蛋白質的共表達的製作方法

2023-09-14 23:43:05 1

專利名稱：蛋白質的共表達的製作方法
相關申請的參照這是1997年5月30日提交的共同未決申請08/866，879和1996年5月31日提交的臨時申請60/020，424(現已放棄)的部分延續申請。
背景技術：
紫苜蓿(Medicago sativa L.)廣泛種植，具有極好的維生素和礦物質平衡，產量高，是生物學固氮的極好來源，而且作為有吸引力的蜜蜂花蜜來源(Barnes等人，1988；Smoliak和Bjorge，1983)，因而被認為是全世界最重要的種植飼料農作物(Hanson等人，1988；Michaud等人，1988)，常常被稱為「飼料農作物王后」。為了其飼料品質和植物性能，苜蓿已培育多年。雖然苜蓿和其它豆科飼料農作物蛋白質含量高，但是這些植物缺乏含硫胺基酸(S-胺基酸)，甲硫氨酸和半胱氨酸(Kaldy等人，1979)。羊毛的生長顯示受S-胺基酸可獲得性的限制。相似的，產乳動物的乳生產受植物中S-胺基酸缺乏的影響。使用傳統植物育種和細胞選擇技術以提高苜蓿的S-胺基酸含量的努力尚未成功，或進展很小。
用於改進苜蓿和其它飼料農作物的胺基酸平衡的基因工程方法是，將編碼富含甲硫氨酸蛋白質的基因導入這些植物，這些基因由葉啟動子中的強組成性啟動子驅動。為了顯著改變豆科飼料的胺基酸平衡，外源蛋白應當包含大約15-25％的S-胺基酸，且佔葉總蛋白質的5-10％。為了達到這些蛋白質積累水平，不僅需要確保基因轉錄和翻譯的最大水平，還要確保蛋白質的穩定性。至於反芻動物的飼料農作物，瘤胃細菌和胃酶對含S-胺基酸蛋白質的消化能力對於為反芻動物提供適當的飼料農作物而言是非常重要的問題，但是常常被忽略。因此，富含S-胺基酸的蛋白質應當對反芻動物瘤胃(第一個胃)的降解相對有抗性，且應當在較低的胃腸道中被同化。
關於植物中營養改良的最集中的努力集中於種子蛋白質。由於玉米和其它穀類農作物不容易轉化，所以致力於種子蛋白質修飾的大部分工作涉及測試轉基因菸草(Williamson等人，1988；Ohtani等人，1990)和爪蟾卵母細胞(Xenopus oocytes)(Wallace等人，1988)中經修飾的谷醇溶蛋白的穩定性。還分析了轉基因菸草和矮牽牛種子中含賴氨酸的α-玉米醇溶蛋白的合成(Williamson等人，1988；Ohtani等人，1990)。發現正常和經修飾蛋白質都具有很短的半壽期。
為了改進豆科種子蛋白質的S-胺基酸含量的努力包括將含6個甲硫氨酸密碼子的45bp寡核苷酸導入β-菜豆蛋白基因的第三個外顯子。包含該經修飾基因的轉化子顯示，高甲硫氨酸的菜豆蛋白以與正常蛋白質相同的水平合成，但是非常不穩定，而且迅速轉化(Hoffman等人，1988)。β-菜豆蛋白中額外胺基酸的導入可能引起其二級結構的變形，使之更容易被蛋白水解作用所降解。DeClercq等人(1990)用三種不同的高甲硫氨酸編碼片段取代了芥屬2S清蛋白第六個和第七個半胱氨酸殘基之間的23個胺基酸的編碼片段。將這些經修飾的擬南芥2S基因轉化到擬南芥(Arabidopsis thaliana)、B.napus、和菸草中。種子中有一些蛋白質積累，但是不如預測得多(M.Chrispeefs，個人通訊)。已經將含多達19％甲硫氨酸、且由β-菜豆蛋白基因啟動子驅動的巴西堅果2S清蛋白基因導入菸草(Guerche等人，1990)、芸苔(Altenbach等人，1992)、和大豆(Pioneer種子公司)。最近，Saalbach等人(1994)合成了2S清蛋白基因並將其連接在CaMV 35S啟動子之後。導入菸草和一些穀類豆類後，基因在植物葉中顯示最高表達水平，且蛋白質位於液泡。然而，巴西堅果清蛋白極易引起過敏，不會被接受用於消費。
用於在植物中增加特定胺基酸庫的一種方法是，將編碼胺基酸生物合成途徑中的重要調控酶的細菌基因導入植物。將編碼經脫敏以反饋賴氨酸和蘇氨酸抑制的天冬氨酸激酶的細菌基因與β-菜豆蛋白基因啟動子融合，並導入菸草。轉基因菸草的種子顯示游離蘇氨酸和甲硫氨酸水平升高(Karchi等人，1993；Galili，1995)。
關於改進飼料農作物的蛋白質品質，做了很少的努力。Schoeder等人(1991)將由CaMV 35S啟動子驅動的小雞卵清蛋白基因(cDNA)導入苜蓿。然而，轉基因苜蓿植物在葉中顯示很低的蛋白質積累水平(0.005％)。還未確定這種蛋白質豐度這麼低的原因。
威斯康辛大學還嘗試了一些努力，以獲得具有更高的游離甲硫氨酸水平的苜蓿突變體。據報導，對胺基酸類似物的生長抑制具有抗性的細胞系產生比正常量更高的相應天然胺基酸。由此，在特定胺基酸類似物上的生長已被用作選擇工具，用於選擇高水平積累特定胺基酸的植物。胺基酸的過度生產常常歸咎於參與其生產的酶的反饋控制的鬆懈(Malega，1978)。在改進首蓿甲硫氨酸含量的嘗試中，選擇經誘變對甲硫氨酸類似物的生長抑制有抗性的苜蓿懸浮培養細胞(Reish等人，1981)。獲得了少數包含高甲硫氨酸庫的細胞系，然而，這些細胞系的再生未產生具有高甲硫氨酸含量的植株(E.T.Bingham個人通訊)。
玉米醇溶蛋白是一類醇溶性蛋白質，在玉米胚乳的發育過程中合成，佔成熟種子總蛋白質的50％(Lee等人，1976)。玉米醇溶蛋白可以根據其溶解度分成4類，α、β、γ、和δ(Larkins等人，1989)。玉米醇溶蛋白還可以根據大小分類。α玉米醇溶蛋白是最豐富的一類，由22kD和19kD玉米醇溶蛋白組成；這些蛋白質的中央區由大約20個胺基酸殘基的重複性肽組成(Argos，1982)。β玉米醇溶蛋白包括15kD玉米醇溶蛋白，所含脯氨酸和穀氨醯胺比α玉米醇溶蛋白少。γ玉米醇溶蛋白包括27kD和16kD型，非常富含脯氨酸(25％)。δ玉米醇溶蛋白是相對較少的一類，包括10kD玉米醇溶蛋白(Kirihara等人，1988)。玉米醇溶蛋白的所有類型在結構上是獨特的。α和γ玉米醇溶蛋白中的重複區可能在蛋白體包裝中起主要作用。玉米醇溶蛋白通常包含極低水平的必需胺基酸，賴氨酸、色氨酸，和較低程度的甲硫氨酸。然而，15kD和10kD玉米醇溶蛋白由於極高的甲硫氨酸含量而與眾不同(分別為10％和22.5％)(Giannaza等人，1977)。
