一種新型檢測急性心肌梗死變異生物標誌的試劑盒和方法

2023-09-15 02:19:55

專利名稱：：一種新型檢測急性心肌梗死變異生物標誌的試劑盒和方法
技術領域：
：本發明涉及一種新的生物樣品中蛋白質分析方法，一種通過能與抗體結合的基質去捕獲生物標誌，並用有定量控制的質譜分析來檢測生物標誌。在此提及的此項發明涉及急性心肌梗死檢測領域，為一種新的非侵入性的體外檢測方法。更確切地講，此發明涉及到生物標誌(biomarkers)，而這些抗原或生物標誌能被以更高的特異性和靈敏度的抗體組及定量控制的質譜將急性心肌梗死疾病一次性區分出來。本發明可以應用到己經脫離人體的體液中的生物標誌組合的急性心肌梗死檢測方法或試劑盒開發。
背景技術：
：隨著人類基因組計劃的實施和完成,科學家們提出了後基因組(post-genome)計劃的概念，研究要點轉移到功能基因組學上，而生物功能主要體現物質是蛋白質。1994年，澳大利亞Macquarie大學的Wilkins和Williams首先提出蛋白質組(proteome)的概念，指的是"一種基因組所表達的全部蛋白質"，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質。對於蛋白質組的研究是功能基因組學研究的核心，稱為蛋白質組學(proteomics)。蛋白質組學被認為是後基因組研究中最主要的部分。與基因組相比，蛋白質組的組成更複雜，功能更活躍，應用前景更廣泛。蛋白質組學從細胞整體水平進行蛋白質屬性的研究，如表達水平、翻譯後修飾及相互作用等，並由此獲得對於疾病過程、細胞生理生化特徵和調控M絡的廣泛完整的認識。所以，蛋白質組學技術正在逐步成為生物學、醫學及製藥學等的重要研究手段。不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決於細胞所表達的蛋白質功能。閒此，鑑定人體內表達的蛋白質的區別，可用於體外疾病樣本診斷及篩査，並最終用於藥物開發和疾病治療。而要進行蛋白質表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨細胞內分子的複雜混合物的程度。但細胞內許多物質往往以微量存在，R前用於分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規手段難以進行化學結構及蛋白質序列鑑定分析。用抗體及質譜聯合可克服這一技術缺點。本發明用抗體組及質譜聯合可同時檢測出多種(三種以上)的生物標誌的方法。如，血庫篩查要求特異性地檢測出常見病毒微生物疾病的已知標記。但是，製備特異性結合標記並且能在複雜的混合物中鑑別出標記的試劑需要大量時間，這阻礙了此類體外診斷試劑盒方法的發展。目前，還沒有一種方法能夠將四種以上疾病標誌物同時檢出。ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay)試劑盒等利用抗體可以用於檢測一種疾病標誌物。利用抗體及三色免疫螢光，最多可以做到檢測三種疾病標誌物，但三種以上疾病標誌物就無法同時檢測。利用抗體組與質譜儀聯合應用，即可以觶決同時鑑別三種以上的病毒或微生物抗原標誌物。舉例講，將抗HBV(HBsAg)抗體，抗HCV抗體，抗HIVp24antigen(RibasSGetal.Performanceofaquantitativehumani咖unodeficiencyvimstype1p24antigenassayonvariousHIV-lsubtypesforthefollow-upofhumanimmunodeficiencytype1seropositiveindividuals.JVirolMethods2003;113:29-34)及抗梅毒抗體(anti-treponemal17kDaprotein)(GeorgeRetal.Ananalysisofthevalueofsomeantigen-antibodyinteractionsusedasdiagnosticindicatorsinatreponemalWesternblot(TWB)testforsyphilis.JClinLabImmunol1998;50:27-44)等抗體聯合標記至ProteinA或G的支持物(磁性珠子、晶片等)上。由於每種特異體抗體捕獲生物抗原的分子量是不同的，故ProteinA/G-抗體與質譜儀聯合應用時，質譜儀就非常容易地將這四種抗原同時分開了。由此推理，如果同時選擇四種以上的抗體，而這四種以上抗體所結合的抗原分子量是不同的，則本發明可同時區分四種以上不同種類的疾病。本發明可以檢測窗口期的獻血者，這比單純的ELISA抗體試劑盒更安全(LauDT,etal.ArapidimmunochromatographicassayforhepatitisBvirusscreening.JViralH印at2003:10:331-334)。另外，本發明的方法可同時檢測出多種變異的生物標誌，抗體與質譜儀聯合應用是一種高靈敏度、高準確性的檢測方法，它能從一個不同成分的混合體系中檢查和區分不同組分、不同分子量(差別在1或2個胺基酸之間)的生物標誌(蛋白質)。將來，它可能成為臨床上許多疾病檢測的新模式，作為臨床檢査的常規方法。舉例，區別胃癌中血清纖維蛋白肽A及變異的纖維蛋白肽A,應用以往方法不能確定哪種肽類片段與發病有關，現在可以抗體與質譜儀聯合應用，將其中這種組分和它們的分子量清晰區分開來，並找到與該病發病有關的特殊組分，這是分子醫學的革命。本發明的方法可同時檢測出多種修飾生物標誌。修飾的生物標記群指的修飾蛋白質為甲基化、乙醯化、羥基化、磷酸化修飾等。在人類腫瘤的發生發展過程中，過去對腫瘤臨床檢測一直停留在細胞水平上，因此臨床醫生長期盼望的真正意義上的早期診斷(如實體瘤在尚未形成包塊以前，白血病在骨髓細胞檢査不能確診以前)是不可能實現的。
