一種羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗及其製備方法和應用的製作方法

2023-09-15 07:07:35 2

一種羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗及其製備方法和應用，在本發明的一種羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗中，其有效成分為經本發明發明人自行分離且經傳代致弱培養後獲得的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒，其保藏編號為CCTCC?NO：V201406。攻毒保護試驗結果顯示，本發明所製備的ORFV細胞弱毒疫苗安全，且能夠產生有效的免疫保護力。因此，本發明對於研製安全高效的弱毒疫苗以及用本發明公開的弱毒株規模化生產羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗來防控羊傳染性膿皰病具有重要的現實意義。
【專利說明】一種羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗及其製備方法和應用【技術領域】
[0001]本發明涉及一種弱毒疫苗及其製備方法和應用，特別涉及一種羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗及其製備方法和應用，本發明屬於獸醫生物製品領域。
【背景技術】
[0002]羊傳染性膿皰病(Contagious ecthyma, CE)又名羊傳染性膿皰性皮炎(Contagious pustular dermatitis),俗稱「羊口瘡(Orf) 」,是由是由副痘病毒成員羊傳染性膿皰病毒(Orf virus, 0RFV)感染引起山羊、綿羊和人的一種急性、接觸性和嗜上皮性的的人獸共患傳染病，以在患羊的口唇、蹄、乳房、外陰等處皮膚和黏膜形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和疣狀厚痂為特徵。世界動物衛生組織(OIE)將該病列為需申報類動物疾病，我國將其列為一類動物疫病。
[0003]該病最早發現於歐洲，目前，幾乎在所有養羊國家和地區均存在。自然情況下主要侵害綿羊和山羊，山羊較為多發。此外，駱駝、牛、鹿、麝牛、貓、幼犬、猴和人均有易感性。本病常呈群發性流行的趨勢，3~6月齡羔羊最易感染，常引起群體發病，尤其是飼養密集的羊群。範春玲等報導了我國2006年在北京市亞福動物養殖中心暴發該病，該病傳播速度快，發病率高達95.4%。近年來隨著肉羊產業的發展和羊頻繁流動，該病時有發生，甚至在一些大型種羊場都有該病的流行，給養羊業帶來了巨大的經濟損失，嚴重危害肉羊產業的健康發展。更為嚴重的是，此病可以通過傷口感染飼養人員，感染者表現為手背、指間和前臂部皰疹和破潰。例如2005年8月福建省永安市有8名羊場養殖工人因感染羊傳染性膿皰病毒而發病。可見，羊傳染性膿皰不但嚴重危害肉羊產業的健康發展，而且威脅人類的身體健康，是一種危害較為嚴 重的人畜共患傳染病。
[0004]目前，羊口瘡流行地區尚無有效的治療方法，所以，免疫接種成為了防控該病唯一有效的方法。爆發該病時許多基層養殖人員直接取病羊的痂皮研磨後與鹽水混合製成自家疫苗對未感染羊只進行接種；雖然該方法能在一定程度上控制病情的發，展，但是卻具有散布強毒的危險。目前疫苗的發展和應用主要集中在常規疫苗，如滅活疫苗和細胞弱毒疫苗，以及新型疫苗，如囊膜亞單位疫苗、核酸疫苗和重組疫苗上。但是目前，ORFV新型疫苗的研製還處於試驗階段，且新型疫苗往往製備過程繁瑣、技術要求高，應用於臨床還有很長一段路要走。滅活疫苗雖然國內外學者均有研究，但其免疫效果有限，從未真正應用於臨床。目前，在臨床上應用較為廣泛的仍然是ORFV弱毒疫苗，因為它具有用量少，能誘導機體產生較強的細胞免疫和體液免疫能力，且產生免疫保護力的時間持久的特點。在國內，雖然羊口瘡弱毒疫苗在青海省畜牧獸醫科學院獸醫研究所和甘肅省畜牧獸醫研究所均有研製，但其弱毒都是上世紀80年代前後的毒株，目前國內流行毒可能發生變異，很難保證其免疫的有效性。
[0005]本發明選用分離獲得的ORFV湖北通山縣分離毒株作為疫苗研製的候選毒株，利用牛睪丸支持細胞系傳代致弱，培育出符合「獸用新生物製品質量標準」的ORFV弱毒疫苗株，配比一定比例的耐熱凍幹保護劑製備凍幹弱毒疫苗，攻毒保護試驗結果顯示所製備的ORFV細胞弱毒疫苗能夠產生有效的免疫保護力。因此，本發明利用ORFV流行毒株研製安全高效的弱毒疫苗對於該病的防治具有重要的現實意義。

【發明內容】

[0006]針對現有羊傳染性膿皰弱毒疫苗的不足，本發明的目的在於提供一種羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗及其製備方法，以實現用簡單實用的製備方法生產出產量高、穩定性好、成本低、並且安全可靠的疫苗。
[0007]本發明的目的是通過如下技術方案實現的:
[0008]2009年11月中旬，湖北省通山縣某羊場有300多隻I月~3月齡黑山羊羔羊發病，發病率達80%，主要表現為典型的口瘡症狀，經多種抗生素和驅蟲藥治療無效，I周后有40多隻病羊死亡。本發明發明人通過對該病料進行病例複製、病毒分離，最終得到一株病毒株，經病毒理化特性鑑定、針對羊傳染性膿皰病毒B2L基因的特異性PCR檢測及測序證明分尚得到的病毒株該病原為羊傳染性膿皰病毒病毒(王光祥等，湖北省羊口瘡病毒的分離鑑定，動物醫學進展，2012，33 (11):37 — 40)，並將該病毒命名為Orf Virus HB-TS09株，簡稱 0RFV/HB/09 株。
[0009]用MDBK細胞系對湖北株羊口瘡病料進行適應分離的Orf Virus HB-TS09株病毒傳代至17代，再將該細胞毒接種新生牛睪丸原代細胞進行傳代致弱，傳代至55代時進行本動物安全試驗發現，該細胞毒已致弱。然後繼續傳代至85代，每隔五代取病毒(滴度TCID5tl不低於IO6_°/0.1mL)的細胞毒進行本動物安全試驗，證實該毒株傳代至55代後對綿羊羔羊、成年綿羊以及山羊羔羊以及成年山羊均安全。故取75~85代之間的傳代毒作為制苗毒種。其中，選擇Orf Virus HB-TS09第65代細胞傳代致弱毒作為羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗株，命名為羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65株，分類命名為羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒，並於2014年3月19日送交中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號CCTCC NO:V201406，保藏地址在武漢大學。
[0010]進一步的，本發明還提出了所述的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒在製備羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗中的應用。
[0011]本發明的一種羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗，其特徵在於其有效成分為本發明所述的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒。
[0012]此外，本發明還提供了一種製備羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗的方法，其特徵在於包括以下步驟:
[0013](I)病毒抗原的製備
[0014]選生長良好布滿單層的新生牛睪丸原代細胞(BT)，傾去營養液，按原營養液體積的1-10%接種羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65或其傳代毒的病毒液，吸附5-15分鐘後加DMEM維持液，調PH至7.0~7.2，加青黴素、鏈黴素各100單位/ml，於37°C、5% C02濃度培養箱中進行培養；培養40~72h，細胞病變(CPE)達到75%以上時收穫病毒，置-20°C冰箱反覆凍融兩次，然後進行無菌檢驗、安全檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗合格達到《中華人民共和國獸醫生物製品質量標準》中規定的各項指標，且病毒滴度(TCID5(i/0.1ml)不低於106/0.1mL時,作為羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒抗原,備用。[0015](2)疫苗的配製和凍幹
[0016]將步驟(1)製備的各項指標都合格的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒抗原與耐熱凍幹保護劑以1:1的比例混勻後，以2mL/瓶無菌條件下封裝於鏈瓶內，在低溫冷凍乾燥機內進行凍幹，即為成品弱毒疫苗，將其在2~8°C下保存。
[0017]在本發明所述的方法中，優選的，按原營養液體積的5%接種羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65的病毒液吸附10分鐘後加DMEM維持液，調PH至7.0~
7.2，加青黴素、鏈黴素各100單位/ml，於37°C、5% C02濃度培養箱中進行培養。
[0018]在本發明所述的方法中，優選的，所述耐熱凍幹保護劑中含有海藻糖30~70g/L，脫脂奶粉10~30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10~30g/L,明膠5~15g/L，精氨酸0.5~4g/L，維生素Cl~5g/L，剩餘成分為超純水，更優選的，所述耐熱凍幹保護劑中含有海藻糖50g/L，脫脂奶20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明膠10g/L，精氨酸1.5g/L，維生素C2.5g/L，剩餘成分為超純水。
