I型幹擾素在誘導atx蛋白表達中的應用的製作方法
2023-09-14 23:44:00 1
I型幹擾素在誘導atx蛋白表達中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種I型幹擾素的新用途。該新用途為I型幹擾素在如下任一中的應用:a1)在免疫細胞中誘導ATX蛋白表達;a2)製備具有在免疫細胞中誘導ATX蛋白表達的功能的產品。實驗證明,I型幹擾素通過I型幹擾素受體(IFNAR)激活JAK-STAT、PI3K-AKT和NF-κB等信號通路誘導免疫細胞中ATX的表達,這些通路的抑制劑及相關基因siRNA能抑制I型幹擾素誘導的ATX表達;TLR激活可誘導免疫細胞中ATX的表達,而且這種感染相關的ATX誘導表達是由I型幹擾素介導的;與炎症反應和自身免疫相關的細胞因子TNF-α和IFN-γ能協同促進免疫細胞中ATX的表達,這一過程同樣依賴於I型幹擾素的產生和I型幹擾素下遊通路。本發明揭示了I型幹擾素誘導免疫細胞中ATX表達的新功能,對I型幹擾素的臨床應用和ATX-LPA通路相關疾病的幹預治療具有重要意義。
【專利說明】I型幹擾素在誘導ATX蛋白表達中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】,涉及一種I型幹擾素的新用途,特別涉及I型幹擾素在 誘導ATX蛋白表達中的應用。
【背景技術】
[0002] 早在1957年,Isaacs和Lindenmann發現了 I型幹擾素。正是由於它能夠"幹擾" 病毒的複製,由此命名為幹擾素(interferon,IFN)。幹擾素是一類廣泛表達的信號因子,具 有很強的抗病毒和生長抑制作用。這些因子是抵禦病毒侵染的第一道防線,在對惡性細胞 的免疫監視過程中發揮重要作用。幹擾素可以分為兩種類型:1型幹擾素和II型幹擾素 。I 型幹擾素包括13種幹擾素-α和幹擾素 -β ;11型幹擾素即幹擾素-Y。I型幹擾素與位 於細胞膜上的I型幹擾素受體(IFNAR)結合,從而激活相應的信號通路,調控相關基因的表 達,發揮生物學功能。這些信號通路包括JAK-STAT、p38MAPK、ERK、PI3K-AKT和NF- κ B等。
[0003] I型幹擾素的表達主要受到模式識別受體的控制,這些受體可以識別外源微生 物保守的獨特的模式分子。可以誘導I型幹擾素表達的模式識別受體可以分為兩類: Toll-Iike受體(TLR)和RIG-I-Iike解旋酶(RLHs)。RLHs廣泛表達在各類細胞的細胞質 中,可以識別侵染病毒產生的dsRNA。TLRs主要定位於細胞表面或者內體中,可以識別細 菌、病毒等微生物的特定組分。當細菌或病毒侵染機體時,被相應的模式識別受體識別,從 而誘導I型幹擾素的表達。I型幹擾素參與許多TLR相關的基因表達調控,並可以直接作用 於免疫細胞,在抗感染免疫中發揮重要的作用。
[0004] Autotaxin (ATX)是核苷酸焦憐酸酶/憐酸二酯酶(nucleotide pyrophosphatase, NPP)家族中的一員即NPP2,最早從人黑素瘤細胞A2058的條件培養基中 分離獲得,是一個分泌型糖蛋白。它具有IysoPLD活性,其主要生理功能是催化溶血磷脂膽 鹼(LPC)水解生成溶血磷脂酸(LPA)。LPA通過細胞表面的受體發揮生物學功能,可以促進 細胞的存活、增殖和遷移。人們發現在生理狀況下,ATX是在血管發育、神經系統的發育所 必須的。在疾病狀態下,ATX是惡性腫瘤中表達發生最顯著上調的40個基因之一;ATX/LPA 可以促進腫瘤細胞的遷移,被認為是腫瘤治療的重要靶點之一。ATX-LPA通路與多種炎症相 關疾病有關。在微生物重複侵染的狀態下,急性炎症轉變成慢性炎症,ATX-LPA通路促使更 多細胞因子的產生,並聚集到組織微環境中,從而加劇病情,抑制ATX的活性則可以使症狀 減輕。這種現象在多種慢性炎症相關疾病小鼠模型的研究中得到證實,如類風溼關節炎、哮 喘、多發性硬化症等免疫相關疾病。但是免疫反應過程中ATX表達調控的機制目前還不清 楚。因此,認識ATX在炎症中的表達調控機制顯得極為迫切,具有較高臨床應用價值。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種I型幹擾素的新用途。