發明內容本發明的目的是建立一種在生物樣品中檢測正常人與愈性心肌梗死病人在離體血液中生物標誌的方法。此發明涉及到生物標誌(biomarkers)，而這些生物標誌能被用來以更高的特異性和靈敏度將急性心肌梗死患者同時區分出來。該方法為疾病的早期急性心肌梗死檢測提供了新的途徑，並為進一步發現新的變異的或修飾的生物標誌提供了基礎。本發明涉及一種通過標記特異性抗體至能與抗體結合的基質表面，並用定量性質譜分析來同時檢測某種疾病的多種生物標誌或多種疾病狀態。生物標誌群可以是不變異的、變異的、修飾的。變異的的生物標誌群是指變異蛋白質為增加或減少一個或多個胺基酸。修飾的生物標記群是指修飾蛋白質為甲基化、乙醯化、羥基化、磷酸化修飾等。本發明中的生物標誌是利用一臺質譜儀來發現的。該設備的質量精確度約為+/-0.1%。基質是任何能與抗體選擇性或特異性結合的物質。舉例說明，ProteinA和G基質吸附抗體Fc段的功能。具有吸收劑功能的ProteinA和G底基與抗體結合，抗體結合血清中生物標誌。經過一段足夠的時間使生物標誌能與抗體-ProteinA和G結合。WCX陰離子，SAX陽離子，C8/C18疏水作用基質吸附劑，分離生物化學中的這些方法和由這些方法產生的吸附劑具有診斷反面的用途(即陰離子吸附劑捕獲陽離子蛋白質，配位共價金屬螯合劑上滯留說明多肽分析物內存在組氨酸殘基)。底基洗去未吸附的物質。任何適宜的洗液均可使用。生物標誌首先能夠被具有能與生物標誌物結合的抗體-基質吸附表面捕獲，非吸附物能從基質上洗脫，吸附到底基的生物標誌物在質譜儀中被檢測。生物標誌通過離子發生源，如雷射，被離子化，產生的離子被一個離子感受集合器收集，然後質量分析器分析那些通過的離子。之後，檢測器將檢測的離子信息轉換為質荷比。定量性控制及質譜雷射能量調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清，將標準化質控血清中用於定量的標準峰4091.1Da或6634.0Da強度調至50%質譜信號強度的最大值。生物標誌的檢測明顯地將與信號強度的檢測有關。這樣，生物標誌的數量與質量都可以被檢測出來。飛行質譜對待分析物的分析生成飛行時間譜。該飛行時間譜的最終分析並不表示離子化能量攻擊一個樣本產生的單獨的脈衝信號，而是一系列脈沖的信號之和。這樣降低了幹擾，並增加了動態範圍。該飛行時間數據受數據處理軟體的影響。軟體中數據處理主要包括轉換飛行時間與質荷比而產生質譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而減輕高頻噪音。通過對生物標誌的吸附和檢測而產生的數據可利用計算機的數據分析程序進行分析。該電腦程式分析這些數據以顯示檢測出的生物標誌的數量，並顯示信號的強度和確定被檢測的每個生物標誌的分子量。數據分析還能包括一系列的確定生物標誌的信號強度和矯正數據對預定統計分布狀態的偏離。例如，通過計算與某些參數相關的每個峰值的高度，可規範觀測到的峰。該參數可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學成分產生的不重要的千擾，這可以設置調零。計算機可以將計算結果數據轉換成各種形式來表現。其標準譜可以表示，但在一種形式中只有峰高和質量信息可以在譜帶中保留，產生一個較淸晰的圖，並使具有幾乎相同分子量的生物標誌物更易顯現。在另一種形式中，兩個或更多的譜比較，便於突顯獨特的生物標誌物和那些高於或低於校準樣本的生物標誌物。分析一般包括展示從待分析物得到的信號的圖譜中峰的鑑定。峰可以通過視圖進行選擇，軟體是可用的，它可自動檢測峰。一般情況下，該軟伴通過鑑定信號具有信噪比高於一個選擇閾值並標記出在峰信號的質心處的峰的質量這樣的方式操作。在一個有效的程序中，比較許多譜線以認定出現在質譜中某一選定範圍內同樣的一些峰。該軟體的一個版本聚集所有出現在確定的質量範圍內的各條光譜的峰，對所有在質量(質荷比)中值附近的峰指定一個質量(質荷比)簇。發明中使用的生物標誌是被抗體所捕。這些生物標記是進一步通過質譜(massspectrometry)測定其不同分子量來知道它們特定的身份。對生物標誌的檢測需要將一個樣本放基質的一個吸附點上，接著進行清洗。電噴霧電離質譜(electrosprayionizsationmassspectrometry,ESI-MS)是在毛細管的出d處施加一高電壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最後液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。基質輔助雷射解析/電離飛行時間質譜(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)的基本原理是向吸附點上加入SINAPINIC酸等並讓其千燥，將分析物分散在分子中並形成晶體，當用雷射照射晶體時，由於基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量蓄積並迅速產熱，從而使基質晶體升華，致使連同分析物一起進入氣相。