子0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc的慢病毒也能夠誘導形成幹細胞，此項慢病毒誘變方法具有操作簡單方便，誘導周期短，並且誘導形成的多能性幹細胞性能穩定。目前這種慢病毒誘導方法在國內外尚未見有文獻報導，因此本發明對於促進誘導多能性幹細胞相關的研究和應用具有深遠意義。1材料和試劑
胎豬成纖維細胞的分離和培養採用組織塊培養法建立胎豬成纖維細胞系，胎豬成纖維細胞培養液為含有10%胎牛血清(Hyclone)的高糖DMEM(Hyclone)。胎鼠成纖維細胞(Mouse embryo fibroblasts, MEFs)系的建立取妊娠12. 5天 ICR品系胎鼠，去除頭、四肢和內臟後採用胰酶消化法分離培養小鼠胚胎成纖維細胞。胎鼠成纖維細胞培養液為含有10%新生牛血清(四季青)的高糖DMEM(Hyclone)。小鼠胎兒成纖維細胞飼養層的製備選擇鋪滿皿底的2-4代的小鼠胚胎成纖維細胞，經10μ g/ml的絲裂黴素C(Sigma)處理2. 5小時，常規胰酶消化接種到鋪過0. 明膠的培養皿內，接種細胞密度為2X IO5個/ml。所用培養液同胎鼠成纖維細胞培養液。豬誘變細胞培養液高糖DMEM(Hyclone)+2mM穀氨醯胺(Gibco)+2mM丙酮酸鈉 (Gibco)+1%非必須胺基酸(Gibco)+0. ImM β-巰基乙醇(Sigma)+1000U/ml LIF(ESGR0, Chemicon International)+4ng/ml bFGF (Sigma)+15 % FBS(Hyclone)+1 % 青鏈黴素 (Gibco)0293T細胞培養液同胎豬成纖維細胞培養液。所有細胞均在37. 5°C,5% CO2，飽和溼度下(X)2培養箱中培養。2豬體細胞誘變方法1)從妊娠約60天左右杜洛克-長白-大約克三元雜交豬胎兒皮膚通過組織塊培養法添加含10%胎牛血清(Hyclone)的高糖DMEM(Hyclone)的胎豬成纖維細胞培養液分離培養建立胎豬成纖維細胞系；2)磷酸鈣介導pLentiLox 3. 7慢病毒表達載體及其包裝組分pMDLg、pRSVREV和 PVSVg在細胞中組建成慢病毒顆粒，12-16小時後更換新鮮細胞培養液，病毒包裝48小時後收集病毒液，經超濾濃縮後添加到胎豬成纖維細胞培養板內，細胞密度為 1. OXlOVcm2 ；3)在胎豬成纖維細胞培養板內添加含終濃度為10 μ g/ml Polybrene(Sigma)的胎豬成纖維細胞培養液，此後，每天收集含慢病毒的細胞培養液，添加到胎豬成纖維細胞培養板中感染胎豬成纖維細胞2次；4)將胎豬成纖維細胞培養板內的培養液更換為含15%胎牛血清(Hyclone)的高糖DMEM(Hyclone)培養液的豬誘變細胞培養液，同時再連續收集含慢病毒的細胞培養液2天，並讓所收集的慢病毒繼續感染胎豬成纖維細胞2次；5)當胎豬成纖維細胞中的細胞形態出現集落變化後，將細胞集落經lmg/ml Dispase II(Roche)消化後接種到經絲裂黴素處理的12. 5天的小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上，37. 5°C,5% CO2飽和溼度下培養；經4次感染後1周在小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上形成鳥巢狀豬幹細胞集落。3豬誘變細胞的鑑定核型分析0. 1 μ g/ml秋水仙素(Sigma)處理發生誘變的豬細胞集落2. 5小時，胰酶消化並重懸於0. 075mol/L KCL，37°C孵育25分鐘，固定液(甲醇冰醋酸=3 1)固定10分鐘，離心固定重複3次；收穫細胞，滴片，Gimsa染色，空氣乾燥，封片。顯微鏡下觀察及應用相關軟體分析染色體配對。免疫螢光檢測細胞經4%多聚甲醛固定，牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30 分鐘，添加一抗為兔抗Oct 4 (Abeam)、山羊抗Nanog (R&D)、鼠抗SSEA-1 (Chemicon)、鼠抗SSEA-3 (R&D)、鼠抗 SSEA-4 (R&D)、鼠抗 TRA-1-60 (Chemicon)、鼠抗 TRA-1-81 (Chemicon)，按 1 200稀釋後4°C孵育過夜。PBS洗3次，CT3紅色螢光標記的二抗按1 200稀釋後室溫避光孵育1小時，PBS洗3次，用1 μ g/mL的DAPI (Roche)進行細胞核染色1分鐘後螢光
