通過發酵產生靶物質的方法

2023-09-15 12:03:45 1

專利名稱：通過發酵產生靶物質的方法
技術領域：
本發明涉及一種用於發酵工業的技術，更準確地講是一種通過利用一種微生物發酵有效產生一種例如L-胺基酸的靶物質的方法。
背景技術：
細菌細胞一直在修飾其代謝途徑和呼吸途徑等等來適應不同的環境。在能量代謝中，Arc(有氧呼吸控制)以及Fnr(延胡索酸鹽硝酸還原作用)都是已知為起到很重要作用的控制系統。其包括普遍存在於大腸桿菌以及其他類似的種群中的球形調控蛋白。前者為位於大腸桿菌染色體上的0分位點的arcA基因所編碼，後者為位於大腸桿菌染色體上的29分位點的fnr基因所編碼，且二者同時在一個厭氧條件下通過控制許多因子來使細胞適應一個環境。更進一步講，其被解釋為Arc A蛋白和Fnr蛋白同時為轉錄因子，並且其通過直接連接至靶基因的控制區域來正向或反向地控制作在厭氧環境下一個靶基因在大腸桿菌染色體上的表達(S.Iuchi et al.，Cell，66 5-7(1991))。
最近，編碼來源於大腸桿菌的球形調控蛋白例如arcA蛋白及Fnr蛋白的基因被破裂後通過使用DNA微陣列技術被收集至一個資料庫且向公眾公開(http//www.genome.ad.jp/dbget-bin/get_htext？Exp_DB+-n+Bget-bin/get_htext？Exp_DB+-n+B)。
迄今為止，已知ArcA蛋白反向調節三羧酸循環中基因的表達(S.Iuchi et al.，Cell，66，5-7(1991))，而且三羧酸循環中基因的表達在資料庫中的arcA破裂株中是增加的。另一方面，已知Fnr蛋白正向調控在厭氧環境中起到作用的呼吸途徑中的基因的表達。
至於球形因子破裂株中的表達情況，dam-破裂株被提到其中TCA循環中的基因表達如同arcA破裂株一樣是增加的(H.Mori，Nara Institute of science andtechnology，oral announcement at the symposium」Gene biotechnology of GenomeAge」，2001，organized by Japan Bioindustry Associateon，Resource BiotransformationStudy Group)。
Dam蛋白是涉及到胞內限制修飾系統修飾因子的一個甲基化酶，且其由存在於大腸桿菌染色體上的76分位點處的dam基因所編碼(Proc，Natl，Acad，Sci.USA.，87(23)，9454-9458(1990))。
至今尚未報導有關通過球形因子例如基因arcA，fnr以及dam的表達控制來提高物質的產率。

發明內容
本發明的一個目的就是通過使用一個γ-蛋白細菌(γ-proteobacterium)例如大腸桿菌的發酵來提高一個有用物質的產率。
本發明的發明者進行了不同的研究以實現上述目的，他們發現由γ-蛋白細菌生產的物質可以通過修飾一個編碼普遍存在於一個γ-蛋白細菌中的調控蛋白的基因來提高產率。那就是，他們發現能夠產生靶物質的能力可以由破裂一個存在於γ-蛋白細菌中的arcA基因來提高而由此來完成本發明。
那就是，本發明提供了下述技術方案(1)能夠產生靶物質且被修飾以致於其中的ArcA蛋白不能正常發揮功能的一種γ-蛋白細菌。
(2)如(1)所述的γ-蛋白細菌，其中的能正常發揮功能的ArcA蛋白是一個如下述(A)或(B)進行限定的蛋白(A)一個具有如SEQ ID NO32所述胺基酸序列的蛋白；(B)一個包括替代，缺失，插入或增加一個或多個胺基酸且其具有與正常情況下蛋白發揮正常的功能相比在γ-蛋白細菌中蛋白不能正常發揮功能時靶物質生產能力的提高而且具有如SEQ ID NO32所述胺基酸序列的蛋白。
(3)如(1)所述的γ-蛋白細菌，其中的能正常發揮功能的ArcA蛋白是一個具有與SEQ ID NO32所述胺基酸序列有70％或更多同源性的蛋白且其具有與正常情況下蛋白發揮正常的功能相比在γ-蛋白細菌中蛋白不能正常發揮功能時靶物質生產能力的提高。
(4)如(1)所述的γ-蛋白細菌，其中的能正常發揮功能的ArcA蛋白是一個具有SEQ ID NO32所述胺基酸序列包括替代，缺失，插入或增加2-20個胺基酸且其具有與正常情況下蛋白發揮正常的功能相比在γ-蛋白細菌中蛋白不能正常發揮功能時靶物質生產能力的提高的蛋白。
(5)如(1)～(4)之一所述的γ-蛋白細菌，其中的不能正常發揮功能的ArcA蛋白是通過在一個染色體上破裂arcA基因的方法來實現的。
(6)如(5)所述的γ-蛋白細菌，其中的arcA基因是由下述(a)或(b)定義的DNA(a)含有SEQ ID NO31中的101-817核苷的核苷酸序列的DNA；(b)與SEQ ID NO31中的101-817核苷的核苷酸序列雜交的DNA或在嚴格條件下能夠從所述核苷酸序列中產生且編碼一個與正常情況下蛋白發揮正常的功能相比不能正常發揮功能時靶物質生產能力的提高的蛋白的探針。
(7)如(1)～(6)之一所述的γ-蛋白細菌，其中的細菌屬於埃希氏菌屬。
(8)如(1)～(7)之一所述的γ-蛋白細菌，其中的靶物質是一種L-胺基酸。
(9)如(8)所述的γ-蛋白細菌，其中的L-胺基酸選自L-賴氨酸，L-穀氨酸以及L-精氨酸。
(10)一種產生靶物質的方法，其包括在培養基中培養如(1)～(9)之一所述的γ-蛋白細菌以在培養基或細胞中產生及積累靶物質且從所述的培養基和細胞中收集靶物質。
按照本發明，當一個有用物質例如L-胺基酸通過γ-蛋白細菌產生時，其生產效率可以被提高。


