一種大黃魚hepcidin抗菌肽及其製備方法
2023-09-15 00:39:20 2
專利名稱：一種大黃魚hepcidin抗菌肽及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域中的魚類基因工程，特別涉及大黃魚h印cidin抗菌肽 及其製備方法。
背景技術：
抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)廣泛存在於動植物中，是動植物機體免 疫反應中的重要角色。H印cidin是一個在C端保守位點上富含半胱氨酸殘基的抗菌肽家 族。2000 年，Krause A 等(1. Krause A, Neitz S, Magert HJ, Schulz A, Forssmann WG, Knappe PS, Adermann K. LEAP-1, a novel highly disulfide-bonded human peptide, exhibits antimicrobial activity [J] FEBS Lett.，2000，480 :147_150)從人類血菜中首 次發現了 LEAP-1 (後稱為hepcidin)。H印cidin抗菌肽的C末端保留了半胱氨酸形成的富 集區，圓二色(circular dichroism, CD)光譜學特性研究證實，在磷酸緩衝液中h印cidin 抗菌肽具有兩個穩定的0摺疊結構，這一結構與抗菌多肽的胱氨酸(cystin-eknot)結構 非常相似。魚類抗菌肽是魚類先天免疫的重要組成部分，使用抗菌肽作為藥物用於海水養 殖魚類的疾病防治，具有廣闊的應用前景。大黃魚 h印cidin 抗菌肽基因(Genebank accession no :EF156401)由 258 個鹼基 組成，編碼85個胺基酸。同其他已經發現的h印cidin抗菌肽結構一樣，大黃魚h印cidin抗 菌肽包括內質網靶向的位於N端的信號肽(前24個胺基酸)，前導肽(35個胺基酸)和位 於C端的成熟肽(26個胺基酸)。其中前導肽和成熟肽共同構成了前體pro-h印cidin (2. Ke-Jian Wang，Jing-Jing Cai，Ling Cai，Hai-Dong Qu，Ming Yang，Min Zhang，Cloning and expression of a hepcidin gene from a marine fish(Pseudosciaena crocea) and the antimicrobial activity of its synthetic peptide， Peptides， Volume 30， Issue 4，April 2009，638-646)成熟|太部分含有 8 個半胱氨酸(3. HunterHN，Fulton DB， Ganz T & Vogel HJ(2002)The solution structure of human hepcidin， a peptide hormone with antimicrobial activity that is involved in iron uptake and hereditary hemochromatosis. J Biol Chem277，37597-37603)，形成 4 個二硫鍵結構。但 由於此4個二硫鍵結構較為複雜，因此使得通過化學方法合成大黃魚hepcidin抗菌肽 的技術難度較大，費用昂貴，且難以工業化生產。目前，通過基因工程的方法獲得的重組 h印cidin抗菌肽往往沒有廣譜抗菌效果，或者抗菌譜研究不充分(4. Zhmg H，Yimn QP， Zhu YP，Ma RY. Expression and preparation of recombinant hepcidin inEscherichia coli [J]Protein. Expr. Purif.，2005，41 409-416 ；5. Srinivasulu B.，Syvitski R.，Seo J. K.