[0019]所述的耐熱凍幹保護劑的製備方法包括:(I)對可高壓滅菌的物質:海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、脫脂奶粉、明膠按各自比例溶於超純水中，加熱至50~60°C溶解後，116°C滅菌30分鐘；(2)將不耐高溫的物質精氨酸、維生素C也按各自比例溶於超純水中，用孔徑為0.22 μ m濾膜過濾除菌:各組分別將(I)、(2)兩組份混合，得到所述的耐熱凍幹保護劑。
[0020]相較於現有技術，本發明的優點在於:
[0021]1、選用流行毒株的細胞傳代致弱毒來製備疫苗，保證了疫苗的免疫保護力；
[0022]2、利用本實驗室研製的針對ORFV病毒的耐熱凍幹保護劑，解決了羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗僅能在-15°C條件下保存和運輸的瓶頸技術，使該疫苗儲存、運輸更方便。
[0023]本發明將為臨床上針對羊傳染性膿皰病的防控以及羊傳染性膿皰病毒在羊群中的清除提供了重要的物質基礎和技術支撐，具有廣闊的應用前景。
【具體實施方式】
[0024]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨具體實施例的描述更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不多本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明精神和範圍下可以對本發明的技術方案和細節形式和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明保護的範圍內。
[0025]實施例1羊傳染性膿皰病毒株(Orf Virus HB-TS09株)的分離和致弱
[0026]1.1羊傳染性膿皰病毒株(Orf Virus HB-TS09株)的分離鑑定
[0027]2009年11月中旬，湖北省通山縣某羊場有300多隻I月~3月齡黑山羊羔羊發病，發病率達80%，主要表現為典型的口瘡症狀，經多種抗生素和驅蟲藥治療無效，I周后有40多隻病羊死亡。本發明發明人對該病料進行病例複製，病毒分尚，最終得到一株病毒株，該病毒株經病毒理化特性鑑定、針對羊傳染性膿皰病毒B2L基因的特異性PCR檢測及測序證明該病毒株為羊傳染性膿皰病毒病毒(王光祥等，湖北省羊口瘡病毒的分尚鑑定，動物醫學進展，2012，33 (11):37 — 40)，命名為 Orf Virus HB-TS09 株，簡稱 0RFV/HB/09 株。
[0028]1.2羊傳染性膿皰病毒株(Orf Virus HB-TS09株)的致弱[0029]用MDBK細胞系對湖北株羊口瘡病料進行適應分離的Orf Virus HB-TS09株病毒傳代至17代，病毒TCID5tl達到105 4/0.lmL。利用牛睪丸原代(BT)細胞進行傳代致弱。傳代至55代(每代次細胞毒致細胞病變(CPE)良好)，毒價均在IO6_°/0.1mL以上，回歸本動物進行本動物安全試驗發現，該細胞毒已致弱。然後繼續傳代至85代，進行進一步的試驗。
[0030]1.3毒種純淨性檢驗
[0031]分別取傳代致弱毒55代、60代、65代、70代、75代、80代、85代7代次細胞毒，按現行《中國獸藥典》，2010版，附錄42頁進行無菌檢驗。各代次細胞毒無菌落生長；按現行《中國獸藥典》，2010版，附錄49頁進行支原體檢驗。各代次細胞毒無支原體生長；按現行《中國獸藥典》，2010版，附錄40頁進行外源病毒檢驗。各代次細胞毒無外源病毒汙染；證明各代次致弱細胞毒純淨、無汙染。
[0032]1.2致弱毒 株安全性檢驗
[0033]分別取傳代致弱毒55代、60代、65代、70代、75代、80代、85代(各代次細胞病
毒TCID5tl不小於106_°/0.1mL)，每代次細胞毒，以Iml的接種劑量(羊口腔黏膜劃線接種0.4mL、股內側皮內接種0.6mL)接種I年齡左右健康易感綿羊(從未患過羊傳染性膿皰病毒病、也未注射過羊傳染性膿皰病疫苗的健康易感綿羊)3隻；以Iml的接種劑量(羊口腔黏膜劃線接種0.4mL、股內側皮內接種0.6mL)分別接種I年齡左右健康易感山羊(從未患過羊傳染性膿皰病毒病、也未注射過羊傳染性膿皰病疫苗的健康易感山羊)3隻，共接種8組。隨機挑選綿羊、山羊各一隻以ImL劑量接種生理鹽水(羊口腔黏膜劃線接種0.4mL、股內側皮內接種0.6ml)做對照。口腔黏膜劃線接種後每日測定接種羊和對照羊的體溫和口腔黏膜的病變情況，觀察15日，進行致弱毒株安全性評價。
[0034]結果:
[0035]接種各代次Orf Virus HB-TS09株致弱毒株的羊只組在觀察期內，各試驗組羊只，在口腔黏膜均出現紅點，在接種後3天自行消失。對照羊正常。證明致弱毒株Orf VirusHB-TS09株對綿羊、山羊均安全、無致病性,是一株安全的疫苗弱毒株。