玉米醇溶蛋白在粗糙內質網(RER)上合成，並在RER中直接聚集成蛋白體(Larkins和Hurkman，1978)。根據玉米胚乳中發育中的蛋白體的玉米醇溶蛋白組成分析，Lending和Larkins(1989)提出了玉米胚乳中蛋白體形成過程中玉米醇溶蛋白沉積模式的描述性模型β和γ玉米醇溶蛋白首先開始在RER中積累；隨後，α玉米醇溶蛋白開始在β和γ玉米醇溶蛋白的小腔中積累；隨著時間，α玉米醇溶蛋白小腔融合併形成中央孔，而β和γ玉米醇溶蛋白形成蛋白體周圍的連續層。在獨立的研究中，Esen和Stetter(1992)證明蛋白體的孔區存在δ玉米醇溶蛋白。
玉蜀黍中的突變影響不同玉米醇溶蛋白基因的表達。玉米醇溶蛋白基因表達的改變反過來對種子的胺基酸組成具有直接影響。隱性突變不透明-2純合子植株的種子的賴氨酸水平相對於野生型種子升高(Misra等人，1972)。賴氨酸的升高歸功於22kDα玉米醇溶蛋白表達的降低(Langridge等人，1983)。近交系繁殖系BSSS-53種子的甲硫氨酸水平比其它同系繁殖系高30％。甲硫氨酸含量的升高是由於10kD玉米醇溶蛋白水平升高了2倍(Phillips和McClure，1985)。
已知在內質網積累的蛋白質在其羧基末端附近具有胺基酸序列Lys(his)Asp Glu Leu(K(H)DEL)，以防止它們進入高爾基體(Pelham，1990)。然而，玉米醇溶蛋白和其它谷醇溶蛋白缺乏這種序列。70kD熱激蛋白的同源物，BiP，作為分子伴侶，顯示涉及水稻胚乳中醇溶谷蛋白蛋白體的形成(Li等人，1993b)。BiP在玉米醇溶蛋白蛋白體形成中的作用是基於BiP在玉米的一些玉米醇溶蛋白調控突變體的ER中和異常蛋白體上積累的事實(Boston等人，1991；Zhang和Boston，1992)。總之，對玉米醇溶蛋白靶向蛋白體並在其中裝配的機制了解很少，而且尚未知道分子間和分子內相互作用是否在蛋白體形成中具有重要作用。Abe等人(1991)提出細胞骨架在玉米醇溶蛋白蛋白體的生源論中具有重要作用。
根據上文，可以理解，本領域仍然需要包含穩定的、S-胺基酸含量高的蛋白體的植物和飼料農作物。本發明提供了用於改進植物的飼料品質的新的且有利的方法。
圖的簡要描述

圖1A-1B顯示15kD玉米醇溶蛋白在轉基因L.japonicus(圖A)和苜蓿Regen SY(圖B)的葉中的穩定狀態積累模式。將來自不同獨立轉化子的葉的70％乙醇(EtOH)可溶性蛋白(相當於50μg磷酸鹽緩衝液可溶性級分)進行SDS-PAGE，電轉印至硝酸纖維素膜，隨後用15kD玉米醇溶蛋白抗體進行免疫印跡分析。
圖1C顯示15kD玉米醇溶蛋白基因構建體的示意圖。
圖2A-2B顯示10kD玉米醇溶蛋白在轉基因L.japonicus(圖A)和苜蓿Regen SY(圖B)的葉中的穩定狀態積累模式。將來自不同獨立轉化子的葉的70％EtOH可溶性蛋白(相當於50μg磷酸鹽緩衝液可溶性部分)進行SDS-PAGE，電轉印至硝酸纖維素膜，隨後用10kD玉米醇溶蛋白抗體進行免疫印跡分析。
圖2C顯示10kD玉米醇溶蛋白基因構建體的示意圖。
圖3A-3C顯示10kD玉米醇溶蛋白在轉基因菸草中的穩定狀態積累模式。
圖3A.pM10Z的示意圖。構建體由CaMV 35S啟動子融合在含10kD玉米醇溶蛋白基因編碼區的470bp之BglII-XhoI片段的BglII位點而組成。隨後是pMON316(Rogers等人，1987)的NOS 3』終止子。
圖3B.不同獨立轉化子的10kD玉米醇溶蛋白積累的分析。將由葉提取的EtOH可溶性蛋白(相當於50μg PBS可溶性蛋白)進行SDS-PAGE，轉硝酸纖維素膜，隨後用10kD玉米醇溶蛋白抗體進行免疫印跡分析。轉化子下標號1-7的泳道含來自不同轉化子的葉的樣品，對照下標號1-2的泳道是來自未轉化菸草植株的葉樣品。
圖3C.不同植物器官(轉化子6)的10kD玉米醇溶蛋白積累的分析。將來自標明的各種植物部分的EtOH可溶性部分(相當於50μg PBS可溶性蛋白)與2μg玉米種子蛋白一起進行SDS-PAGE，隨後用10kD玉米醇溶蛋白抗體進行Western分析。UT和Mat分別表示未轉化的和成熟種子。凝膠中包含分子量標準，標明了2種相關標記的大小。
圖4顯示10kD玉米醇溶蛋白在轉基因菸草發芽種子/幼苗中的命運。將10kD玉米醇溶蛋白植物的種子滅菌，並在無菌條件下發芽。在圖中標明的精確時間收穫種子/幼苗，並提取EtOH可溶性部分。然後將相當於50μg PBS可溶性蛋白的EtOH可溶性級分進行SDS-PAGE，隨後用10kD玉米醇溶蛋白抗體進行Western分析。標明了10kD玉米醇溶蛋白在凝膠中的位置，DAG表示發芽後的天數。
圖5A-5D.10kD玉米醇溶蛋白在轉基因菸草葉中的超微結構和免疫金定位。
圖5A.10kD玉米醇溶蛋白轉化子中顯示多個10kD玉米醇溶蛋白蛋白體(由箭頭標明)的2個葉肉細胞區域。
圖5B.10kD玉米醇溶蛋白蛋白體(由箭頭標明)的更大倍數的放大圖像。
圖5C.15kD玉米醇溶蛋白轉化子的葉肉細胞中15kD玉米醇溶蛋白蛋白體的結構。
圖5D.10kD玉米醇溶蛋白在10kD玉米醇溶蛋白轉化子的葉細胞中的5nm金顆粒免疫定位(由箭頭標明)。
圖6A-6D.10kD、15kD、和10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株的葉和種子中10kD和15kD玉米醇溶蛋白水平的比較。
圖6A.將來自10kD和10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株的葉(相當於10μg PBS可溶性蛋白)和種子(相當於50μg PBS可溶性蛋白)的EtOH可溶性級分進行SDS-PAGE，隨後用10kD玉米醇溶蛋白抗體進行Western分析。
圖6B.使用生物影像智能定量儀(Bio Image IntelligentQuantifier)對圖6A的條帶亮度進行定量。
圖6C.將來自10kD和10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株的葉和種子(相當於50μg PBS可溶性蛋白)的EtOH可溶性級分進行SDS-PAGE，隨後用15kD玉米醇溶蛋白抗體進行Western分析。