，Mattatall N. R.，Knickle L. C.，Douglas S. E.，Expression, purification and structural characterization of recombinant hepcidin, an antimicrobial peptide identified in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus, Protein Expr. Purif.， 2008，61 36-44)。
發明內容
本發明的目的在於提供一種大黃魚h印cidin抗菌肽及其製備方法。所述一種大黃魚h印cidin抗菌肽(簡寫為C-pro-PC-h印c)的胺基酸序列如下Met Val Pro Ala Asn Glu Glu Gin Glu Leu Glu Gin Gin lie Tyr Phe151015Ala Asp Pro Glu Met Pro Val Glu Ser Cys Lys Met Pro Tyr Tyr Met202530Arg Glu Asn Arg Gin Gly Ser Pro Ala Arg Cys Arg Phe Cys Cys Arg354045Cys Cys Pro Arg Met Arg Gly Cys Gly lie Cys Cys Arg Phe Leu Glu505560His His His His His His65其中N端含有表達起始密碼子的Met蛋白，C端連接有6個His標籤和Xho I酶 切位點翻譯後的2個胺基酸Leu和Glu。所述一種大黃魚h印cidin抗菌肽的基因序列為gcRccatRRt cccagccaat gaagagcaag agctggagca gcaaatttat tttgctgatc 60cagagatgcc agtggaatca tgcaagatgc cgtattacat gcgtgagaat cgtcagggca 120gccctgctag atgcaggttt tgctgccgtt gctgtcctag aatgagggga tgtggtatct 180gctgcaggttc c t c g a gegg 200其中Nco I酶切位點為CCATGG，Xho I酶切位點為CTCGAG。所述一種大黃魚hepcidin抗菌肽的製備方法包括以下步驟1)克隆大黃魚h印cidin抗菌肽基因，並將大黃魚h印cidin抗菌肽基因插入表達 載體，構建攜帶大黃魚h印cidin抗菌肽基因的重組表達載體；將所述大黃魚h印cidin抗菌 肽基因的重組表達載體轉化到大腸桿菌中，選取轉化後大腸桿菌中的陽性克隆於培養基中 進行培養，提取質粒；2)將步驟1)中的所得質粒轉化到大腸桿菌中，選取轉化後大腸桿菌中的陽性克 隆於培養基中進行發酵培養，離心收集發酵後的大腸桿菌細胞，重懸所述大腸桿菌細胞於 懸菌磷酸緩衝液中，再次離心，棄上清，將沉澱溶於變性液中，得混合溶液；3)測定混合溶液中蛋白濃度，調節蛋白濃度，加入氧化液，再加入復性液，離心，過 濾，即得大黃魚hepcidin抗菌肽蛋白粗提物；4)純化大黃魚h印cidin抗菌肽蛋白粗提物，即得大黃魚h印cidin抗菌肽。在步驟1)中，所述表達載體可為原核表達載體pET-28a+，所述大腸桿菌可為 E. coli T0P10F'，所述培養基可為含有卡那黴素和D-葡萄糖的LB培養基；所述培養條件 可為37°C，180rpm培養8h，所述提取質粒可採用常規小量質粒提取試劑盒進行提取。在步驟2)中，所述大腸桿菌可為E. coli BL21(DE3)pLysS，所述培養基可為含有 卡那黴素和D-葡萄糖的LB液體培養基；所述發酵培養的條件可為溫度為37°C，搖床培 養至菌液0D, = 0. 3 0. 5時，再加入異丙基硫代-0 -D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為