鏡下觀察結果。鹼性磷酸酶染色用4%多聚甲醛固定細胞，添加鹼性磷酸酶染液進行染色，以胞漿著色為紅棕色或咖啡色顆粒為陽性。體內分化檢測胰酶消化發生誘變的豬細胞集落，無血清高糖DMEM培養液重懸細胞後注射到免疫缺陷鼠(BALB/C)背側皮下，腫瘤組織塊形成後頸部脫白處死裸鼠，取腫瘤組織塊4%多聚甲醛固定後進行蘇木精伊紅(HE)染色。4 結果胎豬成纖維細胞經過慢病毒感染1輪後，螢光顯微鏡下可見大部分的細胞強表達綠色螢光蛋白，細胞形態仍為纖維狀。對鋪滿培養皿的細胞進行常規消化傳代，再經過2-4 次的慢病毒感染，在纖維狀的胎豬成纖維細胞中有部分細胞開始改變原有的纖維狀形態， 細胞逐漸收縮變圓並增殖形成細胞集落。用DispaseII消化離心收集的圓球形細胞接種到飼養層細胞上，2天後在飼養層細胞上逐漸形成邊界明顯的集落狀細胞克隆。細胞克隆經過傳代培養後細胞集落邊界清晰，且傳代後的細胞生長速度較快，在1 4傳代的情況下細胞克隆大約每隔3-4天傳代1次，常規的細胞凍存復甦不影響細胞的生長狀態。高倍顯微鏡下細胞集落中單個細胞表現為細胞核較大，核質比例較高，伴隨著細胞傳代的增加，綠色螢光蛋白在細胞克隆中穩定和強表達，相同條件下未經慢病毒感染的胎豬成纖維細胞未出現細胞集落的形態變化。多聚甲醛固定的細胞集落經鹼性磷酸酶染液作用後，細胞集落鹼性磷酸酶染色呈強陽性，主要表現為細胞集落呈棕紅色或紫紅色，相同條件下小鼠胎兒成纖維細胞飼養層呈陰性。對培養傳至第4代的細胞集落進行核型分析檢測，細胞的染色體數為38，核型正常。使用0ct4和Nanog等幹細胞相關抗體對慢病毒作用形成的細胞集落進行檢測分析發現，細胞集落0ct4、NanOg和SSEA-I蛋白表達為陽性。細胞集落注射入BALB/C 免疫缺陷鼠腹部背側皮下6周後能夠形成明顯的腫瘤團塊，對腫瘤組織進行HE染色顯示， 在腫瘤組織內分布有類似神經、消化管腔、軟骨、肌肉等來自外胚層、中胚層、內胚層相關三個胚層來源的細胞或組織。
權利要求
1.一種豬體細胞誘變方法，其特徵在於，步驟如下1)取妊娠約60天左右的豬胎兒，採用組織塊培養法添加胎豬成纖維細胞培養液建立胎豬成纖維細胞系；2)磷酸鈣介導pLentiLox3. 7慢病毒表達載體及其包裝組分pMDLg、pRSV REV和pVSVg 在細胞中組建成慢病毒顆粒，12-16小時後更換新鮮細胞培養液，病毒包裝48小時後收集含慢病毒的細胞培養液，經超濾濃縮後添加到胎豬成纖維細胞培養板內；3)在胎豬成纖維細胞培養板內添加含終濃度為10μg/ml Polybrene的胎豬成纖維細胞培養液，此後，每天收集含慢病毒的細胞培養液，添加到胎豬成纖維細胞培養板中感染胎豬成纖維細胞2-4次；4)將胎豬成纖維細胞培養板內的培養液更換為含胎牛血清的高糖DMEM培養液的豬誘變細胞培養液，再連續收集含慢病毒的細胞培養液2-4天，並讓所收集的慢病毒感染胎豬成纖維細胞2-4次；5)當胎豬成纖維細胞中的細胞形態出現集落變化後，將細胞集落經DispaseII消化後接種到經絲裂黴素處理的12. 5天小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上，在飽和溼度培養箱中培養；經4次感染後1周在小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上形成鳥巢狀豬幹細胞集落。
2.根據權利要求1所述的豬體細胞誘變方法，其特徵在於，步驟1)所述的豬胎兒為杜洛克-長白-大約克三元雜交豬胎兒。
3.根據權利要求1所述的豬體細胞誘變方法，其特徵在於，步驟幻所述的胎豬成纖維細胞培養液為含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養液。
4.根據權利要求1所述的豬體細胞誘變方法，其特徵在於，步驟4)所述的豬誘變細胞培養液由高糖DMEM、2mM穀氨醯胺、2mM丙酮酸鈉、非必須胺基酸、0. ImM β-巰基乙醇、 1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF、15% FBS 和 1 %青鏈黴素組成。
全文摘要
本發明公開了一種豬體細胞誘變方法，利用攜帶增強型綠色螢光蛋白標記的慢病毒多次感染作用胎豬成纖維細胞，在幹細胞培養液的生長環境條件下胎豬成纖維細胞逐步改變原有的纖維狀生長形態，形成鳥巢狀細胞集落，分離培養傳代的細胞集落邊緣界限清晰，生長狀態穩定，核型正常，鹼性磷酸酶表達為陽性，免疫細胞化學檢測顯示Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白表達為陽性，體內分化形成含有三個胚層的畸胎瘤，結果證實慢病毒作用下發生誘變的豬體細胞具有幹細胞特徵。
文檔編號C12N7/01GK102174466SQ201110008808
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月14日 優先權日2011年1月14日
發明者丁建平, 任春環, 劉亞, 劉旭光, 劉洪瑜, 孫雪萍, 張衛琴, 張子軍, 張運海, 方富貴, 曹鴻國, 李運生, 殷慧群, 王力生, 章孝榮, 薛奕傑, 陳濤, 陶勇, 黃偉玲 申請人:安徽農業大學