而後，用質譜測定法對基質進行分析，而一個顯示了蛋白質分子的遺留物圖將生成，這張圖是在蛋白質分子的質量-電荷比的基礎上，以彼此分開的峰圖的形式顯示出來的。閒為本項發明中的生物標誌是通過質譜和抗體基質來標識的，丙而它們可通過質譜測定法進行檢測而直接知道它們特定的身份。這種方法比抗體為基礎的ELISA及免疫螢光法更準確。實施例2急性心肌梗死中血清生物標誌的排序鑑定，査已知基因組或cDNA庫資料庫中的正常纖維蛋白肽A分子的化學結構(從N端至C端排列16個胺基酸，分子量為1536.7Da):N端Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu"Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端纖維蛋白肽A的抗體與質譜儀聯合應用發現分子量為1465土1Da變異的纖維蛋白肽A。則化學結構及分子量可以(從N端至C端)排列為15個胺基酸N端Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端。抗體為基礎的ELISA及免疫螢光法則無法區別急性心肌梗死中血清纖維蛋白肽A及變異的纖維蛋白肽A。然而，如果有必要，這些生物標誌也可通過，比如，確定多肽的胺基酸序列來進行鑑別。在蛋白質化學及蛋白質組學研究中，為了增加蛋白質鑑定的可信度，獲得一段蛋白質肽片段內部序列信息通常是非常重要的。對於蛋白質及多肽的序列測定，傳統的方法是採用Edman降解方法，而該方法最大的不足之處在於費時太長(一個殘基需花費30-40分鐘)。近年來，隨著質譜技術的飛速發展，尤其是多級質譜(MS/MS)以及源後裂解(PSD)等技術的發展，應用質譜測序已成為一種流行的方法。例如，一個生物標誌能用許多酶描繪出來，例如V8蛋白酶(V8protease)或胰蛋白酶，而且消化片段(digestionfragments)的分子量可被用來在資料庫中搜索序列，這些序列與由多種酶生成的消化片斷的分子量相吻合。或者，如果此生物標誌不是已知資料庫中的蛋白質分子，在生物標誌的N極胺基酸序列(N-terminalAminoAcidSequence)的基礎上，可使用降解探針，而後，這些探針會被用來描繪由探測到了生物標誌的樣本所生成的基岡組或cDNA庫。最後，蛋白質生物標誌可用蛋白質梯狀排序法(proteinladdersequencing)進行排序。通過將分子碎成碎片並將碎片用酶解作用或其他可按順序從碎片末端除去一個單個胺基酸分子的方法進行處理後，可生成蛋白質梯度(proteinladders)。然後，用質譜對此梯度進行分析。階梯狀碎片(ladderfragments)在質量上的差異可鑑別出從分子末端被除去的胺基酸。因此，本發明可以用於生物標誌鑑定的金標準。特異性是指某一物質或某種疾病的專一屬性，它是代表某種物質或某種疾病的特徵。通過某些特徵可以識別某種物質或某種疾病，從而把它和其他物質或疾病區分開來。對專有特徵的識別往往依賴於特殊的檢測方法，例如要了解某種疾病是否存在有特異性抗原就要用有關特異性抗體來檢測。自蛋白質組學研究有新發展以來，這種傳統意義上特異性檢測和界定方法有了很大的突破。如一個蛋白質不同片段變異是不同類型腫瘤的標誌。根據基因到蛋白質表達的複雜過程，一種特異性基因的產物一蛋白質必定有相關多組分蛋白質的表達。通過對這些不同組分的檢測形成一個綜合模式圖(蛋白指紋質譜圖)，將這種圖譜(如某種腫瘤)與其他圖譜(如正常人或其他疾病)相比較，進而識別這種特異蛋白(如抗原或其片段)，從而將正常人與急性心肌梗死病人區分開來(實施例1正常人及急性心肌梗死在血液中蛋白指紋差異的發現及區分)。本發明利用WCX陰離子基質及利用C8/C18疏水基質磁珠對確診為急性心肌梗死患者與正常人血清進行蛋白質對比分析，結果發現血清中質荷比，1263.6tlDa、1350.6ilDa、1449.8土lDa、1465.7土lDa、1777.9土lDa、1865.0土lDa、3778.7土10Da、4649.6土15Da、8149.8土15Da、42kDa中的10個蛋白質相對含量有明顯的差異，並且10個蛋白質所組合成的分組標準診斷急性心肌梗死試劑盒的靈敏度為100%，特異性為100%(實施例1正常人及急性心肌梗死在血液中蛋白指紋差異的發現及區分)a鑑別出生物標誌及其化學結構為變異的補體C3f及纖維蛋白肽A(從N端至C端排列、分子量)C3ffragment(SSKITHRIHWESASLL,1865.O土lDa)、C3ffragment(SKITHRIHWESASLL,1777.9土lDa)、C3ffragment(THRIHWESASLL,1449.8土lDa)、FPAfragment(DSGpGDFLAEGGGVR,1465.7土lDa)、FPAfragment(SGEGDFLAEGGGVR,1350.6土lDa)、FPAfragment(GEGDFLAEGGGVR,1263.6土lDa)、C3alphachainfragment(42kDa)(實施例2急性心肌梗死中血清生物標誌的排序鑑定及實施例3急性心肌梗死血液中42kDa生物標誌分子鑑定)。可用變異的補體C3f、變異的C3alphachain及變異的纖維蛋白肽A生物標記製備抗體及試劑盒。可用變異的補體C3f抗體、變異的C3alphachain抗體及變異的纖維蛋白肽A抗體及質譜聯合精確地檢測急性心肌梗死多種、變異的生物標誌試劑盒。