圖1顯示的是在WC196，WC196ΔarcA，WC196Δdam以及WC196Δfnr中的積累模式。
具體實施例方式
下面，本發明將詳細描述。
(1)本發明所述的γ-蛋白細菌用於本發明的γ-蛋白細菌並不特別限制，只要它屬於γ-蛋白細菌例如埃希氏菌屬，腸桿菌屬，泛菌屬，克雷伯氏菌屬，沙雷氏菌屬，歐文氏菌屬，沙門氏菌屬，摩根氏菌屬或其類似屬且具有產生靶物質的能力即可。詳細說，按照NCBI(生物工程學國家信息中心)分類學其被歸於γ-蛋白細菌。
(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg？mode＝Treeid＝12361v1＝3keep＝1srchmode＝1unlock)。
屬於埃希氏菌屬的細菌例子包括大腸桿菌等，屬於腸桿菌屬的細菌的例子包括成團腸桿菌，產氣腸桿菌等等。
成團腸桿菌的一些種最近重新劃歸為成團泛菌，菠蘿泛菌，斯氏泛菌成團亞種或基於16S rRNA等的核苷序列的類似物。在本發明中，或者屬於腸桿菌或者屬於泛菌屬的細菌因此劃分為γ-蛋白細菌且含有arcA基因。
當通過基因工程技術培育大腸桿菌時，可以使用到大腸桿菌K12株及其衍生物。更進一步，當使用基因工程技術培育菠蘿泛菌時，菠蘿泛菌株AJ13355(FERMBP-6614)，AJ13356(FERMBP-6615)以及AJ13601(FERM BP-7207)以及其衍生物可以被用到。儘管上述菌株被分離時被鑑別為成團腸桿菌，這些菌株基於如上所述的16S rRNA等的核苷序列分析重新被劃分為菠蘿泛菌。
本發明所述的γ-蛋白細菌可以是上述任一細菌，且是一個具有可以產生靶物質能力的細菌。「產生靶物質能力」意指可以在細胞或培養基中產生或累積靶物質的能力，其在這樣一個程度上即當本發明的細菌被培養在培養基中時，靶物質可以從細胞或培養基中收集。按照本發明所要產生的靶物質並不特別限制，只要其是一個可被γ-蛋白細菌產生且通過三羧酸循環產生或者通過底物合成的物質。具體的例子包括，傳統上可被γ-蛋白細菌產生的物質，例如，不同的胺基酸例如L-賴氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸，L-穀氨酸及L-穀氨醯胺及L-精氨酸，有機酸例如L-高絲氨酸及琥珀酸等等。更進一步，本發明還能應用於尚未應用γ-蛋白細菌工業上生產的物質，其可以通過TCA循環合成的物質作為底物來合成。
作為生產L-賴氨酸的γ-蛋白細菌其可以作為一個舉例的突變株其具有對L-賴氨酸類似物的抗性。該L-賴氨酸類似物是一個底物其可以抑制L胺基酸生產菌株的生長，但是當L賴氨酸共存於一個培養基中時這種抑制可以被全部或部分取消。L-賴氨酸類似物的例子包括溶菌素，賴氨酸羥氨基鹽，S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)，γ-甲基賴氨酸，α-氯己內醯胺等等。具有對這些賴氨酸類似物抗性的突變株可以通過將γ-蛋白細菌經過一個傳統的人工基因誘變處理而得到。用於產生L賴氨酸的細菌株的具體例子包括大腸桿菌AJ11442(FERM BP-1543，NRRL B-12185；參照日本專利公開的56-18596以及美國專利號4346170以及大腸桿菌VL611。在這些微生物中，通過L賴氨酸的天冬氨酸激酶的反饋抑制已被減弱。
除了上面所述的以外，還有被提到的例如隨後所述的L-蘇氨酸產生菌，因為L賴氨酸對天冬氨酸激酶的抑制作用其一般在L蘇氨酸產生菌中被刪除。
在隨後所述的實施例中，WC196菌株被用作大腸桿菌的L賴氨酸產生菌。該細菌菌株通過給予對來源於大腸桿菌K-12的W3110株的AEC抗性來孵育。該菌株被命名為大腸桿菌AJ13069，且於1994年12月6日保存於國立生物科學及人類科技研究所，科技工業代理機構且收到一個保藏號FERM P-14690(現在，該獨立的管理公司，國際專利生物儲藏，國立高級工業科技研究所，郵編305-8566，CHUO DAI-6，1-1HIGASHI 1-CHOME，TSUKUBA-SHI，IBARAKI-KEN，日本)。然後按照布達佩斯條約於1995年9月29日轉送至國際保藏且收到一個保藏號FERM BP-5252(參照國際專利
發明者石川有紀子, 今泉明, 松井和彥, 児島宏之, 之, 彥 申請人:味之素株式會社