[0036]選擇Orf Virus HB-TS09第65代致弱毒株作為羊傳染性膿皰病毒弱毒疫苗株，命名為羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65,並於2014年3月19日送交中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號CCTCC NO:V201406，保藏地址在武漢大學。
[0037]實施例2羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗的製備
[0038]2.1羊傳染性膿皰弱毒抗原的製備
[0039]選生長良好布滿單層的新生牛睪丸原代細胞(BT)，傾去營養液，按原營養液體積的5%接種羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒Orf Virus HB-TS09F65的病毒液(CCTCC NO:V201406)，吸附10分鐘後加DMEM維持液，調PH至7.0，加青黴素、鏈黴素各100單位/ml，於37°〇、5%0)2濃度培養箱中進行培養。培養4811，細胞病變(CPE)達到80%時收穫，置_20°C冰箱反覆凍融兩次，然後進行無菌檢驗、安全檢驗、支原體檢驗合格達到《中華人民共和國獸醫生物製品質量標準》中規定的各項指標，Reed-Muench法測定Orf Virus HB-TS09F65的病毒滴度(TCID5(i/0.1ml)為106 5/0.1ml。共製備羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒病毒液5000ml作為製備疫苗的病毒抗原。
[0040]2.2.疫苗的配製和凍幹
[0041]將2.1製備的各項指標都合格的羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒抗原與耐熱凍幹保護劑(海藻糖5g/L、脫脂奶2g/L、聚乙烯吡咯烷酮2g/L、明膠lg/L、精氨酸0.15g/L、Vc0.25g/L、剩餘成分為超純水，經無菌處理得到的保護劑。)以體積比1:1的比例混勻後，以2mL/瓶無菌條件下封裝於鏈瓶內，在低溫冷凍乾燥機內進行凍幹，即為成品弱毒疫苗，並將其在2°C-8°C溫度下保存。共製備弱毒凍幹疫苗三批每批1700瓶，批號為:20130526、20130822,20130829ο
[0042]實施例3羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗成品檢驗
[0043]3.1物理性狀
[0044]產品為微黃色海綿狀疏鬆團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液後迅速溶解。
[0045]3.2無菌檢驗
[0046]從製備保存的20130526、20130822、20130829三批羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗中每批苗隨機取三瓶，按現行《中國獸藥典》，2010版，附錄42頁進行，疫苗成品無細菌生長。
[0047]3.3支原體檢驗
[0048]從製備保存的20130526、20130822、20130829三批羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗中
每批苗隨機取三瓶，按現行《中國獸藥典》，2010版，附錄49頁進行支原體檢驗。各代次細胞毒無支原體生長；
[0049]3.4外源病毒檢驗
[0050]從製備保存的20130526、20130822、20130829三批羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗中
每批苗隨機取三瓶，按現行《中國獸藥典》，2010版，附錄40頁進行外源病毒檢驗。各代次細胞毒無外源病毒汙染；證明各代次致弱細胞毒純淨、無汙染。
[0051 ] 3.5凍幹弱毒疫苗安全性檢驗
[0052]選健康羊傳染性膿皰病病史的成年綿羊(I年齡)和成年山羊(I年齡)各4隻。進行疫苗安全檢驗。具體方法同1.2。
[0053]試驗結果表明，試驗羊只均未發現明顯的體溫變化和口腔病變。說明該弱毒疫苗對綿羊和山羊安全、無致病性。安全檢測合格。
[0054]3.6凍幹羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗剩餘水分測定
[0055]從製備保存的20130526、20130822、20130829三批羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗中每批苗隨機取三瓶，按現行《中國獸藥典》，2010版，附錄38頁進行測定，三批疫苗均符合規定。
[0056]3.7凍幹羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗真空度測定
[0057]從製備保存的20130526、20130822、20130829三批羊傳染性膿皰細胞弱毒疫苗中
每批苗隨機取三瓶，按現行《中國獸藥典》，2010版，附錄48頁進行測定，三批疫苗均符合規定。
