EB病毒VCA/EA‑IGA細胞免疫螢光檢測試劑的製作方法
2023-09-15 02:21:00
本發明涉及生物醫學技術領域，特別是涉及一種eb病毒vca/ea-iga細胞免疫螢光檢測試劑。
背景技術：
鼻咽癌是我國南方地區常見的惡性腫瘤，鼻咽癌的發生是個多因素、多階段的過程。eb病毒可導致鼻咽部上皮細胞永生化，從而進一步使其惡化。
在針對鼻咽癌的篩查及臨床診斷研究中，較為肯定的eb病毒抗原主要有衣殼抗原(vca)和早期抗原(ea)。已有研究證實ebvvca-iga抗體可出現於鼻咽癌確診前10-61個月，通過持續檢測ebvvca-iga有助於發現早期鼻咽癌。ea-iga的出現通常提示機體eb病毒複製開始，在鼻咽癌患者有較高的特異性，不足之處在於敏感性較低，臨床篩查及血清學診斷多與vca-iga配合使用，可提高篩查的準確率。
vca-iga和ea-iga的常見的檢測方法有：酶聯免疫吸附法、免疫酶法、間接免疫螢光法。
酶聯免疫吸附法：將vca或ea重組抗原包被於微孔板中，血清中的抗體與微孔中的抗原反應，形成抗原-抗體複合物；洗板後加入酶標二抗進行反應，形成抗原-抗體-酶標二抗複合物；洗板後加入顯色底物進行顯色反應，然後加入酸性終止液終止反應。使用酶標儀讀取反應液的od值。根據比較樣本的od值與陽性質控品的od值來判讀陰陽性。酶聯免疫吸附法.敏感性高，但特異性低，容易產生假陽性和假陰性。另外該方法屬於半定量，無法實現精準定量。
免疫酶法：特定的細胞固定於載玻片上，血清中的抗體與載玻片上的細胞孵育反應，形成細胞-抗體複合物；洗片後加入酶標二抗，形成細胞-抗體-酶標二抗複合物；洗片後加入顯色底物反應；反應結束後洗片，並封片，利用普通光學顯微鏡觀察細胞著色情況。根據細胞著色深淺判斷血清樣本的陰陽性。免疫酶法存在幹擾因子較多，容易誤判的缺陷，而人工判讀則又存在主觀性強，難以進行質量控制和統一比較。
間接免疫螢光法：特定的細胞固定於載玻片上，血清中的抗體與載玻片上的細胞孵育反應，形成細胞-抗體複合物；洗片後加入螢光素標記二抗，形成細胞-抗體-螢光素標記二抗複合物；反應結束後洗片，並封片，利用螢光顯微鏡觀察細胞螢光情況。根據細胞螢光有無或深淺判斷血清樣本的陰陽性。間接免疫螢光法敏感性不高、自動化程度低，主觀性強，無法實現標準化定量。
以上各種檢測方法結果的準確性、自動化操作程度的局限因素均與檢測試劑有關，如果能夠提供性能較好的試劑可以提高檢測的準確性。
因此，針對現有技術不足，提供一種eb病毒vca/ea-iga細胞免疫螢光檢測試劑以克服現有技術不足甚為必要。
技術實現要素：
本發明的目的在於避免現有技術的不足之處而提供一種eb病毒vca/ea-iga細胞免疫螢光檢測試劑，該eb病毒vca/ea-iga細胞免疫螢光檢測試劑具有良好的敏感性和特異性，能夠提高檢測準確結果。
本發明的上述目的通過如下技術手段實現。
提供一種eb病毒vca/ea-iga細胞免疫螢光檢測試劑，主要成分包括細胞片、螢光二抗fitc-iga、陽性對照質控品、陰性對照質控品、封片劑、pbs粉劑和蓋玻片。
細胞片的製備過程如下,
(1)建立細胞系
(1.1)培養液的設置：以rpmi1640為基礎培養基，添加10％～15％的胎牛血清，調整培養液ph初始值為7.2～7.4；
(1.2)建立b95-8細胞系和raji細胞系
b95-8細胞系的建立工藝是：將b95-8細胞放於上述培養液中，置於35～37℃含3～6％co2的培養箱中培養，建立表達效率穩定均一的b95-8細胞系；
raji細胞系的激活工藝是：在500～1000rpm的條件下離心5～10分鐘收集raji細胞，用新的培養液重懸raji細胞，並調整raji細胞深度為(1～3)×106個/ml，增加正丁酸鈉至終濃度為0.1～1mm，增加tpa至終濃度為10～100ng/ml，並置於35～37℃含3～6％co2的培養箱中培養12～48h，即建立了表達效率穩定均一的raji細胞系；
(2)細胞片的均一性控制
塗片的細胞控制傳代在50代以內，以細胞裂解個數少於5％為標準，以相同的塗片工藝進行塗片。