圖6D.使用生物影像智能定量儀對圖6C的條帶亮度進行定量。
圖7A-7D.10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株的葉中10kD和15kD玉米醇溶蛋白的亞細胞定位。
圖7A.來自10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株的葉的傳統固定和染色部分。箭頭指向細胞質中形成的蛋白體。
圖7B.使用小鼠抗10kD玉米醇溶蛋白抗體(1∶50稀釋)隨後10nm直徑的金綴合山羊抗小鼠IgG的10kD玉米醇溶蛋白的免疫定位。
圖7C.使用小鼠抗10kD玉米醇溶蛋白抗體和兔抗15kD玉米醇溶蛋白抗體隨後10nm直徑的金綴合山羊抗小鼠IgG和5nm金綴合山羊抗兔IgG的10kD和15kD玉米醇溶蛋白的共免疫定位。
圖7D.圖C顯示雙重標記的區域的更大倍數的放大圖像。箭頭指向10nm的金顆粒而箭號指向5nm金顆粒。
圖8.δ-、β-、和δ-/β-玉米醇溶蛋白菸草轉化子中BiP積累模式的分析。
將來自對照(NT)、δ-玉米醇溶蛋白、β-玉米醇溶蛋白、和δ-/β-玉米醇溶蛋白植株的葉的磷酸鹽緩衝鹽可溶性提取物(100μg蛋白質)進行SDS-PAGE，隨後用針對來自玉蜀黍的BiP的抗體進行Western印跡。凝膠包含的陽性對照泳道含純化BiP(1μg)。下圖表示使用智能定量儀的條帶定量的結果。
圖9A表示SEQ ID NO5。
圖9B表示SEQ ID NO6。
圖10是轉化入菸草的Z10/OCI質粒的構建概述圖。
圖11A和11B是轉化菸草植物的提取樣品的Western印跡，顯示與Z10(14A)和OCI(14B)抗體的陽性免疫反應。
序列的簡要描述SEQ ID NO1表示引物PA，用於由質粒prep(993)Z10 pMON316/DH5δ擴增Z10片段。
SEQ ID NO2表示引物PB，用於由質粒prep(993)Z10 pMON316/DH5α擴增Z10片段。
SEQ ID NO3表示引物PC，用於由質粒(809)OclpSP73/DH5α擴增OC-1片段。
SEQ ID NO4表示引物PD，用於由質粒(809)OclpSP73/DH5α擴增OC-1片段。
SEQ ID NO5表示Z10片段，如圖9A所示。
SEQ ID NO6表示OCI片段，如圖9B所示。
發明概述本發明涉及導致一種蛋白質在細胞中的積累相對於同一蛋白質單獨表達時的水平而言增高的蛋白質的共表達。蛋白質在原核或真核細胞中表達。當一起表達時，這兩種蛋白質中的一種或兩種在細胞中以高於在細胞中單獨表達的水平積累。採用標準的、常規的基因工程技術，以(i)分離編碼期望蛋白質(包含調控序列)的適當DNA，(ii)轉化靶細胞，並且在為植物的情況中，再生轉基因植物。在足以導致兩種蛋白質中的一種或兩種以高水平積累的條件下，培養轉基因細胞。在細胞中積累的蛋白質展示升高的穩定性和對降解的抗性。
本發明還涉及能夠高水平表達穩定蛋白質的植物和植物組織，這些蛋白質在植物細胞中以蛋白體的形式存在。特別例示了共表達15kD和10kD玉米醇溶蛋白的植物。共表達15kD和10kD玉米醇溶蛋白的經轉化植物可用於提供飼料農作物，所述飼料作物中含有增加的含硫胺基酸(諸如甲硫氨酸)，從而增高通常以這些農作物為食的動物的食物中含硫胺基酸(諸如甲硫氨酸)的水平。本發明還涵蓋經轉化包含新的異型蛋白體的植物或植物組織，這些蛋白體的一種或多種必需胺基酸(如精氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、和纈氨酸)升高。本發明還涵蓋導致在植物組織中通常不穩定的蛋白質的積累增加的蛋白體。
本發明還涉及包含瘤胃穩定的蛋白體的植物或植物組織，這些蛋白體包含其它蛋白質物質，例如能夠引發免疫應答的抗原決定簇、蛋白質藥物、殺蟲劑、或抗微生物肽。異源蛋白質可以在用作為「載體蛋白」的本發明貯藏蛋白轉化的植物中表達，由此蛋白質在細胞中以蛋白體的形式結合併積累。在另一個實施方案中，在植物或植物組織中以融合蛋白的形式提供瘤胃穩定的蛋白體，融合蛋白在包含玉米醇溶蛋白和異源蛋白質或肽的細胞中表達。
發明詳述本發明涉及能夠高水平表達穩定的貯藏蛋白的植物和植物組織，這些蛋白質在植物細胞中以蛋白體的形式存在。本發明範圍涵蓋的植物包括經轉化表達本發明蛋白質的飼料農作物植物，包括例如苜蓿、三葉草、玉米青貯飼料、高粱、和其它豆科農作物。本發明範圍還涵蓋用於人類消費、經轉化表達蛋白質的植物，這些蛋白質增強了植物的蛋白質品質從而改良營養。特別例示了表達含高水平S-胺基酸(諸如甲硫氨酸和半胱氨酸)的蛋白質的植物。在優選的實施方案中，玉米醇溶蛋白在植物或植物組織中表達。更優選的，表達的玉米醇溶蛋白是15kD和10kD玉米醇溶蛋白。最優選的，15kD和10kD玉米醇溶蛋白在植物或植物組織中共表達。將基因型攜帶10kD和15kD玉米醇溶蛋白基因的植物有性雜交，以產生攜帶兩種構建體的雜種。在經轉化植物中表達的玉米醇溶蛋白對瘤胃降解有抗性，由於這種蛋白質能夠「避開」瘤胃，因此可用於提供重要營養的胺基酸，胺基酸能夠在胃中消化，並被反芻動物吸收。
本發明還涵蓋包含瘤胃穩定的蛋白體的植物或植物組織，這些蛋白體包含其它蛋白質物質，例如能夠引發免疫應答的抗原決定簇、蛋白質藥物、殺蟲劑、或抗微生物肽。具有必需胺基酸的異源和內源蛋白質及合成肽能夠在用作為「載體蛋白」的本發明貯藏蛋白轉化的植物中表達，由此蛋白質在細胞中以蛋白體的形式結合併積累。在另一個實施方案中，瘤胃穩定的蛋白體在植物或植物組織中以包含玉米醇溶蛋白與異源蛋白質或肽的融合蛋白的形式表達。融合蛋白可以設計通過選定酶的切割或在特定生理學條件下生產異源蛋白質部分。優選的，作為融合蛋白一部分表達的玉米醇溶蛋白是15kD或10kD玉米醇溶蛋白。更優選的，15kD和10kD玉米醇溶蛋白在包含融合蛋白的植物或植物組織中共表達。
本發明還涵蓋瘤胃穩定的蛋白體。本發明的瘤胃穩定的蛋白體不被動物瘤胃中的瘤胃細菌消化，但是能夠被動物胃中的蛋白水解酶消化。本發明的瘤胃穩定的蛋白體可以製備成除了瘤胃穩定的蛋白質還包含異源蛋白質物質。例如，能夠引發免疫應答的抗原決定簇、蛋白質藥物、殺蟲劑、或抗微生物肽。瘤胃穩定的蛋白體可以由用編碼期望的瘤胃穩定蛋白質的多核苷酸分子轉化的植物中分離。使用本領域已知的標準技術，可以容易的選擇表達編碼期望的瘤胃穩定蛋白質的多核苷酸分子的植物細胞，並再生成植物或植物組織。