5lOOii g/mL，32°C，180rpm誘導5h ；所述離心可為5000rpm，4°C離心lOmin，所述懸菌磷酸緩 衝液的配方為50mmol/L Na2HP04, 50mmol/L NaH2P04, 300mmol/L NaCl，去離子水定容至 1L， 調節pH為8.0 ；所述再次離心為8000rpm，4°C離心lOmin，所述變性液的配方為8mol/L尿 素，50mmol/L Tris, 100mmol/L NaCl, lOOmmol/L 0 -巰基乙醇，去離子水定容至 1L，調節pH 為 9. 0。在步驟3)中，所述調節蛋白濃度至1. 2mg/mL為宜，所述加入氧化液的時間最好 在所述沉澱溶於變性液12h之後；所述氧化液的配方為2mol/L尿素，50mmol/L Tris, 100mmol/L NaCl,2mmol/L cysteine, 0. lmmol/L cystine，5%甘油，去離子水定容至 1L，調 節pH為9. 0 ；所述復性液為配方為50mmol/L Tris, 100mmol/L NaCl，5%甘油，去離子水定 容至1L，調節pH為9. 0 ；所述復性的時間為48h，所述離心為:12000rpm，4°C離心15min ；所 述過濾的濾膜孔徑為0.45 ym;所述混合液、氧化液與復性液的體積比可為1 2 3。在步驟4)中，所述純化可採用HisTrap層析柱純化，所述HisTrap層析柱純化可 採用以下方法親和層析介質裝柱後，先用溶液A鏊合Ni2+金屬離子，用5 10個柱體積超純水 (可由美國Millipore公司的超純水系統製備)洗柱；再過5 10個柱體積的溶液B的溶 液洗去多餘的附2+，並用5 10個柱體積超純水洗柱；接著過5 10個柱體積溶液C平衡 層析柱；將過濾後的大黃魚h印cidin抗菌肽蛋白粗提物全部上柱，用5 10個柱體積的溶 液C過柱，洗去未結合的蛋白；再用30個柱體積將溶液C過渡到溶液D以去除尿素，3個柱 體積的溶液D過柱平衡，最後用5個柱體積的溶液E過柱洗脫目標蛋白，收集洗脫峰，即得 大黃魚hepcidin抗菌肽；所述溶液A為摩爾濃度200mmol/L的硫酸鎳；所述溶液B的組成為NaH2P04和NaCl，所述NaH2P04的摩爾濃度為25mmol/L，所述 NaCl的摩爾濃度為500mmol/L，用磷酸調pH為4 ；所述溶液C的組成為Tris緩衝液、NaCl、咪唑和尿素，所述Tris緩衝液的摩爾濃 度為50mmol/L，所述NaCl的摩爾濃度為lOOmmol/L，所述咪唑的摩爾濃度為20mmol/L，所述 尿素的摩爾濃度為2mol/L，pH為9 ；所述溶液D的組成為Tris緩衝液、NaCl和咪唑，所述Tris緩衝液的摩爾濃度為 50mmol/L，所述NaCl的摩爾濃度為100mmol/L，所述咪唑的摩爾濃度為20mmol/L，pH為9 ；所述溶液E的組成為Tris緩衝液、NaCl和咪唑，所述Tris緩衝液的摩爾濃度為 50mmol/L，所述NaCl的摩爾濃度為100mmol/L，所述咪唑的摩爾濃度為400mmol/L，pH為9 ；所述大黃魚h印cidin抗菌肽基因序列與已經發表的其它魚類同類h印cidin抗菌 肽基因序列同源性不高，與雜交斑紋鱸魚Morone chrysops h印cidin抗菌肽基因序列的相 似度為85%。與已經發表的其它魚類h印cidin抗菌肽相比，所述大黃魚h印cidin抗菌肽 的主要表達組織不同。由於基因序列不同，所述大黃魚hepcidin抗菌肽的表達載體所也區 別於其它的hepcidin抗菌肽原核表達載體。目前尚無報導大黃魚h印cidin抗菌肽的原核表達，本發明採用融合表達方式，增 大了表達產物分子量，使表達產物大黃魚hepcidin抗菌肽更加穩定。優化了蛋白變性復性 條件，包括復性時採用的蛋白濃度，復性時間，配置的溶液等，可以得到優於以往報導的更 為廣譜的抗菌活性的大黃魚hepcidin抗菌肽。本發明所述的大黃魚hepcidin抗菌肽蛋白純化條件，不僅提高了蛋白的得率，而且解決了大黃魚h印cidin抗菌肽表達復性時會有蛋 白析出的問題。所用的溶液配置簡單，價格低廉。