另一優選的，(1)建立細胞系
(1.1)培養液的設置：以rpmi1640為基礎培養基，添加12％～14％的胎牛血清，調整培養液ph初始值為7.3；
(1.2)建立b95-8細胞系和raji細胞系
b95-8細胞系的建立工藝是：將b95-8細胞放於上述培養液中，置於36℃含5％co2的培養箱中培養，建立表達效率穩定均一的b95-8細胞系；
raji細胞系的激活工藝是：在600～900rpm的條件下離心6～8分鐘收集raji細胞，用新的培養液重懸raji細胞，並調整raji細胞深度為2×106個/ml，增加正丁酸鈉至終濃度為0.3～0.5mm，增加tpa至終濃度為30～80ng/ml，並置於36℃含5％co2的培養箱中培養15～36h，即建立了表達效率穩定均一的raji細胞系。
進一步的，稀釋的螢光二抗fitc-iga、陽性對照質控品、陰性對照質控品在2～8℃的條件下均可穩定12個月。
進一步的，螢光二抗fitc-iga、陽性對照質控品或陰性對照質控品的稀釋液含有穩定劑；
以稀釋液重量份為1，穩定劑含有如下重量百分比的成分：
甘氨酸1％～5％、
海澡糖1％～5％、
bsa1％～5％、
pbs1％～3％。
另一優選的，穩定劑含有如下重量百分比的成分：
甘氨酸2％～3％、
海澡糖1％～4％、
bsa2％～3％、
pbs2％～2.5％。
進一步的，以重量百分比計，所述封片劑含有：
甘油10％～30％；
螢光保護劑3～8％；
pbs50％～90％。
另一優選的，以重量百分比計，所述封片劑含有：
甘油15％～20％；
螢光保護劑5～7％；
pbs65％～80％。
優選的，上述的eb病毒vca/ea-iga細胞免疫螢光檢測試劑，成品結構為在一載玻片上具有12孔疏水圓孔的結構，12孔疏水圓孔呈兩列設置，每列均為6個。
進一步的，12孔疏水圓孔呈兩行六列矩陣排布。
進一步的，成品結構的載玻片具有識別碼。
本發明的eb病毒vca/ea-iga細胞免疫螢光檢測試劑，主要成分包括細胞片、螢光二抗fitc-iga、陽性對照質控品、陰性對照質控品、封片劑、pbs粉劑和蓋玻片。本發明的試劑具有敏感性、特異性高的特點，能夠提高檢測的精確度。
具體實施方式
結合以下實施例對本發明作進一步描述。
實施例1。
一種eb病毒vca/ea-iga細胞免疫螢光檢測試劑，主要成分包括細胞片、螢光二抗fitc-iga、陽性對照質控品、陰性對照質控品、封片劑、pbs粉劑和蓋玻片。
細胞片的製備過程如下,
(1)建立細胞系
(1.1)培養液的設置：以rpmi1640為基礎培養基，添加10％～15％的胎牛血清，調整培養液ph初始值為7.2～7.4。
(1.2)建立b95-8細胞系和raji細胞系
b95-8可天然表達ebvvca，b95-8細胞系的建立工藝是：將b95-8細胞放於上述培養液中，置於35～37℃含3～6％co2的培養箱中培養，建立表達效率穩定均一的b95-8細胞系。
raji細胞培養條件與b95-8細胞一樣，但raji細胞須經激活劑激活方可表達ebvea。raji細胞系的激活工藝是：在500～1000rpm的條件下離心5～10分鐘收集raji細胞，用新的培養液重懸raji細胞，並調整raji細胞深度為(1～3)×106個/ml，增加正丁酸鈉至終濃度為0.1～1mm，增加tpa至終濃度為10～100ng/ml，並置於35～37℃含3～6％co2的培養箱中培養12～48h，即建立了表達效率穩定均一的raji細胞系。
(2)細胞片的均一性控制
塗片的細胞控制傳代在50代以內，以細胞裂解個數少於5％為標準，以相同的塗片工藝進行塗片。
本發明稀釋的螢光二抗fitc-iga、陽性對照質控品、陰性對照質控品在2～8℃的條件下均可穩定12個月。
穩定性的效果通過穩定劑作用達到。具體的，螢光二抗fitc-iga、陽性對照質控品或陰性對照質控品的稀釋液含有穩定劑，含有穩定劑的稀釋液的ph值控制在7.2至7.3之間。
以稀釋液重量份為1，穩定劑含有如下重量百分比的成分：
甘氨酸1％～5％、
海澡糖1％～5％、
bsa1％～5％、
pbs1％～3％。
具體的，以重量百分比計，封片劑含有：
