大豆疫黴菌接種大豆的一種方法

2023-09-15 11:47:35 1

專利名稱：：大豆疫黴菌接種大豆的一種方法
技術領域：
：本發明涉及大豆疫黴菌接種大豆的一種方法，特別涉及一種遊動孢子根部接種法。
背景技術：
：大豆疫黴根腐病(屍/z/Z^D力z^ararootrot)是由大豆疫黴菌(屍4^op力t/zora^JaeKaufmann&Gerdemann)侵染引起的，是危害極其嚴重的、最具毀滅性的大豆病害之一，在環境條件有利於病害發生的情況下可導致大豆絕產。大豆抗病育種是防治大豆疫黴根腐病的最直接、最有效的途徑。自20世紀90年代中期以來，中國開展了大規模的抗大豆疫黴根腐病種質資源篩選。抗源篩選的基本方法是採用Kaufmann和Gerdemann提出的下胚軸傷口接種方法。下胚軸傷口接種法作為一種國際通用的接種方法雖然比較成熟，但也有其不足該方法對菌塊大小、菌量多少及菌齡均很難控制，比實際田間發病的接菌量一般要大很多，這樣的接種量壓力過大，一般中抗或低抗品種可能會被鑑定為感病；另外，該方法所鑑定的抗病性主要是抗擴展，對於抗侵入的品種鑑定不準確，因而會減少篩選到的抗源數量，尤其對水平抗病品種的篩選是非常不利的，而且該方法在操作過程中容易因切口過大而導致植株死亡，會導致誤篩；由於是苗期接種，每個處理至少需要10株，3次重複即30株，需要盆栽條件，佔用空間較大，所需時間長，工作量較大；大豆疫黴根腐病是檢疫性病害，實驗材料量大，處理起來費工費時，風險性大。
發明內容本發明的目的是提供一種大豆疫黴菌接種大豆的方法。本發明所提供的一種大豆疫黴菌接種大豆的方法，是用大豆疫黴菌的遊動孢子懸浮液接種胚根露出種皮的大豆苗。所述方法具體可為將所述大豆苗浸入所述孢子懸浮液中，然後再進行共培養。其中，為保證接種效率，所述大豆苗的胚根長應至少為2cm。所述大豆苗的胚根浸入所述孢子懸浮液至少lcm。所述孢子懸浮液的用量可以大於等於250個孢子/1個大豆苗。所述共培養的時間可為5-7天。所述共培養的溫度可為22"C-24。C，優選為22。C。所述共培養的光強可為250-290Wno1m—2s—、優選為270Mmo1m—2s—'。上述任一方法在抗源篩選或病原菌毒力測定中的應用。本發明模擬田間自然發病的狀態(自然條件下大豆疫黴菌遊動孢子侵染大豆根部)提供了一種遊動孢子根部接種方法，該方法能使大豆的下胚軸及根部都會接觸到遊動孢子，遊動孢子既可從根部侵入也可從下胚軸侵入，這正與田間的侵入方式比較接近；與下胚軸傷口接種法相比，遊動孢子根部接種法可以嚴格定量接種，避免了接種量過大而導致原本抗病的品種表現為感病性狀，使其在抗源篩選的應用中更有效準確；同時本發明方法在實際操作中，具有佔用空間小、所需的勞動量小、實驗周期短、後期實驗材料處理簡單的優點。本發明的方法簡便易行，可以短時間在實驗室中進行大批量抗性資源的鑑定。具體實施方式實施例1、遊動孢子根部接種法的實驗步驟及接種量的確定本實施例用大豆疫黴菌1號生理小種(許修宏，呂慧穎，曲娟娟，楊慶凱.大豆疫黴根腐病菌生理小種鑑定及毒性分析，植物保護學報，2003，30(2):125-128)為實驗菌株，用綏農10(抗病品種)和sloan(感病品種)作為實驗大豆品種。具體操作如下(1)大豆苗的準備將sloan大豆種子保溼催芽2-3天至其胚根長2cm左右時，選擇胚根長一致的幼苗，將其分裝到含有等量滅菌自來水的安瓿瓶(容積10ml)中，將下胚軸lcm及根全部浸在無菌水中，子葉留在瓶外，4株/瓶，以保證生長中有足夠的空間，將其置於光照培養箱內，在22'C、270Wnol'm—、s—'光強的條件下培養備用。綏農10的大豆種子也按照上述方法進行培養，得到綏農10的大豆苗。