大黃魚hepcidin抗菌肽蛋白的抗菌活性測定的結果(參見實施例中的表2)表 明經過變性復性純化後的大黃魚h印cidin抗菌肽具有較強的廣譜抗菌活性，比以往報導 的h印cidin蛋白具有更為廣譜和更強的抗菌功能。不僅對革蘭氏陽性菌的抑制作用較革 蘭氏陰性菌強，對真菌和酵母也顯示出很強的抑制效果。對重要致病菌金黃色葡萄球菌的 最小抑菌濃度為< 1.5i!m0l/L，具有潛在的醫用價值。對水產致病菌嗜水氣單胞菌的最小 抑菌濃度為1. 5 3i!m0l/L ；同時對水產致病菌哈維氏弧菌也有一定的抑制作用。與現有抗菌肽相比，如原核表達的Japanese flounder h印cidin抗菌肽的最小殺 菌濃度為25iimol/L且幾乎不抗各種真菌及其它細菌(5. Srinivasulu B.，Syvitski R.， Seo J. K. , Mattatall N. R. , Knickle LC. , Douglas S. E. , Expression, purification and structural characterization of recombinant hepcidin, an antimicrobial peptide identified in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus, Protein Expr. Purif., 2008,61 :36-44.)，本發明所製備的大黃魚h印cidin抗菌肽具有很高的抗細菌，抗真菌，抗 酵母的廣譜抗菌活性，不僅可用於科研，也可以作為飼料添加劑用於海水養殖魚類的疾病 防治，具有廣闊的應用前景。
圖1為PET_28a+載體酶切處理後的電泳圖。在圖1中，M為DNA Marker, 1為未 進行酶切的PET-28a+載體，2為使用Ndel和EcoRI進行雙酶切後的PET_28a+載體，bp代 表鹼基對。圖2為大黃魚h印cidin抗菌肽表達載體圖譜。在圖2中，T7為啟動子，ATG為起 始密碼子，Pro-PC-hepc gene為大黃魚h印cidin抗菌肽基因，His Tag為6個His標籤， TGA為終止密碼子，Nco I和Xho I分別為酶切位點，C-pro-PC-h印c為大黃魚h印cidin抗 菌肽的簡寫；A為目的片段插入位點，B為載體上遊，C為載體下遊。圖3為PCR擴增後的大黃魚h印cidin抗菌肽基因電泳圖。在圖3中，M為DNA Marker, 1為PCR擴增後獲得的產物，即大黃魚h印cidin抗菌肽基因。圖4為檢測原核表達產物的電泳圖。在圖4中，M為蛋白Marker ；1為表達產物的 超聲上清，含有少量目的蛋白和菌體雜蛋白，2為表達產物超聲沉澱，含有大量表達的包涵 體和雜蛋白，3為洗滌包涵體後的上清，洗滌掉了部分雜蛋白，4為洗滌後離心的沉澱，大部 分為目的蛋白。圖5為C-Pro-PC-h印c蛋白復性產物的親和層析圖。在圖5中，橫坐標為體積 Volume (mL)，縱坐標為紫外吸收值AbsorbanceOnAU)，10 180mL左右的平緩峰為沒有掛柱 的流穿的蛋白峰，在360mL處的紫外吸收的尖峰即為收集的純化目的蛋白。圖6為檢測蛋白純化產物的電泳圖。在圖6中，M代表蛋白Marker，1、2為不同濃 度的純化後的蛋白，3為上柱純化前的蛋白，4為流穿的雜蛋白。
具體實施例方式以下實施例可以使本專業技術領域的技術人員更加全面的了解本發明，本發明並不限於下述的實施例。本發明所涉及的原核表達載體pET-28a+購自Novagen公司，菌株E. coli BL21 (DE3)pLysS和E. coli TOPI OF均購自晶美生物有限公司。