在本發明的一個實施方案中，貯藏蛋白基因在細胞中與第二種蛋白質基因共表達，由此第二種蛋白質在細胞中以高於在細胞中單獨表達(即不存在貯藏蛋白基因)時的水平積累。在優選的實施方案中，貯藏蛋白基因是種子貯藏蛋白基因，靶細胞是植物細胞，且第二種蛋白質基因可以是任何編碼期望的蛋白質的基因。與蛋白質基因一起採用的調控序列(啟動子、起始序列、終止序列、多腺苷酸化序列、增強子、等等)可以由本領域普通技術人員根據多種因素容易的選擇，諸如i)採用的特定蛋白質基因，ii)將要轉化的靶細胞，iii)期望表達/積累的植物組織，iv)將要轉化的特定植物(單子葉植物、雙子葉植物、等等)物種，等等。例如，若植物細胞是靶細胞，則可以選擇組成性啟動子(如CaMV 35S、泛有素、等等)，或者可以採用組織特異的啟動子，從而在特定組織(種子、綠色組織、等等)中高水平表達。
在本發明的另一個實施方案中，植物細胞中一起採用15kD玉米醇溶蛋白基因與第二種蛋白質基因，導致第二種蛋白質在植物細胞中積累。採用標準轉化及再生技術，可以將兩種基因包含於單個表達盒中並插入植物基因組。或者，可以將兩種蛋白質基因以分開的表達盒獨立插入植物細胞基因組，並由此再生轉基因植株。同樣，可以將兩種蛋白質基因插入分開的植物細胞，並再生成各自包含一種蛋白質基因的、可育轉基因植株。然後採用標準植物育種技術將這些轉基因植物異體受精，以產生包含15kD玉米醇溶蛋白基因和第二種蛋白質基因的雜種，其中第二種蛋白質在一種或多種植物組織中積累。
在本發明的優選實施方案中，用15kD玉米醇溶蛋白基因和10kD玉米醇溶蛋白(第二種蛋白質)轉化苜蓿、菸草、或其它植物細胞，其中兩種基因都由組成性啟動子驅動。將包含兩種基因構建體的可育轉基因植株再生。培養後代植株，10kD玉米醇溶蛋白在綠色組織中以相對於10kD蛋白質單獨表達時的積累水平的5-10倍或更高水平積累。
此外，本發明涵蓋作為在綠色植物組織中表達貯藏蛋白基因和第二種蛋白質基因的結果而形成的新的蛋白體。在一個實施方案中，新的蛋白體包含15kD玉米醇溶蛋白和第二種蛋白質。蛋白體通常位於葉組織。在優選的實施方案中，新的蛋白體位於葉組織，並包含15kD玉米醇溶蛋白和10kD玉米醇溶蛋白。
本發明還涵蓋用於提高植物的飼料品質的方法，包括用編碼本發明貯藏蛋白的多核苷酸分子轉化植物或植物組織。用於轉化植物並選擇轉化基因型之表達的方法在本領域是已知的。在該方法的優選實施方案中，多核苷酸編碼在植物或植物組織中表達的玉米醇溶蛋白。更優選的，表達的玉米醇溶蛋白是15kD或10kD玉米醇溶蛋白。最優選的，15kD和10kD玉米醇溶蛋白在經轉化植物或植物組織中共表達。使用本領域已知的標準技術，可以由經轉化植物或植物組織容易的製備轉基因植物。
本發明還涵蓋用於提高異源蛋白質在植物或植物組織中的穩定性和貯藏的方法。異源蛋白質可以在用作為「載體蛋白」的本發明貯藏蛋白轉化的植物中表達，由此蛋白質在細胞中以蛋白體的形式結合併積累。在本發明的另一個實施方案中，用編碼融合蛋白的多核苷酸分子轉化植物，融合蛋白包含與異源蛋白質或肽可操作連接的本發明貯藏蛋白。
本發明的玉米醇溶蛋白不僅包括那些具有在自然界中發現的胺基酸序列的蛋白質(包括等位基因變體)，還包括那些在蛋白質序列中具有保守胺基酸替代、加入、和刪除的變體玉米醇溶蛋白，只要這些變體蛋白質基本保留了與天然玉米醇溶蛋白相同的有關生物學活性。熟練技術人員根據此處公開的技術可以容易的確定變體蛋白質是否基本保留了與未修飾蛋白質相同的生物學化學。
材料和方法重組DNA技術使用標準步驟進行重組DNA操作(Maniatis等人，1982)。包含由玉米胚乳cDNA文庫分離的10kD玉米醇溶蛋白cDNA的質粒pMZEI10k(Kirihara等人，1988)，由Dr.J.Messing惠贈。由pUC119獲得包含完整編碼區的470bp EcoRI/XbaI片段，並克隆到pSP73的EcoRI和XbaI位點中。10kD玉米醇溶蛋白的終止密碼子包含於XbaI位點中。然後以BglII/XhoI片段回收10kD玉米醇溶蛋白基因，並插入pMON316多接頭的BglII和XhoI位點(Rogers等人，1987)。10kD玉米醇溶蛋白的終止密碼子之後的翻譯終止子是NOS終止子。將產生的質粒稱為pM10Z(圖1A)。質粒pMEZ由Gagga等人(1995)描述。植物轉化和再生通過三親交配(Rogers等人，1987)將質粒pM10Z由大腸桿菌DH5α動員到根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)受體菌株pTiT37ASE中。通過葉盤法(Horsch等人，1987)轉化菸草(Nicotianatabacum cv Xanthi)。選擇轉化子並在含100μg/ml卡那黴素的MS培養基上再生，苗在接種後4-6周內出現。將苗在不含激素的相同培養基上生根，並轉移至土壤。
為了獲得包含由CaMV 35S啟動子驅動的兩種玉米醇溶蛋白基因的10kD玉米醇溶蛋白/15kD玉米醇溶蛋白植株，將包含pM10Z或pMEZ的菸草轉化子雜交，並將獲得的種子在含200μg/ml卡那黴素的培養基上發芽。使用15kD玉米醇溶蛋白和10kD玉米醇溶蛋白抗體，對來自幼苗的蛋白質提取物進行Western分析。將表達兩種玉米醇溶蛋白基因的植株(10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株)和親本植株(10kD玉米醇溶蛋白和15kD玉米醇溶蛋白植株)用於所有比較性分析。玉米醇溶蛋白提取和Western分析將植物組織磨碎，在磷酸鹽緩衝液(PBS)中提取，並離心。使用Bradford實驗(BIO-RAD)將上清液用於蛋白質測定。將來自離心的沉澱在含1％巰基乙醇的70％乙醇中於65℃溫育30分鐘以提取玉米醇溶蛋白。對於Western分析，將EtOH可提取部分(相當於已知量的PBS可溶性蛋白質提取物)進行SDS-PAGE(Laemmli，1970)，隨後轉硝酸纖維素膜。