甘油10％～30％；
螢光保護劑3～8％；
pbs50％～90％。
該eb病毒vca/ea-iga細胞免疫螢光檢測試劑，成品結構為在一載玻片上具有12孔疏水圓孔的結構，12孔疏水圓孔呈兩列設置，每列均為6個。優選，12孔疏水圓孔呈兩行六列矩陣排布。為了識別準確及自動化應用，成品結構的載玻片具有識別碼，適用於與自動化免疫分析儀匹配，並可配套ebvvca/ea-igacif即時滴度定量判讀軟體進行實時定量判讀，使得自動化監測成為可能。
本發明的eb病毒vca/ea-iga細胞免疫螢光檢測試劑，主要成分包括細胞片、螢光二抗fitc-iga、陽性對照質控品、陰性對照質控品、封片劑、pbs粉劑和蓋玻片。
本發明中新改良了兩種經激活可穩定高效表達抗原的細胞系b95-8和raji，同時對細胞片、螢光二抗和質控品做了穩定性處理和優化，使試劑的敏感性和特異性均大大提高。
通過對細胞片、螢光二抗和ebvvca/eaiga質控品添加穩定劑，使試劑的效期大大增長。相比於目前市場上產品的有效期提高了至少一倍。
ebvvca/eaigacif檢測試劑的成品設計可配套應用於全自動螢光免疫分析儀(helios)，實現操作過程自動化。且優化的塗片工藝和均勻性控制，使得細胞片批間差減少，應用在ebvvca/eaigacif即時滴度定量判讀系統，可得出更準確的定量結果，實現全國實驗室間的可比性。
實施例2。
一種eb病毒vca/ea-iga細胞免疫螢光檢測試劑，其它特徵與實施例1相同，不同之處在於：細胞片的製備過程如下。
(1)建立細胞系
(1.1)培養液的設置：以rpmi1640為基礎培養基，添加12％～14％的胎牛血清，調整培養液ph初始值為7.3；
(1.2)建立b95-8細胞系和raji細胞系
b95-8細胞系的建立工藝是：將b95-8細胞放於上述培養液中，置於36℃含5％co2的培養箱中培養，建立表達效率穩定均一的b95-8細胞系；
raji細胞系的激活工藝是：在600～900rpm的條件下離心6～8分鐘收集raji細胞，用新的培養液重懸raji細胞，並調整raji細胞深度為2×106個/ml，增加正丁酸鈉至終濃度為0.3～0.5mm，增加tpa至終濃度為30～80ng/ml，並置於36℃含5％co2的培養箱中培養15～36h，即建立了表達效率穩定均一的raji細胞系。
本發明中新改良了兩種經激活可穩定高效表達抗原的細胞系b95-8和raji，同時對細胞片、螢光二抗和質控品做了穩定性處理和優化，使試劑的敏感性和特異性均大大提高。
實施例3。
一種eb病毒vca/ea-iga細胞免疫螢光檢測試劑，其它特徵與實施例1相同，不同之處在於：穩定劑含有如下重量百分比的成分：
甘氨酸2％～3％、
海澡糖1％～4％、
bsa2％～3％、
pbs2％～2.5％。
本發明中新改良了兩種經激活可穩定高效表達抗原的細胞系b95-8和raji，同時對細胞片、螢光二抗和質控品做了穩定性處理和優化，使試劑的敏感性和特異性均大大提高。
通過對細胞片、螢光二抗和ebvvca/eaiga質控品添加穩定劑，使試劑的效期大大增長。相比於目前市場上產品的有效期提高了至少一倍。
ebvvca/eaigacif檢測試劑的成品設計可配套應用於全自動螢光免疫分析儀(helios)，實現操作過程自動化。且優化的塗片工藝和均勻性控制，使得細胞片批間差減少，應用在ebvvca/eaigacif即時滴度定量判讀系統，可得出更準確的定量結果，實現全國實驗室間的可比性。
實施例4。
一種eb病毒vca/ea-iga細胞免疫螢光檢測試劑，其它特徵與實施例1相同，不同之處在於：以重量百分比計，封片劑含有：
甘油15％～20％；
螢光保護劑5～7％；
pbs65％～80％。
本發明的試劑的敏感性和特異性性能均佳，穩定性良好，適合與自動化設備配套使用。
最後應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護範圍的限制，儘管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和範圍。