(2)遊動孢子的製備及計數將大豆疫黴菌1號生理小種接種於胡蘿蔔瓊脂平板上，活化培養3-5天；將數塊大豆疫黴菌菌碟放入無菌的空滅菌培養皿中，倒入滅菌自來水直至剛剛沒過菌碟表面，每隔6小時換1次滅菌自來水，培養24-48小時，至產生大量孢子囊並釋放出遊動孢子；用雙層紗布將大豆疫黴菌蝶過濾掉，保留濾液，即得到大豆疫黴菌l號生理小種的遊動孢子懸浮液。用微量加樣器吸取上述獲得的遊動孢子懸浮液在乾淨載玻片上拖成一條細長的帶，在10X10倍顯微鏡視野下計算遊動孢子的總數，重複取樣5次，檢測後並稀釋懸浮液中遊動孢子的濃度，使大豆疫黴菌1號生理小種的遊動孢子懸浮液的濃度為1000個孢子/ml懸浮液。(3)遊動孢子灌根接種用移液器吸取步驟(2)得到的遊動孢子懸浮液，分別接種到步驟(1)中裝有胚根露出種皮的大豆苗的10ml安瓿瓶中，每個瓶中4株大豆苗，每個大豆品種分別按10個遊動孢子/瓶(即接種濃度為2.5個孢子/1株大豆苗)、100個遊動孢子/瓶(即接種濃度為25個孢子/l株大豆苗)、1000個遊動孢子/瓶(即接種濃度為250個孢子/1株大豆苗)、3000個遊動孢子/瓶(即接種濃度為750個孢子/1株大豆苗)、10000個遊動孢子/瓶(即接種濃度為2500個孢子/l株大豆苗)的接種濃度進行接種。接種完畢後，將安瓿瓶放至光照培養箱內，在22°C、270Mmolm—2s—1光強的條件下培養5-7天。以未接種任何菌的綏農10和sloan大豆種子在相同條件下培養相同時間作為對照。(4)鑑定是否接種上大豆疫黴菌通過抗性鑑定的方法來鑑定是否接種上大豆疫黴菌。接種後7天觀察實驗結果，與空白對照相比植株根系無變化的為沒接上菌的即抗病的，植株同時出現植株根尖變褐、鬚根縮短和鬚根數量減少的均為已經被接上菌的即感病的。實驗設3次重複，結果如表l所示。表l、疫黴菌遊動孢子不同濃度接種大豆的抗性表現tableseeoriginaldocumentpage5—無症狀；+根尖輕微變褐，鬚根不變短、數量不減少；++根尖變褐嚴重，鬚根變短、數量減少嚴重實驗結果表明，對於感病品種，用100個遊動孢子/瓶的接種濃度接種即可以表現感病症狀，當接種濃度為1000個孢子/瓶(即為250個孢子/1株大豆苗)時接種症狀最為明顯；對於抗病品種，用10000個遊動孢子/瓶的接種濃度接種也未表現症狀。所以實際應用中，可以按250個孢子/l株大豆苗的濃度作為標準。採用該接種方法接種，可以使瓶內所有植株症狀表現一致，避免了用下胚軸傷口接種法接種時經常出現的中間型問題(即有些植株發病，而另一些植株不發病，很難判定菌株的毒性和寄主的抗病性)，更有利於接種後的調查。實施例2、遊動孢子根部接種法在抗源篩選中的應用本實施例所用的菌株如表2所示(李瑩，楊明秀，文景芝，大豆疫黴菌子1代單遊動孢株群體毒力變異，中國油料作物學報，2007(4):460-465)。本實施例所用的大豆品種為9個國際通用的大豆疫黴菌鑑別寄主和11個生產上常用品種，品種目錄見表3。表2、大豆疫黴菌生理小種及其對應的毒性公式(李瑩，2007)tableseeoriginaldocumentpage6實驗方法如下:一、遊動孢子根部接種法用表2中除1號生理小種外其餘各生理小種分別感染表3中所示的20個品種的大豆苗，其中，每個菌株感染每個品種的大豆苗的實驗方法，除了接種濃度均為250個孢子/1個大豆苗外，其餘方法均與實施例1中所述一致。分別以未接種任何菌的同一品種的大豆苗在相同條件下培養相同時間作為對昭。用遊動孢子根部接種法，進行6個生理小種對20個品種的實驗過程中，一共至少佔用lm2的空間。準備大豆苗3-4天，製備遊動孢子懸浮液(包括菌培養)4-7天，進行孢子接種時，準備時間約4小時，接種20個大豆品種對6個生理小種的操作可在3小時內完成。