用變異的補體C3f抗體、變異的C3alphachain抗體及變異的纖維蛋白肽A抗體(組)及質譜聯合精確檢測多種變異的急性心肌梗死生物標誌試劑盒的方法準確率為100%，靈敏度為100%,特異性為100%。一種新型檢測急性心肌梗死變異生物標誌的試劑盒和方法的具體操作步驟以下是用本發明提供的一個操作方案及試劑盒實例。1.樣品處理及標準化質控血清製備將生物樣品稀釋在稀釋緩衝溶液中，視需要離心澄清樣品。質譜的標準化質控血清製備定義符合如下標準供血者10人，5男5女，血型為O型；年齡為18-30歲；民族漢。生化指標正常，包括總膽固醇、甘油二酯、空腹血糖、B肝表面抗原、肝功檢査、腎功檢査；無遺傳病家族史；無重大傳染病史。女性不能懷孕，男性為不吸菸者。2.基質與多種抗體結合製備、樣品上樣將質譜的標準化質控血清及樣品點樣在有支持物的基質中的一個位點上。樣品來於血液，體液，分泌物，細胞溶解液，組織溶解物和器官溶解物。支持物可用金屬片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子或S印harosebeads等。基質是用於標記、結合多種抗體的。抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。無限量地增加抗體組來達到無限量地檢測多個或多種生物標誌物或抗原標記(只鬚生物標誌的分子量差異在質譜檢測誤差率內)。將合成的變異的或修飾的生物標誌免疫小鼠，待免疫反應出現後，從外周血中分離B細胞。用ELISA法篩選出效價最高的單抗株，大量製備，並從培養上清中提取所需抗體。此抗體可用於製備檢測變異或修飾生物標誌的所需試劑盒。基質與多種抗體結合製備試劑盒的方法可用任何能與抗體結合的方法及任何能與抗體選擇性或特異性結合的物質，舉例用蛋白A和G(ProteinAandG)標記的S印harosebeads上基質與抗體Fc段結合；用Carbodiimide方法(CarbodiimideMethod)將帶有carboxylate-groups標記的磁性珠上基質與抗體的氨基端(amino-groups)結合(GunnDL,etal.PreparationofsensitiveandstableerythrocytesbythecarbodiimidemethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.JImmunolMethods.1972;1(4):381-389.);用str印tavidin標記的基質與biotin標記的抗體結合用MEPHyperCel標記的陶瓷珠與抗體結合(throughhighcapacityandhighselectivityinteractionandthecooperativeinfluenceofathioethergroup);等等方法。多種抗體標記至液相色譜柱子上的基質可用液相色譜質譜聯用儀(LC-MS)的標準方法去分析。可以將質譜的標準化質控血清用於質譜儀試劑盒的定量方法。3.洗滌用結合緩衝液洗滌。在樣品完全乾燥前將第一份洗滌瀋液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二滌液重複以上步驟。以下可有不同步驟(1)用水徹底洗滌整個陣列點，自然千燥基質及滯留的生物標誌，加O.SnL吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的製備的飽和標準溶液)；(2)或用0.05%1%三氟乙酸徹底洗滌整個陣列點(當用陶瓷珠、磁性珠、多聚體或S印harosebeads為支持物時)，將生物標誌洗脫至質譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然乾燥金屬片，加0.5pL吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸製備的飽和標準溶液)。吸能分子可用Sinapinicacid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamicacid等。3.質譜的定量控制及測試用雷射解吸/離子化飛行時間質譜儀，用氮雷射儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離已洗脫的生物標誌後用液相色譜質譜聯用儀(LC-)標準方法去分析滯留於各位點的生物標誌或蛋白質。串聯四極杆質譜或線性離子阱質譜來鑑定修飾的與變異的的生物標誌及多肽denovo的測序。用計算機分析數據進行數據重疊展示。定量性質譜調控每次測試前，用質譜的標準化質控血清，將標準化質控血淸中用於定量的標準峰4091.1Da或6634.0Da等強度調至50%信號強度的最大值。本發明將蛋白質分成了幾大類，即WCX陰離子、SAX陽離子、C8/C18疏水作用等蛋白。這樣，可用質譜儀直接進行分析。本發明利用WCX陰離子基質及利用C8/C18疏水基質磁珠對確診為急性心肌梗死患者與正常人血清進行蛋白質對比分析，結果發現血清中質荷比，1263.6土lDa、1350.6土lDa、1449.8土lDa、1465.7土lDa、1777.9土lDa、1865.0土lDa、3778.7土10Da、4649.6土15Da、8149.8土15Da、42kDa中的10個蛋白質相對含量有明顯的差異，並且10個蛋白質所組合成的分組標準診斷急性心肌梗死試劑盒的靈敏度為100%,特異性為100%(實施例1正常人及急性心肌梗死在血液中蛋白指紋差異的發現及區分)。