[0058]實施例4凍幹弱毒疫苗效力檢驗
[0059]4.1從製備保存的20130526、20130822、20130829三批羊傳染性膿皰細胞弱毒疫
苗中每批苗隨機取三瓶，按原量稀釋混合，用犢牛睪丸原代細胞測定半數感染量(TCID5tl)，要求羊口瘡凍幹疫苗TCID5tl不低於106/0.lmL。
[0060]4.2每批疫苗用6月齡健康羔羊4隻，於口腔下唇黏膜劃痕接種疫苗0.2mL,另用同樣條件的健康羔羊作對照，21~25天用強毒Orf Virus HB-TS09株攻擊(100ID5(i/0.2mL)。觀察10~15天，結果如表1所示。說明使用本發明的羊傳染性膿皰細胞弱毒株Orf Virus HB-TS09F65株所製備的凍幹弱毒疫苗對綿羊和山羊免疫保護力好，可用臨床免疫預防羊羊傳染性膿皰病.[0061]表1凍幹弱毒疫苗效力檢驗
[0062]
【權利要求】
1.羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒，命名為羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒OrfVirus HB-TS09F65株，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏時間為2014年3月19日，保藏編號為 CCTCC NO:V201406。
2.權利要求1所述的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒在製備羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗中的應用。
3.一種羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗，其特徵在於有效成分為權利要求1所述的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒或其傳代毒。
4.一種製備權利要求3所述的羊傳染性膿皰病毒細胞弱毒疫苗的方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)病毒抗原的製備 選生長良好布滿單層的新生牛睪丸原代細胞，傾去營養液，按原營養液體積的1-10%接種權利要求1所述的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒或其傳代毒的病毒液，吸附5-15分鐘後加DMEM維持液，調PH至7.0~7.2，加青黴素、鏈黴素各100單位/ml，於37°C、5% C02濃度培養箱中進行培養；培養40~72h，細胞病變達到75%以上時收穫病毒，置-20°C冰箱反覆凍融兩次，然後進行無菌檢驗、安全檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗，達到《中華人民共和國獸醫生物製品質量標準》中規定的各項指標，且病毒滴度不低於IO6TCID5tlA).1ml時，作為羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒抗原，備用； (2)疫苗的配製和凍幹 將步驟(1)製備的各 項指標都合格的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒抗原與耐熱凍幹保護劑以體積比1:1的比例混勻後，以2mL/瓶無菌條件下封裝於鏈瓶內，在低溫冷凍乾燥機內進行凍幹，即為成品弱毒疫苗，將其在2°C _8°C下保存。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，按原營養液體積的5%接種權利要求1所述的羊傳染性膿皰病毒細胞傳代致弱毒的病毒液，吸附10分鐘後加DMEM維持液，調PH至7.0~7.2，加青黴素、鏈黴素各100單位/ml，於37°C、5% C02濃度培養箱中進行培養。
6.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述耐熱凍幹保護劑中含有海藻糖30~70g/L，脫脂奶粉10~30g/L，聚乙烯吡咯烷酮10~30g/L,明膠5~15g/L，精氨酸0.5~4g/L,維生素Cl~5g/L,剩餘成分為超純水。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述耐熱凍幹保護劑中含有海藻糖50g/L，脫脂奶20g/L，聚乙烯吡咯烷酮20g/L，明膠10g/L，精氨酸1.5g/L，維生素C2.5g/L，剩餘成分為超純水。
【文檔編號】A61K39/275GK104017776SQ201410160855
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】劉湘濤, 王光祥, 尚佑軍, 張志東, 王豔華, 黎攝兒, 田宏, 吳錦豔, 陳妍, 逯忠新 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所