本發明所涉及的菌種大腸桿菌(Escherichia coli)、表皮葡萄球菌 (Staphylococcusepidermidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、穀氨酸棒杆 菌(Corynebacterium glutamicum)、溶壁微球菌(Micrococcus luteus)、枯草芽抱桿菌 (Bacillus subtilis)、賭狀芽胞桿菌(Bacillus cereus)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella paratyphi C)、畐ij 溶血弧菌(Vibrio parahaemloyticus)、角軍藻月元酸弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、白假絲酵母(Candida albicans)、禾穀鐮 抱(Fusarium graminearum)、腐皮鍵抱(Fusarium solani)、黑麴黴(Aspergillus niger) 購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，畢赤酵母(Pichia pastoris GS115)購自 Invitrogen 公司。本發明採用的主要試劑和耗材Chelating Sepharose Fast Flow和DEAE Sepharose Fast Flow層析填料購自安瑪西亞公司；Qiaquick Gel Extraction Kit購自 QIAGEN 公司；Ex Taq DNA 聚合酶，限制性內切酶 Ncol、Xhol、Ndel、EcoRI，DNA Ligation Kit，蝦鹼性磷酸酶SAP，核酸共沉劑購自TaKaRa公司；PCR及酶反應純化試劑盒和質粒小量 純化試劑盒購自東盛公司；丙烯醯胺、N, N'-亞甲基雙丙烯醯胺為BBI公司產品；Hybond ECL(硝酸纖維素膜)為安瑪西亞產品；Kan、IPTG、考馬斯亮蘭R250均購自購自上海生工； 低分子量標準蛋白質Marker購自BBI公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自碧雲天生 物技術研究所；其它試劑均為國產分析純試劑。實施例lpET_28a+載體的處理1) pET_28a+ 質粒的提取；將含有pET-28a+原核表達載體的E. coli BL21 (DE3)pLysS的保存於20%甘油的 大腸桿菌劃線於含50 u g/ml卡那黴素的LB平板上，37°C培養12h。挑取單克隆，接種至5ml 添加了 50 ii g/ml卡那黴素和0. 5%0-葡萄糖的1^液體培養基中，371，180印111培養811，按 照東盛質粒小量提取試劑盒說明書提取質粒。2) pET-28a+載體的酶切和去磷酸化處理；按照以下體系對pET-28a+質粒進行Ncol-Xhol雙酶切Ncol-Xhol 雙酶切10XK Buffer (緩衝液)15u 1
0. 1 % BSA15u 1
Ncol內切酶7u 1
Xhol內切酶7u 1
pET-28a+ 質粒100 u 1
超純水6u 1
總體積150 u 137°C孵育6h，用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切後產物，Qiagen凝膠回收試劑盒 回收特異性片段，溶於88 yl洗脫液中。按以下體系對酶切後載體進行磷酸化處理pET_28a+雙酶切回收產物88 ii 1
10 X PCRBuffer (緩衝液)鹼性磷酸酶SAP總體積
10 u 1 2u 1 100 u 137°C孵育30min，65°C滅活15min，將100 yl酶切後載體稀釋到200 yl，酚氯仿異 戊醇法抽提蛋白，按照核酸共沉劑說明書沉澱處理好的載體，用水重懸後存於-20°C待用。 處理好的載體具有Ncol-Xhol的粘性末端(參見圖1)。實施例2目的基因的獲得1)引物的設計根據pET_28a+載體上的多克隆位點及大黃魚h印cidin cDNA序列設計含有大黃 魚h印cidin抗菌肽前導肽的表達載體(參見圖2)，PCR上下遊引物如表1，黑體表示限制 性內切酶位點，C-Pro-PC-hepc forward其中CCATGG為Nco I酶切位點，前端的GCG為酶 切位點的保護鹼基，C-Pro-PC-hepc reverse其中CTCGAG為Xho I的酶切位點，前端的CCG 為設計的保護鹼基