鑑別出生物標誌及其化學結構為變異的補體C3f及纖維蛋白肽A(從N端至C端排列、分子量)C3ffragment(SSKITHRIHWESASLL,1865.O土lDa)、C3ffragment(SKIT冊IHWESASLL，1777.9土lDa)、C3ffragment(T冊IHWESASLL，1449.8土lDa)、FPAfragment(DSGEGDFLAEGGGVR,1465.7土lDa)、FPAfragment(SGEGDFLAEGGGVR,1350.6土lDa)、FPAfragment(GEGDFL旭GGGVR,1263.6土lDa)、C3alphachainfragment(42kDa)(實施例2急性心肌梗死中血清生物標誌的排序鑑定及實施例3急性心肌梗死血液中42kDa生物標誌分子鑑定)。可用變異的補體C3f、變異的C3alphachain及變異的纖維蛋白肽A生物標記製備抗體及試劑盒。可用變異的補體C3f抗體、變異的C3alphachain抗^i及變異的纖維蛋白肽A抗體及質譜聯合精確地檢測急性心肌梗死多種、變異的生物標誌試劑盒。用變異的補體C3f抗體、變異的C3alphachain抗體及變異的纖維蛋白肽A抗體(組)及質譜聯合精確檢測多種變異的急性心肌梗死生物標誌試劑盒的方法準確率為100%，靈敏度為100%,特異性為100%。本發明可用於體外細胞和非侵入性的臨床急性心肌梗死病人體外檢測方法，如離體體液的試劑盒用於臨床疾病的檢測方法。本發明中的試劑盒及方法與其他非侵入性的體外檢測方法比較，具有以下的特點(1)準確及精確用多種抗體及質譜聯合精確檢測多種生物標誌方法的一個特點是能夠從複雜的樣品混合物中準確地分辨出分析物。抗體與抗原結合的準確率超過95%。這是ELISA及免疫螢光試劑盒等的基楚。質譜直接分析有很強的精確性，一般誤差率只有0.1Da。因為蛋白質是由氣基酸組成的，而胺基酸的平均質量是己知的，如果知道了抗原或生物標誌的總分子量，那麼抗原的變異(指胺基酸變化)就很容易被推測出來。但ELISA及免疫螢光試劑盒無法知道抗原的變異。所以，用抗體及質譜聯合精確檢測生物標誌方法可提供被分析物(抗原或生物標誌)化學或結構特徵的直接信息。舉例已知纖維蛋白肽A分子的分子量為1536Da,化學結構為16個胺基酸(N端Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端)。纖維蛋白肽A的抗體與質譜儀聯合應用發現分子量為1536Da的纖維蛋白肽A。則100%可確定被分析物是纖維蛋白肽A，即最精確鑑別(金標準)。用纖維蛋白肽A的抗體與質譜儀聯合應用發現被分析物是分子量為1465±1Da變異的纖維蛋白肽A。則化學結構可以(從N端至C端)推測為15個胺基酸N端Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgC端。即抗體及質譜聯合，可省去變異的纖維蛋白肽A的排序鑑定。(2)便於聯合檢測用三種以上抗體組標在基質上與質譜聯合，可同時檢湖出多種(三種以上)的生物標誌及一種或一種以上變異的或修飾的生物標誌。這樣產生了一種可用質譜儀直接進行分析多種(三種以上)的生物標誌及一種或一種以上變異的或修飾的生物標誌的方法(實施例4)。二色免疫螢光法可以同時分析二種生物標誌，但無、法達到三種以上的生物標誌的分析或像抗體與質譜聯合來精確地、高效地確定一種變異的或修飾的被分析物(抗原或生物標誌)。基質可用任何能與抗體選擇性或特異性結合的物質。(3)快捷用本發明提供的多種已知抗體組及質譜聯合精確檢測多種生物標誌方法進行多種疾病檢測時，無需對蛋白質進行測序即可知"變異的或修飾的生物標誌"。不像免疫螢光法試劑盒，一個試劑盒最多可同時標記二種抗體，無法知道"變異的或修飾的生物標誌"。修飾的生物標誌指甲基化、乙醯化、羥基化、磷酸化修飾等的高表達或低表達變化。質譜直接分析有很強的精確性，一般誤差率只有0.1Da。舉例，在肝癌的血清中發現了4302Da帶正電的蛋白質，而在正常人中只有4287Da帶正電的蛋白質。兩種蛋白質分子量差額為15Da，即甲基(-CH3)。用去甲基化酶驗證4302Da的蛋白質為甲基化的4287Da蛋白質，即在去甲基化酶的處理下，4302Da蛋白質轉變為4287Da的蛋白質。修飾蛋白可以用去甲基化酶、去乙醯化酶、去羥基化酶、去磷酸化酶來驗證。甲基化試劑盒對腫癯細胞檢測的應用，可以用於區分正常人樣品與癌症患者群的樣品。本發明提供的一個多種抗體試劑盒方法用於質譜來同時檢測，可不限於三種抗體。從而有助於臨床複雜的檢測，如可用此法進行急性心肌梗死病人檢測試劑盒等。具體實施例方式本發明將結合具體實施例作進一步說明，這些實例僅用於說明R的，而不用於限制本發明範圍。實施例1正常人及急性心肌梗死在血液中蛋白指紋差異的發現及區分(1)實驗方法一、材料1.標本來源急性心肌梗死患者組有100例患者，均經心電圖和心肌酶譜診斷為急性心肌梗死；正常人組有100例正常人。二個組年齡均在45—60歲間，有相似的暴露史。男女比例為本l:l。二組均無影響血清中蛋白質含量的其它相關性疾病。2.試劑尿素、乙腈、三氟乙酸、SPA(Sin即inicacid)均購自Sigma公司，WCX基質磁珠來自賽爾迪公司。二、方法1.樣品的收集全血採集後吸取血清，置於—80'C保存；-80'C冰箱中取出血猜樣品，置冰盒上融解；以IO,000轉/分，4'C離心2分鐘；取上清液。2.