將膜在含0.05％吐溫20的Tris緩衝液(TBST)中用1％BSA封閉1-2小時，隨後在含適當抗體的相同緩衝液中溫育過夜。10kD玉米醇溶蛋白單克隆抗體由DEKALB Genetics公司提供，10kD玉米醇溶蛋白多克隆抗體由Dr.J.Messing提供，15kD玉米醇溶蛋白多克隆抗體由Dr.B.Larkins提供。使用鹼性磷酸酯酶偶聯的二抗(在多克隆抗體的情況中，使用山羊抗體或兔IgG；在單克隆抗體的情況中，使用小鼠IgG)和底物氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸，根據製造商的指示(Promega)，將與抗體反應的蛋白質條帶顯色。10kD玉米醇溶蛋白的單克隆和多克隆抗體在10kD玉米醇溶蛋白植株的Western分析和免疫定位上都給出了相似的結果，但是多克隆抗體顯示一定程度與15kD玉米醇溶蛋白的交叉反應性，因此，在我們所有涉及親本和雜交後代的比較性分析中只使用單克隆抗體。BiP分析將來自不同植株的葉的磷酸鹽緩衝液(PBS)可溶性提取物進行SDS-PAGE，隨後使用玉米BiP的多克隆抗體(由Dr.R.Boston提供)，使用上文玉米醇溶蛋白提取和Western分析部分中描述的步驟，進行Western分析。葉盤的體內標記將來自年輕、正擴展的葉的四個葉盤(直徑7mm)在含120μci 35S甲硫氨酸(比活1047ci/mMol)的120μl標記混和液(1mM磷酸鉀，pH6，1％蔗糖，50μg氯黴素)中在光照下溫育2小時。然後將圓片用溫育緩衝液清洗乾淨，並將樣品在冷的PBS中磨碎。在PBS中提取樣品，估計PBS可溶性部分中的蛋白質，並如Gagga等人(1995)所述由沉澱回收玉米醇溶蛋白。通過SDS-PAGE對蛋白質進行分析，隨後在PVDF膜(Millipore)上進行電印跡。對膜噴灑Enhance(NEN)，空氣乾燥，並使X射線膠片暴光。電子顯微鏡檢查法將小片葉和種子組織在含2.5％戊二醛的0.07M二甲胂酸鈉緩衝液中固定2小時，然後在1％水溶四氧化鋨中後固定1小時。將樣品在EtOH中脫水，並在Spurr氏樹脂中於70℃包埋。然後將銅網上的銀色部分在醋酸雙氧鈾和Reynold氏檸檬酸鉛中染色。在日立H7000透射電鏡中檢查柵網。免疫電子顯微鏡檢查法將小片葉和種子組織在含4％聚甲醛和0.6％戊二醛及0.1M蔗糖的0.33M磷酸鈉/鉀緩衝液(pH7.3)中在冰上固定2小時。將組織用含7％蔗糖的緩衝液清洗3次，並在最後一次的緩衝液中於4℃保存過夜。這一階段使用兩種不同方案將經固定組織在EtOH中脫水，用Lowicryl於-10℃浸潤，並將樹脂在UV光下於-10℃聚合24小時，然後於室溫24小時。在第二種方案中，將組織在EtOH中脫水，在Spurr氏樹脂或LR White樹脂中包埋，並於50℃聚合。剩餘步驟都在室溫進行。(不同的樹脂購自EIecton Microscopy Sciences，Ft.Washington，PA)。首先將鎳網上的銀色部分在封閉液，含1％BSA(Sigma)、0.05％吐溫20(Sigma)、和15mM NaCl的10mMTris緩衝液中溫育。此緩衝混和液用於所有剩餘步驟。對於免疫標記的種子部分，向封閉液中加入來自抗體動物來源的5-20％的正常血清，以降低非特異性染色。
用10kD玉米醇溶蛋白抗體進行免疫標記將10kD和10kD/15kD玉米醇溶蛋白雜種切片的柵網吸乾，並與在緩衝液中1∶50稀釋的10kD玉米醇溶蛋白單克隆抗體一起溫育45分鐘-4小時。將對照與未免疫小鼠IgG一起溫育。然後將它們在緩衝液中清洗，並在用緩衝液1∶50稀釋的金標記的、直徑10nm的山羊抗小鼠IgG(Sigma)保存45分鐘。在來自10kD玉米醇溶蛋白植株的切片的情況中，將柵網與用緩衝液1∶1000稀釋的多克隆兔抗10kD玉米醇溶蛋白一起溫育60分鐘。然後將它們清洗，並在1∶50稀釋的金綴合的、直徑5nm的抗兔IgG中溫育60分鐘。由於多克隆10kD玉米醇溶蛋白抗體與15kD玉米醇溶蛋白交叉反應，所以在10kD/15kD玉米醇溶蛋白雜種的情況中，將柵網與10kD玉米醇溶蛋白單克隆抗體一起溫育，隨後是金綴合的、直徑10nm的抗小鼠IgG。將柵網在含吐溫20和1％BSA的Tris緩衝液中清洗，隨後用雙蒸水。然後檢查未染色的或者在醋酸雙氧鋨和檸檬酸鉛中輕微後染色的柵網。
用10kD和15kD玉米醇溶蛋白抗體進行雙重標記將柵網在1∶100稀釋的兔抗15kD玉米醇溶蛋白中溫育45-60分鐘。清洗柵網，並在1∶50稀釋的金綴合的、直徑5nm的山羊抗兔IgG中溫育45-60分鐘。然後在緩衝液中徹底清洗柵網，與用緩衝液1∶50稀釋的小鼠抗10kD玉米醇溶蛋白一起溫育45-60分鐘。然後用緩衝液清洗柵網，隨後用蒸餾水，並在用緩衝液1∶50稀釋的金綴合的、直徑10nm的山羊抗小鼠IgG中溫育45分鐘。用含吐溫20和1％BSA的Tris緩衝液清洗柵網，隨後用雙蒸水。然後檢查未染色的或者在醋酸雙氧鋨和檸檬酸鉛中輕微後染色的柵網。
下文是例示本發明某些實施方案的實施例。這些實施例是例示性的，不應當解釋為以任何方式對本發明的限制。實施例1-15kD和10kD玉米醇溶蛋白在L.japonicus和苜蓿的營養組織中的積累將受CaMV 35S啟動子控制的15kD和10kD玉米醇溶蛋白的編碼序列導入L.japonicus和苜蓿(Regen SY)。如圖1和2所示，兩種玉米醇溶蛋白在所有轉化子的營養組織中顯示高水平積累(佔總蛋白質的1-2％)。相反的，由CaMV 35S啟動子驅動的β-菜豆蛋白基因顯示轉錄本的組成性積累，但是只有種子顯示蛋白質的特異性積累。這些結果說明玉米醇溶蛋白在營養組織中是穩定的，而作為液泡蛋白質的β-菜豆蛋白則不然。玉米醇溶蛋白的穩定性可以歸功於蛋白質的內在特性或其亞細胞定位。實施例2-玉米醇溶蛋白在菸草轉化子的營養組織中的積累用包含由CaMV 35S啟動子驅動的10kD玉米醇溶蛋白基因的基因構建體pM10Z(圖3A)轉化菸草植物。將來自7株隨機選取的獨立轉化子的葉進行Western分析，以測量10kD玉米醇溶蛋白的積累(圖3B)。所有轉化子顯示兩種免疫反應蛋白質，一條帶隨來自玉米種子的10kD玉米醇溶蛋白(由箭頭表明的位置)共遷移，另一條帶是29kD條帶。後者不隨在玉米種子中看見的較大分子量的免疫反應條帶共遷移(圖3C)。由轉基因植株的葉獲得的29kD免疫反應條帶可能表示10kD玉米醇溶蛋白與另一種內源葉蛋白質的聚集物。相似的，玉米種子中的20kD免疫反應蛋白質可能表示10kD玉米醇溶蛋白與內源玉米蛋白質的聚集物。在不同的轉化子中，10kD和29kD免疫反應條帶的積累量差別大約10倍。轉化子4顯示的兩種免疫反應條帶的水平幾乎可以忽略。在各個轉化子中，10kD玉米醇溶蛋白積累量的差異可能歸咎於位置效應或整合基因的拷貝數。