權利要求
一種大黃魚hepcidin抗菌肽，其特徵在於其胺基酸序列如下Met Val Pro Ala Asn Glu Glu Gln Glu Leu Glu Gln Gln Ile Tyr Phe1 5 10 15Ala Asp Pro Glu Met Pro Val Glu Ser Cys Lys Met Pro Tyr Tyr Met20 25 30Arg Glu Asn Arg Gln Gly Ser Pro Ala Arg Cys Arg Phe Cys Cys Arg35 40 45Cys Cys Pro Arg Met Arg Gly Cys Gly Ile Cys Cys Arg Phe Leu Glu50 55 60His His His His His His65其中N端含有表達起始密碼子的Met蛋白，C端連接有6個His標籤和Xho I酶切位點翻譯後的2個胺基酸Leu和Glu。
2.一種大黃魚hepcidin抗菌肽基因，其特徵在於其序列如下RCRCcatRRt cccagccaat gaagagcaag agctggagca gcaaatttat tttgctgatc 60 cagagatgcc agtggaatca tgcaagatgc cgtattacat gcgtgagaat cgtcagggca 120 gccctgctag atgcaggttt tgctgccgtt gctgtcctag aatgagggga tgtggtatct 180 gctgcaggtt cctcgag egg200其中Nco I酶切位點為CCATGG，Xho I酶切位點為CTCGAG。
3.一種大黃魚hepcidin抗菌肽的製備方法，其特徵在於包括以下步驟1)克隆大黃魚h印cidin抗菌肽基因，並將大黃魚h印cidin抗菌肽基因插入表達載體， 構建攜帶大黃魚h印cidin抗菌肽基因的重組表達載體；將所述大黃魚h印cidin抗菌肽基 因的重組表達載體轉化到大腸桿菌中，選取轉化後大腸桿菌中的陽性克隆於培養基中進行 培養，提取質粒；2)將步驟1)中的所得質粒轉化到大腸桿菌中，選取轉化後大腸桿菌中的陽性克隆於 培養基中進行發酵培養，離心收集發酵後的大腸桿菌細胞，重懸所述大腸桿菌細胞於懸菌 磷酸緩衝液中，再次離心，棄上清，將沉澱溶於變性液中，得混合溶液；3)測定混合溶液中蛋白濃度，調節蛋白濃度，加入氧化液，再加入復性液，離心，過濾， 即得大黃魚h印cidin抗菌肽蛋白粗提物；4)純化大黃魚h印cidin抗菌肽蛋白粗提物，即得大黃魚h印cidin抗菌肽。
4.如權利要求3所述的一種大黃魚hepcidin抗菌肽的製備方法，其特徵在於在步驟 1)中，所述表達載體為原核表達載體pET-28a+。
5.如權利要求3所述的一種大黃魚hepcidin抗菌肽的製備方法，其特徵在於在步驟1)中，所述大腸桿菌為E.coliT0P10F'，所述培養基為含有卡那黴素和D-葡萄糖的LB培 養基；所述培養條件為37°C，180rpm培養8h，所述提取質粒採用常規小量質粒提取試劑盒 進行提取。
6.如權利要求3所述的一種大黃魚hepcidin抗菌肽的製備方法，其特徵在於在步驟2)中，所述大腸桿菌為E.coliBL21(DE3)pLysS ；所述培養基最好為含有卡那黴素和D-葡 萄糖的LB液體培養基；所述發酵培養的條件為溫度為37°C，搖床培養至菌液0D,=`0. 3 0. 5時，再加入異丙基硫代-3 -D-半乳糖苷至終濃度為100 u g/mL, 32°C，180rpm誘 導5h ；所述離心為5000rpm，4°C離心lOmin ；所述懸菌磷酸緩衝液的配方最好為50mmol/L Na2HP04, 50mmol/LNaH2P04, 300mmol/L NaCl，去離子水定容至 1L，調節 pH 為 8. 0 ；所述再次 離心為8000rpm，4°C離心lOmin，所述變性液的配方最好為8mol/L尿素，50mmol/L Tris, 100mmol/L NaCl, 100mmol/L 0 -巰基乙醇，去離子水定容至1L，調節pH為9。