樣品的準備每個吸附劑基質支持物點需要血清2.5W,將血清用2倍體積U9緩衝說明書第11/16頁液(9MUrea，2%CHAPS，50mMTris-HCL，pH9.0)稀釋(例如10W血清用20W緩衝液稀釋)。將樣品充分混勻。將30W上述樣品加入370W相應的結合緩衝液，使得血洧的總稀釋倍數達到約40倍。將處理好的血清樣品100W上樣到吸附劑基質上。3.樣品檢測上樣，在WCX基質磁珠陣列點中加入10(Hil處理好的樣品，置振蕩器,400-600轉/分，4。C震蕩1小時。甩出樣品，每孔加入200M的結合緩衝液50mMNaAC,pH4.0-5.0。室溫置振蕩器400-600轉/分，震蕩5分鐘，甩去孔中液體，再次加入結合緩衝液200W，重複操作一次。每孔加入200WHPLC水，立刻甩出。0.5%三氟乙酸徹底洗滌整個WCX磁珠陣列點，將生物標誌洗脫至質譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然乾燥金屬片，加0.5pL吸能分子SINAPINIC酸(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的製備的標準溶液)。4.將上述樣品加入質譜中，就會生成質譜蛋白指紋峰。計算機以每秒lGHz的速度從所獲得的原始數據快速精確的繪製出蛋白質質譜圖。其中縱坐標為蛋白質相對含量，橫坐標為蛋白質質荷比。外部使用多肽分子質量標準來校正質量精確性。(2)實驗結果用統計學方法，分析所得數據的形式是用計算機讀取的條碼格式，蛋白指紋顯示為沿蛋白指紋著線性軸的暗度強度值信號，此強度可以用掃描儀記錄並用分析軟體自動分析對比強弱。通過分析幾千種血清蛋白指紋峰，發現下述蛋白措紋可以用於區分正常人與急性心肌梗死。1.質譜圖分析設定參數分別對所得質譜圖進行分析，蛋白質含量存在統計學顯著性。2.蛋白質的對比100例急性心肌梗死患者與100例正常人血清中蛋白質的組成，結果發現，1263.6土lDa、1350.6土lDa、1449.8土lDa、1465.7土lDa、1777.9土lDa、1865.O土lDa、3778.7土10Da、4649.6土15Da、8149.8土15Da、42kDa蛋白質組成的生物標誌物可將急性心肌梗死患者與正常人準確的分組。經方差分析，蛋白質含量差異有顯著性(/^0.01)。3.預測準確率用統計學分析，結果顯示用這蛋白質組成的生物標誌物進行檢測，發現100/100例急性心肌梗死患者與100/100例正常人被正確分組，準確率為100%(200/200)。4.特異性和敏感度IOO例急性心肌梗死患者用本方法均被診斷為急性心肌梗死患者，IOO例正常人用本方法均被診斷為正常人。靈敏度和特異性分別為100%(100/100),100%(100/100)。(3)結論本研究利用WCX基質磁珠對100例確診為急性心肌梗死患者與100例正常人血淸進行蛋白質對比分析，結果發現血清中質荷比，1263.6土lDa、1350.6土lDa、1449.8土lDa、1465.7土lDa、1777.9土lDa、1865.O土lDa、3778.7土10Da、4649.6土15Da、8149.8j;15Da、42kDa中的10個蛋白質相對含量有明顯的差異，並且10個蛋白質所組合成的分組標準診斷急性心肌梗死的靈敏度為100%(100/100),特異性為100%(100/100)。利用C8及C18疏水基質磁珠的實驗結果與上述WCX陰離子基質磁珠的實驗結果一致。實施例2急性心肌梗死中血清生物標誌的排序鑑定選1263.6土lDa、1350.6土lDa、1449.8土lDa、1465.7土lDa、1777.9土lDa、1865.0土lDa生物標誌用MALDI-Qq-TOF多級質譜(MS/MS)、源後裂解(PSD)及蛋白質梯狀排序法(proteinladdersequencing)進行排序。通過將分子碎成碎片，可生成蛋白質梯度(proteinladders)。然後，用質譜對此梯度進行分析。鑑剮出生物標誌及其化學結構為變異的補體C3f及變異的纖維蛋白肽A(從N端至C端排列)表一、急性心肌梗死中生物標誌蛋白質的排序鑑定tableseeoriginaldocumentpage15查已知cDNA資料庫中的補體C3f分子的分子量為2021.1Da，化學結構為SSKITHRIHWESASLLR;査已知cDNA資料庫中的纖維蛋白肽A分子的分子量為1536.7Da,化學結構為ADSGEGDFLAEGGGVR。實施例3急性心肌梗死血液中42kDa生物標誌分子鑑定用Carbodiimide方法(CarbodiimideMethod)將帶有羧酸基團標記的磁性珠上基質與抗補體蛋白C3alphachain抗體的氨基基團結合(G,DL,etal.Pr印arationofsensitiveandstableerythrocytesbythecaxbodiimidemethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.JImmunolMethods.1972:1(4):381-389.)。將樣品點樣在一個抗補體蛋白C3alphachain抗體基質的位點上。用結合緩衝液洗滌。在樣品完全千燥前將第一份洗漆簿液加到該位點。洗滌洛液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重複以上步驟。用1%三氟乙酸徹底洗滌整個陣列點，將生物標誌洗脫至質譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然T燥金屬片，加0.5Sin叩inicacid吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的製備的標準溶液)。