為了測定不同植物部分間的10kD玉米醇溶蛋白的積累量，將來自轉化子6的葉、莖、根、和種子的等量蛋白質提取物(相當於50μgPBS可溶性蛋白質)，與玉米種子提取物(相當於2μg PBS可溶性蛋白質)一起，進行Western分析(圖3C)。葉顯示10kD玉米醇溶蛋白積累的最高水平，隨後是莖。種子的10kD玉米醇溶蛋白水平比葉低大約10倍，正如轉基因菸草中的15kD玉米醇溶蛋白的情況(Bagga等人，1995)。總之，我們的結果說明10kD玉米醇溶蛋白在轉基因菸草的所有器官中積累至顯著水平，正如我們以前關於15kD玉米醇溶蛋白的報導(Bagga等人，1995)。實施例3-玉米醇溶蛋白在發芽的菸草種子中的穩定性以前已經顯示轉基因菸草種子中的15kD玉米醇溶蛋白在發芽過程中不被蛋白水解消化(Hoffman等人，1987；Bagga等人，1997)。為了確定10kD玉米醇溶蛋白是否類似，將來自10kD玉米醇溶蛋白植株的種子進行不同時間(0-10天)的發芽，收穫種子/幼苗，提取它們的乙醇可溶性蛋白質，並使用10kD玉米醇溶蛋白抗體進行Western分析(圖4)。10kD玉米醇溶蛋白的水平在發芽的最初4天基本保持不變，此後其水平顯示濃度顯著增加。在發芽後第0天與第1天之間(DAG)觀察到10kD玉米醇溶蛋白水平略微下降，但是此後水平維持至4DAG。由3DAG樣品觀察到的下降在不同的實驗中不一致，這歸咎於泳道中蛋白質提取物的上樣量較小。4DAG時間點與第一組綠葉的出現一致，可能與發育幼苗中CaMV 35S啟動子的激活有關。免疫反應的10kD玉米醇溶蛋白條帶在來自幼苗階段的蛋白質的SDS-凝膠中還顯得相當彌散，正如由葉樣品觀察到的，說明葉在乙醇可溶性蛋白質部分中具有一些物質妨礙了10kD玉米醇溶蛋白的遷移。這些結果說明10kD玉米醇溶蛋白在菸草種子的發芽過程中不降解。實施例4-15kD和10kD玉米醇溶蛋白在轉基因植株的新的蛋白體中的免疫定位為了理解15kD和10kD玉米醇溶蛋白在轉基因植株的葉中的穩定性的基礎，檢查了這些蛋白質在亞細胞水平的定位。將轉化子的葉，與對照植株一起，進行超微結構分析，隨後是免疫細胞化學(使用15kD和10kD玉米醇溶蛋白抗體)。15kD玉米醇溶蛋白顯得均一分布於沿RER排列的獨特花結形蛋白體中(Gagga等人，1995，附錄)。這些蛋白體還在表達15kD玉米醇溶蛋白基因的L.japonicus和苜蓿中發現。
還在來自表達10kD玉米醇溶蛋白的轉基因菸草的葉組織上進行了電鏡檢查，以檢驗任何蛋白體的存在。如圖5A和圖5B所示，在10kD玉米醇溶蛋白植株的葉中看到與15kD玉米醇溶蛋白蛋白體(圖5C)非常不同的蛋白體。10kD玉米醇溶蛋白植株中的蛋白體顯得很嗜高滲，嗜高滲物(osmophilia)濃縮在(蛋白質)體的周圍。在一些雜種切片中，嗜高滲物顯得由中心不連續放射(圖5B)。在15kD玉米醇溶蛋白植株中看到的蛋白體不展示這種極端嗜高滲物(圖5C)。在一些葉切片中，發現10kD玉米醇溶蛋白蛋白體與ER相關，但是在大多數情況中，由於蛋白體的體形較大，ER膜顯得不連續。根據免疫定位，發現10kD玉米醇溶蛋白平衡分布於這些獨特蛋白體中，說明它們由10kD玉米醇溶蛋白裝配產生(圖5D)。實施例5-15kD和10kD玉米醇溶蛋白在表達這兩種基因的轉化子中的同時積累表達15kD或10kD玉米醇溶蛋白的菸草轉化子之間進行有性雜交，以確定這些蛋白質是否相互作用並影響在植物細胞中的蛋白質積累。將來自這些雜種的種子在200μg/ml卡那黴素上發芽，並使用15kD和10kD玉米醇溶蛋白基因特異引物，根據陽性PCR選擇表達兩種基因的幼苗。使用15kD和10kD玉米醇溶蛋白抗體，通過免疫印跡，對來自表達兩種基因的兩株獨立植株及其親本的葉的蛋白質提取物進行分析。15kD玉米醇溶蛋白的積累在兩親本和10kD/15kD玉米醇溶蛋白雜交植株中顯得相似，而10kD/15kD玉米醇溶蛋白雜交植株中的10kD玉米醇溶蛋白積累比相應的10kD玉米醇溶蛋白親本高許多倍。
為了測定10kD玉米醇溶蛋白由於與15kD玉米醇溶蛋白的共表達而增加的精確水平，將來自一株10kD玉米醇溶蛋白植株、一株15kD玉米醇溶蛋白植株、和相應的10kD/15kD玉米醇溶蛋白雜種的葉和種子的等量蛋白體提取物進行Western分析，隨後使用智能定量儀(BioImage)對免疫反應條帶進行定量(圖6)。此定量分析顯示，10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株的種子和葉中的15kD玉米醇溶蛋白水平，與15kD玉米醇溶蛋白親本植株基本相似(圖6C和6D)。然而，10kD玉米醇溶蛋白在10kD/15kD玉米醇溶蛋白雜種的葉和種子中的量比親本植株高4-5倍(圖6A和6B)。由於用於形成印跡的兩種抗體的抗原性和濃度差異，15kD和10kD玉米醇溶蛋白在雜種與親本系中的水平不能直接進行比較。這些結果還確認了以前的研究，指出葉比種子積累更多的玉米醇溶蛋白。注意，在10kD玉米醇溶蛋白的情況中(圖6A和6B)，凝膠上的蛋白質上樣量是葉樣品10μg，種子樣品50μg。實施例6-10kD玉米醇溶蛋白與15kD玉米醇溶蛋白在共表達10kD和15kD玉米醇溶蛋白基因的植株中定位於同一ER衍生蛋白體10kD玉米醇溶蛋白在10kD/15kD玉米醇溶蛋白雜種中的積累比單單10kD玉米醇溶蛋白植株增加，暗示10kD與15kD玉米醇溶蛋白之間存在某種相互作用。來自10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株的葉組織的電鏡和免疫細胞化學，只顯示通常是15kD玉米醇溶蛋白的ER衍生蛋白體(圖7A)。