大豆疫黴根腐病是檢疫性病害，試驗後的材料均需要滅菌處理，1680株大豆苗用1個18L的滅菌鍋1次滅菌，18個培養皿和420個安瓿瓶用200L乾熱滅菌器l次滅菌。二、下胚軸傷口接種法同樣，用表2中除1號生理小種外其餘各生理小種分別感染表3中所示的20個品種的大豆苗，下面以2號生理小種接種sloan大豆苗為例，詳細敘述下胚軸傷口接種法的實驗方法，其餘各菌株分別接種各品種大豆苗的方法都與此相同。(1)將大豆品種sloan的種子置於培養缽栽培到土壤或蛭石中，約10-12天後大豆植株對生真葉展開。(2)將菌株2號生理小種接種於胡蘿蔔瓊脂平板上，活化培養4-7天；(3)當大豆植株對生真葉展開後，用消毒後的刀片在大豆子葉節下約lcm處劃一傷口，傷口深度不超過大豆莖粗的三分之一，取擴繁後的帶有培養基的病原菌菌絲體(邊長3mm的方塊)嵌入傷口中；接種後，在大豆苗的上部罩上塑料薄膜，向膜內澆水，保持膜內相對溼度在90%以上，在22"、270Wnol*m—2*s—'光強的條件下培養。以未接種任何菌的sloan大豆種子在相同條件下培養相同時間作為對照。(4)鑑定是否接種上大豆疫黴菌接種後，感病植株很快發生萎蔫，植株從接種部位折斷，全株死亡，抗病植株僅在下胚軸傷口處發生局部變褐，植株繼續生長。死苗率》70%記為感病(S)，死苗率《30%記為抗病(R)，死苗率介於30%-70%之間記為中間類型(I)。用下胚軸傷口接種法，進行6個菌種對20個品種的實驗過程中，一共至少佔用10m2的空間。準備植株10-12天，培養菌需4-7天，進行菌種小塊分割時，準備時間約0.5小時，接種20個大豆品種對6個生理小種的操作可在20小時內完成。大豆疫黴根腐病是檢疫性病害，試驗後的材料均需要滅菌處理，將本實驗的18個培養皿、140個培養缽、1680株大豆苗、土壤或蛭石等至少分15次放入18L的滅菌鍋可以處理完畢。表3、20個大豆品種(系)資源對疫黴根腐病抗性鑑定結果菌株37412品種121212121212吉62RRSSSSsSsSSS合豐49SRsRsRsssRsS綏農21RRRRsRsssSRR綏農11RRRRsRssssSR綏農10RRRRsSssssRR綏農14RRSRsSssssSR合豐25SSsSsssssssS小6sRsRsssRsRss抗線4sRsSsssRIRss合豐43ISRRsssSssRR吉67sRsSsssssRsSP丄103RRRRRRRRRRRRtableseeoriginaldocumentpage8注l為下胚軸傷口接種法；2為遊動孢子根部接種法；S為感病；R為抗病；I為中間型實驗設三次重複，結果如表3所示。結果表明，兩種接種方法在絕大多數品種資源上抗/感表現一致，少數抗/感鑑定結果相反，在鑑定結果相反的情況下，都是下胚軸傷口接種法鑑定為感病而遊動孢子根部接種法為抗病，與下胚軸傷口接種方法相比，本發明的遊動孢子根部接種法鑑定出的抗源的數量多了近20%，是下胚軸傷口接種時人為製造的傷口使得原本具有抗侵入能力的品種被淘汰了，導致其在實際應用中效率明顯降低。以上結果進一步表明，在用遊動孢子根部接種法進行20個大豆品種對6個生理小種的抗源篩選時，lm2的空間就可以；在安瓿瓶中加入約9ml滅菌的自來水，然後選擇生長一致的幼苗，4株/瓶，擺好不同處理的安瓿瓶，這些準備操作可以在4h內完成，將培養好的遊動孢子，用紗布過濾，後在顯微鏡下確定孢子懸浮液的濃度和接種量，接種操作可在3h內完成，從準備種子到完成鑑定一般15d就可以完成，比下胚軸傷口接種法節省l周的時間，如多批接種會更節省時間；材料滅菌處理時，大豆植株用1個18L的滅菌鍋1次就可以處理完，培養皿、接種的安瓿瓶用200L乾熱滅菌器l次就可以處理完，下次可直接使用；在用下胚軸接種法進行20個大豆品種對6個生理小種的抗源篩選時，至少要用IOm2;需要將生長不一致的幼苗剔除，做好處理標記，然後用手術刀進行下胚軸切傷，將菌塊接種於傷口處，用脫脂棉蘸滅菌的無菌水夾在傷口處保溼，最後將每個處理的植株用塑料布保溼48h，這些操作完成最少也要20h左右，從準備種子到完成鑑定一般22d就可以完成；材料滅菌處理時，試驗用到的土壤或蛭石、苗和培養缽等最少也要處理十幾鍋。