用質譜儀，用氮雷射儀(337mn)和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析各位點的生物標誌或蛋白質。用計算機分析數據進行數據重疊展示。實驗結果用抗補體蛋白C3alphachain抗體基質與質鐠儀聯合應用發現被分析物是分子量與實施例1一致，是已知cDNA資料庫中的血液中補體蛋白C3alphachain分子片斷的分子量(42kDa)。發現下述變異的補體蛋白C3alphachain可以用於區分正常人血清、急性心肌梗死病人的血清表二、發現下述變異的補體蛋白C3alphachain分子片斷tableseeoriginaldocumentpage16IOO例正常人對照組的血清陰性IOO例急性心肌梗死病人的血清陽性實施例4變異的補體C3f、變異的補體蛋白C3alphachain及變異的纖維蛋白肽A生物標記抗體的製備將合成的變異的補體C3f、變異的補體蛋白C3alphactein及纖維蛋白肽A生物標記免疫小鼠，待免疫反應出現後，從外周血中分離B細胞。用溶血噬菌斑分析法選擇並分離出能分泌所需抗體的單個淋巴細胞。將單個細胞擴增至1X10'個以上，用QuickmRNAPurificationKit提取mRNA。以提取的mRNA為模板，合成cDNA鏈。以此cDNA為模板，加入鼠抗體重鏈可變區(V)通用引物，輕鏈可變區(V,.)通用引物，進行聚合酶鏈反應，獲得擴增的Vh基因片段和V,基因片段。將擴增產物在15g/L瓊脂糖凝膠電泳鑑定和分離。用glassmilk回收擴增的VH基因片段和V,.基因片段。與等摩爾嘗試的LimkerPrimerMix混合，進行聚合酶鏈反應，連接Vu和V,.。擴增產物分離純化後，獲得特異性單鏈抗體(ScFV)。此ScFV可用於製備檢測所需DNA片。將此擴增產物兩端加限制性酶切位點，純化定量後，連接到P',載體上。將連接產物轉化感染大腸桿菌TOPIO。經藍白斑篩選及酶切鑑定，篩選出重組質粒。在96孔板形成單克隆抗體。用ELISA法篩選出效價最高的單克隆抗體株，大量製備，並從培養上清中提取所需抗體。此抗體可用於製備檢測所需試劑盒。實施例5用多種抗體及質譜聯合精確地檢測急性心肌粳死多種、變異的生物標誌(1)實驗方法基質與多種抗體結合製備試劑盒、樣品上樣將樣品點樣在有支持物的基質中的一個位點上。支持物用磁性珠。取50^有carboxylate-groups標記的磁性珠加在500^L的試管中。用Carbodiimide方法，將帶有carboxylate-groups標記的磁性珠上基質與多種抗體(補體蛋白C3alphachain抗體、FPA抗體、C3f抗體)的氨基端(amino-gro叩s)結合(GunnDL,etal.PreparationofsensitiveandstableerythrocytesbythecarbodiimidemethodforthedetectionofprimaryandsecondaryIgMandIgGantibody.JIiranunolMethods.1972;1:381-389.)。多種抗體磁珠試劑盒可用於質譜測試了。將質譜的標準化質控血清用於質譜的定量。洗滌用結合緩衝液洗滌。在樣品完全乾燥前將第一份洗滌癩液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重複以上步驟。用1%二氟乙酸徹底洗滌整個陣列點，將生物標誌洗脫至質譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然乾燥金屬片，加0.5nLSi,inicacid吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸製備的飽和標準溶液)。質譜的定量控制及精確檢測用雷射解吸/離子化飛行時間質譜儀，用氮雷射儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列力分析試劑盒各位點的生物標誌或蛋白質。用計算機分析數據進行數據重疊展示。定量性質譜調控每次測試前，用質譜的標準化質控血淸，將標準化質控血淸中用於定量的標準峰4091.IDa或6634.0Da強度調至50%信號強度的最大值。(2)實驗結果分析發現用多種抗體及質譜聯合試劑盒可將對照組與急性心肌梗死組準確的分組。預測準確率用統計學分析及雙盲分析中，結果顯示用抗體組(補體蛋白C3alphachain抗體、FPA抗體、C3f抗體)及質譜聯合精確檢測多種變異的急性心肌梗死生物標誌的方法準確率為100%，靈敏度為100%,特異性為100%(表二)。表二、用抗體組及質譜聯合精確地檢測多種、變異的急性心肌梗死生物標誌tableseeoriginaldocumentpage18試劑加至血漿的實驗結果與血清一致。(3)結論本發明利用多種抗體及質譜聯合對對照組與急性心肌梗死組進行蛋白質對比分析，結果發現分組檢測的靈敏度為100%,特異性為100%。本發明用抗體組及質譜聯合，可同時精確地檢測出多種、變異的急性心肌梗死的生物標誌群。本發明涉及一種通過被抗體組吸附表面基質上捕獲的生物標誌，用標準化質控血清控制下的定量性質譜分析來檢測。在一個抗體組基質上同時據獲多個生物標誌，並對捕獲的變異的或修飾的生物標誌進行質譜精確分析。可以同時檢灘多個生物標誌群。