7.如權利要求3所述的一種大黃魚hepcidin抗菌肽的製備方法，其特徵在於在步驟 3)中，所述調節蛋白濃度至1. 2mg/mL，所述加入氧化液的時間在所述沉澱溶於變性液12h 之後；所述氧化液的配方最好為2mol/L尿素，50mmol/L Tris, 100mmol/L NaCl,2mmol/L cysteine, 0. lmmol/L cystine，5%甘油，去離子水定容至1L，調節pH為9. 0 ；所述復性液 為配方最好為50mmol/L Tris, 100mmol/L NaCl，5%甘油，去離子水定容至1L，調節pH為 `9. 0 ；所述復性的時間為48h，所述離心為12000rpm，4°C離心15min ；所述過濾的濾膜孔徑 為 0. 45 y m。
8.如權利要求3所述的一種大黃魚hepcidin抗菌肽的製備方法，其特徵在於在步驟3)中，所述混合液、氧化液與復性液的體積比為1 2 3。
9.如權利要求3所述的一種大黃魚hepcidin抗菌肽的製備方法，其特徵在於在步驟4)中，所述純化採用HisTrap層析柱純化，所述HisTrap層析柱純化採用以下方法親和層析介質裝柱後，先用溶液A鏊合附2+金屬離子，用5 10個柱體積超純水洗柱； 再過5 10個柱體積的溶液B的溶液洗去多餘的附2+，並用5 10個柱體積超純水洗柱； 接著過5 10個柱體積溶液C平衡層析柱；將過濾後的大黃魚hepcidin抗菌肽蛋白粗提 物全部上柱，用5 10個柱體積的溶液C過柱，洗去未結合的蛋白；再用30個柱體積將溶 液C過渡到溶液D以去除尿素，3個柱體積的溶液D過柱平衡，最後用5個柱體積的溶液E 過柱洗脫目標蛋白，收集洗脫峰，即得大黃魚hepcidin抗菌肽。
10.如權利要求9所述的一種大黃魚hepcidin抗菌肽的製備方法，其特徵在於在步驟 4)中，所述溶液A為摩爾濃度200mmol/L的硫酸鎳；所述溶液B的組成為NaH2P04和NaCl，所述NaH2P04的摩爾濃度為25mmol/L，所述NaCl 的摩爾濃度為500mmol/L，用磷酸調pH為4 ；所述溶液C的組成為Tris緩衝液、NaCl、咪唑和尿素，所述Tris緩衝液的摩爾濃度為 50mmol/L，所述NaCl的摩爾濃度為lOOmmol/L，所述咪唑的摩爾濃度為20mmol/L，所述尿素 的摩爾濃度為2mol/L，pH為9 ；所述溶液D的組成為Tris緩衝液、NaCl和咪唑，所述Tris緩衝液的摩爾濃度為 50mmol/L，所述NaCl的摩爾濃度為100mmol/L，所述咪唑的摩爾濃度為20mmol/L，pH為9 ；所述溶液E的組成為Tris緩衝液、NaCl和咪唑，所述Tris緩衝液的摩爾濃度為 50mmol/L，所述NaCl的摩爾濃度為100mmol/L，所述咪唑的摩爾濃度為400mmol/L，pH為9。
全文摘要
一種大黃魚hepcidin抗菌肽及其製備方法。涉及生物技術領域中的魚類基因工程，提供一種大黃魚hepcidin抗菌肽及其製備方法。所述大黃魚hepcidin抗菌肽的製備方法包括克隆大黃魚hepcidin抗菌肽基因，構建重組載體，轉化宿主細胞，挑選陽性克隆進行原核表達，分離純化表達產物，獲得大黃魚hepcidin抗菌肽。分離純化時提高了蛋自的得率，解決了大黃魚hepcidin抗菌肽表達復性時會有蛋自析出的間題。所用的溶液，配置簡單，價格低廉。製備的大黃魚hepcidin抗菌肽具有很高的廣譜抗菌活性，不僅可用於科研，而且可以作為飼料添加劑用於海水養殖魚類的疾病防治，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C07K14/46GK101974082SQ201010505548
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月13日 優先權日2010年10月13日
發明者王克堅, 蔡晶晶, 蔡靈 申請人:廈門大學