我們沒有觀察到任何與在10kD玉米醇溶蛋白植株中檢測到的相似的蛋白體。然而，10kD玉米醇溶蛋白的免疫定位顯示，蛋白質限制於15kD玉米醇溶蛋白蛋白體中(圖7B)。為了確定10kD玉米醇溶蛋白和15kD玉米醇溶蛋白是否都位於15kD玉米醇溶蛋白蛋白體中，我們使用10kD玉米醇溶蛋白的單克隆抗體和15kD玉米醇溶蛋白的多克隆抗體，對10kD/15kD玉米醇溶蛋白植株的葉和種子切片進行了雙重標記免疫細胞化學。10kD玉米醇溶蛋白(由較大的10nm金顆粒表示)和15kD玉米醇溶蛋白(由較小的5nm金顆粒表示)都免疫定位於同一15kD玉米醇溶蛋白蛋白體中(圖7C和7D)。因此，15kD和10kD玉米醇溶蛋白經證明有相互作用，且這種相互作用穩定了這兩種蛋白質。實施例7-將多拷貝的15kD和10kD玉米醇溶蛋白基因導入苜蓿作為提高含S-胺基酸蛋白質總葉含量的方法，可以將多拷貝的15kD和10kD基因導入植物。除了那些採用35S啟動子的構建體，可以使用由SSU啟動子和甘露鹼合酶啟動子驅動的基因構建體，以避免任何潛在的共抑制問題。可以有性形成攜帶10kD、15kD、或10kD和15kD玉米醇溶蛋白二者的構建體的同基因種群。根據種群中期望玉米醇溶蛋白構建體的平均數目的一般性比較，可以確定玉米醇溶蛋白劑量在苜蓿中對表達「自身」的影響、構建體之間的相互作用、和每種構建體對植物發育、飼料品質、和產量的影響。還可以檢查來自3個種群的遺傳學定義的基因型，這三個種群分別攜帶1-4個拷貝的10kD或15kD構建體，或者1-2個拷貝的10kD和15kD二者構建體。有性增加再生體細胞克隆中玉米醇溶蛋白拷貝數的最直接方法是，自花授粉個體再生或雜交。然而，在這種情況中，雜交再生在遺傳學上等同於自交。為了使同系繁殖抑制的混淆效應最小化，可以形成一系列雜交種群，以檢查玉米醇溶蛋白構建體對苜蓿的飼料產量和品質的影響。實施例8-蛋白質的瘤胃消化在反芻動物中，食物首先受到棲息於動物第一個胃(瘤胃)中的微生物作用。由於這些動物自身不產生纖維素酶，植物材料中的纖維素被棲息微生物消化。然而，這些微生物還能夠破壞植物蛋白質並將釋放的胺基酸用於其自身的生長。這些瘤胃微生物隨後在通過動物的剩餘消化道時降解，由此提供重要的蛋白質和其它營養來源。然而，很大部分的這些蛋白質在排洩到尿中的氮中是脫氨的。這不僅降低了食料的營養品質，還導致過度的氮環境汙染。當在使牛奶產量最大化的努力中給予反芻動物以很高蛋白質食物時，問題惡化了。胺基酸補充物(如甲硫氨酸或賴氨酸)也在瘤胃中基本降解，因此發展了多種瘤胃防護胺基酸補充物。由此，極其期望餵以對微生物降解更有抗性的完整蛋白質。由此，重要的是確定玉米醇溶蛋白是否能夠被瘤胃細菌降解，並確定玉米醇溶蛋白是否能夠被反芻動物胃中的酶消化。
使用研缽和乳杵加工植物組織。將樣品置於DACRON聚酯袋中(孔徑52μm)。每種樣品保留大約0.3g用於比較目的，將剩餘量在插管的Holstein(荷蘭的一種乳牛)母牛瘤胃中溫育12小時。然後由瘤胃中取出袋子，清洗，並在60℃烘箱中乾燥過夜。通過免疫學(Western印跡)和染色步驟，監測15kD玉米醇溶蛋白和10kD玉米醇溶蛋白。監測瘤胃細菌高度降解的核酮糖二磷酸羧化酶(Nugent等人，1983)，作為內在對照。處理後觀察到很低水平的玉米醇溶蛋白降解，而核酮糖二磷酸羧化酶完全降解。測定經處理和未處理樣品中的玉米醇溶蛋白水平，以進行比較。還確定了玉米醇溶蛋白被反芻動物的胃酶降解。實施例9-表達玉米醇溶蛋白基因的轉基因植株中的BiP誘導由於BiP(一種內源植物蛋白質)在醇溶蛋白蛋白體的生源論中發揮作用(Li等人，1993a；Zhang和Boston，1991)，推論BiP可能在轉基因菸草植株的玉米醇溶蛋白蛋白體的形成中發揮作用。為了測試BiP是否在產生玉米醇溶蛋白蛋白體的植物中升高，使用玉米BiP抗體，對來自δ-玉米醇溶蛋白、β-玉米醇溶蛋白、和δ-/β-玉米醇溶蛋白植株的葉的蛋白質樣品進行定量Western分析(Zhang和Bostong，1992)。來自在系統條件下生長的相同發育階段的對照植株和3株轉基因植株(δ-、β-、和δ-/β-玉米醇溶蛋白植株)的PBS可溶性樣品(100μg)，與1μg來自玉米的純化BiP一起，進行SDS-PAGE，隨後Western分析(圖8，上圖)。然後使用智能定量儀分析免疫反應條帶。圖8中的下圖是表示免疫反應條帶相對亮度的示意圖。所有3株轉基因植株顯示的BiP積累水平都顯著比對照高；3株轉化子中的BiP水平或多或少有些相似。因此，轉基因植株中的玉米醇溶蛋白合成誘導了BiP的合成或穩定積累。實施例10-用於植物害蟲控制目的的蛋白質的表達和固定設計了包含以符合讀框地融合在稻胱蛋白I(OCI)蛋白酶抑制劑基因前端的10kD玉米醇溶蛋白基因(Z10)的嵌合基因(Z10/OCT)，以增強OCI在用於控制植物害蟲的轉基因植株中穩定性和有效性。嵌合基因包含10kD玉米醇溶蛋白的編碼區和信號肽區，以及OCI的編碼區，由組成性的CaMV 35S啟動子控制。用OCI和10kD玉米醇溶蛋白抗體進行探查的Western印跡證明，大約26kD的預期蛋白質產物在用嵌合基因轉化的植物中表達。我們以前已經顯示了，當使用玉米醇溶蛋白抗體進行探查時，用10kD玉米醇溶蛋白單獨轉化的植物表達期望蛋白質產物，而當用OCI抗體進行探查時，用OCI單獨轉化的植物不顯示可檢測的表達。這個觀察結果顯示Z10/OCI嵌合基因導致OCI的穩定性增加，並且，根據玉米醇溶蛋白趨向定位於封閉蛋白體中的發現，進一步證明蛋白質產物相當穩定。別人已經報導了蛋白酶抑制劑對多種植物害蟲的有效性，包括科羅拉多馬鈴薯甲蟲和植物寄生線蟲。實施例11-表達10kD玉米醇溶蛋白/OCI融合蛋白的轉基因植株的構建使用剪接重疊延伸(SOE)技術(R.M.Horton等人，1989)，構建了10kDsp10kD玉米醇溶蛋白OC-I(Z10/OCI)融合體。此技術利用聚合酶鏈式反應(PCR)將兩種分開的片段剪接在一起。首先使用下列引物通過PCR由質粒prep(993)Z10pMON316/DH5α擴增Z10片段SEQ ID NO1PA(CTACAAGATCTGATATCATCGATG)和SEQ ID NO2PB(GACATGGATCCGAATGCAGCAC)從而產生長度大約500鹼基對(bp)的產物。使用下列引物由質粒(809)OclpSP73/DH5α擴增OC-I片段