[0006] 本發明所提供的I型幹擾素的新用途具體為I型幹擾素在如下任一中的應用:
[0007] (al)在免疫細胞中誘導ATX蛋白(或ATX基因)表達;
[0008] (a2)製備具有在免疫細胞中誘導ATX蛋白(或ATX基因)表達的功能的產品。
[0009] 能夠促進I型幹擾素表達和/或增強I型幹擾素作用的物質在如下任一中的應用 也屬於本發明的保護範圍:
[0010] (bl)在免疫細胞中誘導ATX蛋白(或ATX基因)表達;
[0011] (b2)製備具有在免疫細胞中誘導ATX蛋白(或ATX基因)表達的功能的產品。
[0012] 本發明的另一個目的是提供一種具有在免疫細胞中誘導ATX蛋白(或ATX基因) 表達的功能的廣品。
[0013] 本發明所提供的具有在免疫細胞中誘導ATX蛋白(或ATX基因)表達的功能的產 品,其活性成分為I型幹擾素或能夠促進I型幹擾素表達和/或增強I型幹擾素作用的物 質。
[0014] 在本發明中,所述能夠促進I型幹擾素表達和/或增強I型幹擾素作用的物質具 體為如下中任一種:
[0015] (I)Toll-Iike 受體的配體;
[0016] (2)腫瘤壞死因子α和幹擾素 γ混合物。
[0017] 在(1)中,所述Toll-Iike受體的配體具體可為TLR4配體、TLR3配體或TLR9配 體;所述TLR4配體具體可為細菌脂多糖(LPS)(如Sigma-Aldrich公司產品,其產品目錄號 為L2880);所述TLR3配體具體可為poly (I: C)(如Sigma-Aldrich公司產品,其產品目錄 號為P9582);所述TLR9配體具體可為CpG寡核苷酸(如InvivoGen公司產品,其產品目錄 號為 tlrl-2216)。
[0018] 在⑵中,所述腫瘤壞死因子α (如peprotech公司產品,其產品目錄號為 300-01A)和幹擾素 γ (如p印rotech公司產品,其產品目錄號為300-02)混合物中,所述腫 瘤壞死因子α和所述幹擾素 Y的質量配比為1:1。相應的,在所述腫瘤壞死因子α和幹 擾素 Y混合物的工作液中,所述腫瘤壞死因子α和所述幹擾素 Υ的質量濃度配比為1:1, 兩者的工作濃度均為50ng/ml。
[0019] I型幹擾素信號通路抑制劑或抑制I型幹擾素產生的物質在如下任一中的應用也 屬於本發明的保護範圍:
[0020] (Cl)在免疫細胞中抑制ATX蛋白(或ATX基因)表達;
[0021] (c2)製備具有在免疫細胞中抑制ATX蛋白(或ATX基因)表達的功能的產品。
[0022] 本發明的又一個目的是提供一種具有在免疫細胞中抑制ATX蛋白(或ATX基因) 表達的功能的廣品。
[0023] 本發明所提供的具有在免疫細胞中抑制ATX蛋白(或ATX基因)表達的功能的產 品,其活性成分為I型幹擾素信號通路抑制劑或能夠抑制I型幹擾素產生的物質。
[0024] 在本發明中,所述I型幹擾素信號通路抑制劑具體為如下(a)-(c)中的任一種:所 述抑制I型幹擾素產生的物質具體為如下(d):
[0025] (a) JAK-STAT信號通路抑制劑、PI3K-AKT信號通路抑制劑或NF- κ B信號通路抑制 劑;
[0026] (b) siSTATl、siSTAT3、siAKT、siJAKl、siTYK2 或 siIFNARl ;
[0027] 所述siSTATl為序列表中序列I所示的雙鏈RNA分子;所述siSTAT3為序列表中 序列2所示的雙鏈RNA分子(核酸分子);所述SiAKT為序列表中序列3所示的雙鏈RNA分 子(核酸分子);所述siJAKl為序列表中序列4所不的雙鏈RNA分子(核酸分子);所述 siTYK2為序列表中序列5所示的雙鏈RNA分子(核酸分子);所述SiIFNARl為序列表中序 列6所不的雙鏈RNA分子(核酸分子);