實施例3、用遊動孢子根部接種方法篩選抗源本實施例用的32個大豆品種為生產上常用品種，用表2中除1號生理小種外其餘各生理小種分別進行試驗。用表2中除1號生理小種外其餘各生理小種分別感染表4中所示的32個品種的大豆苗，其中，每個菌株感染每個品種的大豆苗的實驗方法，除了接種濃度均為250個孢子/1個大豆苗外，其餘方法均與實施例1中所述一致。實驗設3次重複，結果如表4所示。表4、32份大豆品種資源抗疫黴根腐病鑑定結果tableseeoriginaldocumentpage9長龍5號RRSSSS吉育67RRSSSS吉育62_RS_§_§_§_§_注S為感病；R為抗病實驗結果表明，大豆品種中抗疫黴根腐病資源十分豐富，對不同生理小種均能找到相應的抗源。同時也表明，疫黴菌的不同菌株毒性差異較大，如供試的32個大豆品種中，對所有6種供試毒性型均具有抗性的品種有5個，佔15.6%，均感病的有2個，佔6.3%。在所有192個互作中，親和性互作為98個，佔51%，非親和性互作有94個，佔49%，說明大豆抗疫黴根腐病資源十分豐富，存在兼抗多個生理小種的資源。其中，黑農39、合豐51、合豐41等品種抗性表現好，克農02-15表現較差。該方法簡便易行，可以短時間在實驗室中進行大批量抗性資源的鑑定。權利要求1.一種大豆疫黴菌接種大豆的方法，是用大豆疫黴菌的孢子懸浮液接種胚根露出種皮的大豆苗。2、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述方法是將所述大豆苗浸入所述孢子懸浮液中，進行共培養。3、根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述大豆苗的胚根長至少為2cm。4、根據權利要求l、2或3所述的方法，其特徵在於所述方法中是將所述大豆苗的胚根浸入所述孢子懸浮液至少lcm。5、根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特徵在於所述孢子懸浮液的用量大於等於250個孢子/1個大豆苗。6、根據權利要求2-5中任一所述的方法，其特徵在於所述共培養的時間為5-7天。7、根據權利要求2-6中任一所述的方法，其特徵在於所述共培養的溫度為22-24°C，優選為22t:。8、根據權利要求2-7中任一所述的方法，其特徵在於所述共培養的光強為250-290Mmo1m—2s—、優選為270Wno1m—2s—、9、權利要求1-8中任一所述方法在抗源篩選或病原菌毒力測定中的應用。全文摘要本發明公開了一種大豆疫黴菌接種大豆的方法。本發明所提供的大豆疫黴菌接種大豆苗的方法是用大豆疫黴菌的孢子懸浮液接種胚根露出種皮的大豆苗。本發明的遊動孢子根部接種法可以嚴格定量接種，避免了接種量過大而導致原本抗病的品種表現為感病性狀，使其在抗源篩選的應用中更有效準確；同時本發明方法在實際操作中，具有佔用空間小、所需的勞動量小、實驗周期短、後期實驗材料處理簡單的優點。因此，本發明方法適合推廣應用。文檔編號A01H1/06GK101268744SQ20081010595公開日2008年9月24日申請日期2008年5月6日優先權日2008年5月6日發明者文景芝,李永剛,楊明秀申請人:東北農業大學