SEQ ID NO3PC(GTGCTGCATTCGGATCCATGTCG)和SEQ ID NO4PD(CCGGTACCCTTAAATCGATGC)從而產生322bp片段的產物。將兩種PCR產物以相同濃度混和，並作為模板用於第二輪PCR反應。為了獲得期望的Z10/OCI片段，使用引物PA和PD產生800bp的產物。引物序列PA、PB、和PC中的粗體較大核苷酸表示取自Z10片段的序列。引物序列PB、PC、和PD中的較小核苷酸表示取自Ocl的序列。粗體核苷酸來自Z10序列，較小核苷酸來自Ocl序列。圖9中的引物序列標了下劃線，引物名稱在引物序列的上面或下面以粗體標出。圖9中標了下劃線的引物序列PB和PD與上文所列PB和PD序列的反向互補。引物的取向由箭頭標明。
為了將此片段克隆到NewpFLAG-1(NPF-1)中，加入Klenow和dNTP將PCR片段補平末端，並與用EcoRI消化並用Klenow和dNTP補平末端的NPF-1連接。連接Z10/OCINPF-1，並轉化到DH5α感受態細胞中。一旦通過PCR確認了插入片段的存在，用IPTG誘導Z10/OCINPF-1，並將誘導的蛋白質進行Western印跡。使用3份蛋白質樣品，用Z10、OC-I、和FLAG多克隆抗體探查。與所有3種抗體發生反應證明讀碼框中的完整構建。此Western印跡數據，與序列分析一起，確認了核苷酸序列的正確性。序列分析對於確認沒有引入PCR誘導差錯是重要的。然而，在測序之前，用BglII和KpnI消化構建體，並連接到相似消化的pSP73中。實施例12-菸草葉盤轉化為了轉化菸草植物，需要將構建體亞克隆到質粒pGG中。將Z10/OCINPF-1和pGG都用BglII和KpnI消化，連接，並轉化到DH5α中。用PCR確認插入片段的存在。圖10是Z10/OCI的構建圖。質粒pGG-2是pMON316的衍生物(Rogers等人，1987)，加入了AMV外殼蛋白以增強翻譯(D.V.Sutton等人，1992)。使用與pTiT37SE的三親交配(Rogers等人，見上文)共整合含Z10/OCI插入片段的pGG-2。通過Horsch等人的方法(Horsch等人，1985)，轉化菸草葉盤。當看見個別菸草苗時，將它們轉移至含頭孢氨噻肟(500μg/ml)和卡那黴素(100μg/ml)的Murashige和Skoog培養基(T.Murashige和F.Skoog，1962)。然後通過Western印跡對個別植株測試蛋白質表達。
圖11A和11B的Western印跡顯示與Z10和OCI抗體的陽性反應。
應當這樣理解，此處所述實施例和實施方案只是為了例示性目的，本領域技術人員將根據它們提出各種修飾或改變，並包含於本申請的精神和範圍以及所附權利要求的範圍之內。
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權利要求
1.一種包含貯藏蛋白的植物或植物組織，該蛋白質在所述植物或植物組織的營養組織中以蛋白體的形式表達並積累。
2.權利要求1的植物或植物組織，其中所述貯藏蛋白是瘤胃穩定的。
3.權利要求2的植物或植物組織，其中所述瘤胃穩定蛋白質是玉米醇溶蛋白。
4.權利要求3的植物或植物組織，其中所述玉米醇溶蛋白選自15kD玉米醇溶蛋白和10kD玉米醇溶蛋白。
5.權利要求1的植物或植物組織，其中所述植物共表達15kD和10kD玉米醇溶蛋白。
6.權利要求1的植物或植物組織，其中所述貯藏蛋白在所述植物或植物組織中組成性表達。
7.一種提高植物的飼料品質的方法，包括用編碼貯藏蛋白的多核苷酸分子轉化植物或植物組織，所述貯藏蛋白在所述植物或植物組織的營養組織中以蛋白體的形式表達並積累。
8.權利要求7的方法，其中所述貯藏蛋白是瘤胃穩定的。
9.權利要求8的方法，其中所述瘤胃穩定蛋白質是玉米醇溶蛋白。
10.權利要求9的方法，其中所述玉米醇溶蛋白選自15kD玉米醇溶蛋白和10kD玉米醇溶蛋白。
11.權利要求7的方法，其中所述植物共表達15kD和10kD玉米醇溶蛋白。
12.一種提高外源蛋白質在植物中穩定性和貯藏的方法，包括用編碼貯藏蛋白的多核苷酸分子轉化表達異源蛋白質的植物或植物組織，所述貯藏蛋白在所述植物或植物組織的營養組織中以蛋白體的形式表達並積累。
13.權利要求12的方法，其中所述貯藏蛋白是瘤胃穩定的。
14.權利要求13的方法，其中所述瘤胃穩定蛋白質是玉米醇溶蛋白。
15.權利要求14的方法，其中所述玉米醇溶蛋白選自15kD玉米醇溶蛋白和10kD玉米醇溶蛋白。
16.權利要求12的方法，其中所述植物共表達15kD和10kD玉米醇溶蛋白。
17.一種包含瘤胃穩定蛋白體的組合物，其中所述蛋白體在植物中表達並積累。
18.權利要求17的組合物，其中所述蛋白體包含玉米醇溶蛋白。
19.權利要求18的組合物，其中所述玉米醇溶蛋白選自15kD和10kD玉米醇溶蛋白。
20.權利要求17的組合物，其中所述蛋白體包含15kD和10kD玉米醇溶蛋白。
全文摘要
本發明涉及用於轉化能夠高水平表達穩定蛋白質的植物和植物組織的材料和方法,這些蛋白質在植物細胞中以蛋白體的形式存在。本發明公開了高水平共表達15kD和10kD玉米醇溶蛋白的經轉化植物,這些蛋白質在植物的營養性組織中高水平積累。共表達15kD和10kD玉米醇溶蛋白的經轉化植物可用於提供飼料農作物,所述農作物含有增加的含硫胺基酸(諸如甲硫氨酸)的水平,從而提高通常以這些農作物為食的動物的食物中含硫胺基酸(諸如甲硫氨酸)的水平。本發明還涵蓋經轉化包含穩定蛋白體的經轉化的植物或植物組織,這些蛋白體包含異源蛋白質物質。在一個實施方案中,穩定的蛋白體在植物或植物組織中以包含玉米醇溶蛋白與可操作連接的蛋白質或肽的融合蛋白表達。本發明提供的蛋白體對瘤胃消化或環境降解有抗性。
文檔編號C12N5/10GK1334877SQ99816020
公開日2002年2月6日 申請日期1999年4月16日 優先權日1998年12月31日
發明者S·拜嘉, C·森古普塔－戈帕蘭, J·D·肯普 申請人:新墨西哥州立大學技術轉讓公司