本發明的方法可用於檢測已經脫離人體的體液中的生物標誌組合。這些生物標誌組合可以用於同時鑑別正常人及多種病人離體體液的試劑盒的檢測方法。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用參考，就如飼每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。權利要求1.一種用含有抗體組的基質去捕獲急性心肌梗死生物標誌的試劑盒製備和方法，其特徵是採用質譜法對樣品中已被抗體組捕獲的生物標誌進行精確地鑑別、檢測的方法。該方法通過以下步驟實現(1)樣品處理及質譜標準化質控血清製備；(2)基質與多種抗體結合試劑盒製備、樣品上樣；(3)洗滌；(4)質譜的定量控制及質譜檢測；其中所述步驟(1)將生物樣品稀釋在稀釋緩衝溶液中。用O型血，男女相等，混合製備質譜的標準化質控血清；所述步驟(2)將質譜的標準化質控血清及樣品點樣在有支持物的基質中的一個位點上。支持物可用金屬片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子或Sepharosebeads等。基質是任何能與抗體選擇性或特異性結合的物質；所述步驟(3)用結合緩衝液洗滌。在樣品完全乾燥前將第一份洗滌溶液加到該位點。洗滌溶液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重複以上步驟。用水徹底洗滌整個陣列點，自然乾燥基質及滯留的生物標誌；或用三氟乙酸徹底洗滌整個陣列點(當用陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子或Sepharosebeads為支持物時)，將生物標誌洗脫至質譜專用金屬片或位點上。所述步驟(4)加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的製備的飽和標準溶液)用質譜儀去分析滯留與各位點的生物標誌或用電噴霧電離已洗脫的生物標誌後用質譜儀去分析。本發明用WCX陰離子基質磁珠及用C8/C18疏水基質磁珠對確診為急性心肌梗死患者與正常人血清進行蛋白質對比分析，用計算機分析數據結果發現血清中質荷比，1263.6±1Da、1350.6±1Da、1449.8±1Da、1465.7±1Da、1777.9±1Da、1865.0±1Da、3778.7±10Da、4649.6±15Da、8149.8±15Da、42kDa中的10個蛋白質相對含量有明顯的差異，並且10個蛋白質所組合成的分組標準檢測急性心肌梗死試劑盒的靈敏度為100％，特異性為100％。2.權利要求1所述的基質是用於捕獲多種抗體的，抗體是用於捕獲已知的急性心肌梗死變異生物標誌。所述的生物標誌的分析方法，可以檢測多個的、變異的急性心肌梗死生物標誌群。3.權利要求1所述的急性心肌梗死生物標誌及其化學結構為變異的補體C3f、C3alpha鏈及纖維蛋白肽A(從N端至C端排列胺基酸、分子量)C3ffragment(SSKITHRIHWESASLL,1865.0土lDa)、C3ffragment(SKIT冊IHWESASLL,1777.9土lDa)、C3ffragment(THRIHWESASLL,1449.8土lDa)、FPAfragment(DSGEGDFLAEGGGVR，1465.7土lDa)、FPAfragment(SGEGDFLAEGGGVR,1350.6土lDa)、FPAfragment(GEGDFLAEGGGVR,1263.6土lDa)、C3alphachainfragment(42kDa)。4.權利要求1所述的生物標誌的分析方法，所捕獲的急性心肌梗死生物標誌群來源於已經脫離人體或動物體的血液。5.用權利要求2的方法，可以同時檢測出三種以上急性心肌梗死變異的生物標誌。6.權利要求1中基質是任何能與抗體結合的物質用蛋白A和G標記的基質，用carboxylate-groups標記的磁性珠上基質，用str印tavidin標記的基質，或用NEPHyperCel標記的陶瓷珠上基質等。7.權利要求1中基質的支持物可以是金屬片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、多聚體、液相色譜柱子或S印harosebeads。8.—種權利要求3所述的急性心肌梗死變異生物標誌的用途，其特徵在於，用於製備檢測急性心肌梗死變異生物標誌的抗體及試劑盒。9.一種權利要求8所述的檢測急性心肌梗死變異生,志的試劑盒，其特徵在於，它包括一容器以及裝於容器中的權利要求8所述的檢測急性心肌梗死變異生物標誌的抗體(組)。10.如權利要求9所述的試劑盒，其特徵於，所述的抗體(組)為單克隆抗體(組)或多克隆抗體(組)。全文摘要本發明涉及一種通過被抗體組吸附表面基質上捕獲的生物標誌，用標準化質控血清控制下的定量性質譜分析來檢測。在一個抗體組基質上同時捕獲多個生物標誌，並對捕獲的變異的生物標誌進行質譜精確分析。可以同時檢測多個生物標誌群。本發明的方法可用於檢測已經脫離人體的體液中的生物標誌組合。這些生物標誌組合可以用於同時鑑別正常人及急性心肌梗死病人離體體液的試劑盒的檢測方法。本發明檢測急性心肌梗死試劑盒的靈敏度為100％，特異性為100％。本方法精確、方便且快捷。文檔編號G01N33/53GK101165488SQ20061014051公開日2008年4月23日申請日期2006年10月16日優先權日2006年10月16日發明者洋許申請人:洋許