[0028] (c) IFN- α中和性抗體(如P印r〇tech公司產品,其產品目錄號為500-P32AG)或 IFN-β的中和性抗體(如P印rotech公司產品,其產品目錄號為500-P32B);
[0029] (d)siIRF3 或 siIRF7 ;
[0030] 所述siIRF3為序列表中序列7所示的雙鏈RNA分子(核酸分子);所述siIRF7為 序列表中序列8所不的雙鏈RNA分子(核酸分子)。
[0031] 在本發明的一個實施例中,上述(a)中,所述JAK-STAT信號通路抑制劑具體為 Pyridone6(如Calbiochem公司產品,其產品目錄號為420099);所述PI3K-AKT信號通 路抑制劑具體為LY294002(如Sigma-Aldrich公司產品,其產品目錄號為L9908);所述 NF-κ B信號通路抑制劑具體為BAY-11-7082(如Sigma-Aldrich公司產品,其產品目錄號為 B5556)〇
[0032] 在本發明中,所述I型幹擾素具體可為IFN-α (如P印rotech公司產品,其產品目 錄號為300-02AA)或IFN-β (如P印rotech公司產品,其產品目錄號為300-02BC)。
[0033] 在本發明中,所述ATX蛋白的胺基酸序列為序列表中序列9所示,所述ATX蛋白的 編碼基因具體為序列表中序列10。
[0034] 在本發明中,所述免疫細胞具體可為如下中的任一種:THP-1細胞、外周血單個核 細胞(PBMC)、單核細胞(monocyte)、非單核細胞(Non-monocyte)或單核細胞來源的樹突狀 細胞(monocyte derived dendritic cell,moDC)〇
[0035] 實驗證明,1型幹擾素(正^〇和正^3)可以通過從1(-5了41\?131(-41(1'和嚦-1^ 通路誘導免疫細胞中ATX的表達。這些通路的抑制劑以及相關基因 siRNA能夠抑制I型幹 擾素誘導的ATX表達。同時,本發明的發明人還發現感染免疫中TLR的激活可以誘導ATX 的表達,而且這種感染相關的ATX誘導表達是由I型幹擾素介導的。IFN-β的中和性抗體、 IFNARl的siRNA以及IFN-β信號通路的抑制劑均能夠抑制TLR4配體細菌脂多糖(LPS)、 TLR9配體CpG寡核苷酸以及TLR3配體poly (I:C)誘導的ATX表達。此外,與炎症反應和自 身免疫相關的細胞因子TNF-α和IFN-Y能夠協同促進ATX的表達,這一過程同樣依賴於 I型幹擾素的產生和I型幹擾素下遊通路。這些發現不僅揭示了 I型幹擾素誘導免疫細胞 中ATX表達的新功能,而且闡釋了免疫反應過程中ATX表達調控的機制,對I型幹擾素的臨 床應用和ATX-LPA通路相關疾病的幹預治療具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0036] 圖1為I型幹擾素誘導免疫細胞中ATX表達。A :THP-1人單核細胞;B :PBMC、 monocyte以及Non-monocyte ;C :人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、T細胞系Jurkat、以及幾種腫 瘤細胞系(冊1(293、51480、4549和]\〇 7-7)。圖中,#表示在?〈0.01水平上差異顯著。
[0037] 圖2為PI3K抑制劑LY、JAK抑制劑P6、NF- κ B抑制劑BAY能夠抑制I型幹擾素誘 導的ATX的表達。A :THP-1細胞;B :PBMC ;C :單核細胞。圖中,林表示在P〈0. 01水平上差 異顯著。
[0038] 圖3為siAKT、siJAK、siTYK2、siSTATl和siSTAT3都可以抑制I型幹擾素誘導的 ATX 的表達。A :siAKT ;B :siJAK 和 siTYK2 ;C :siSTATl 和 siSTAT3。圖中,** 表示在 Ρ〈0· Ol 水平上差異顯著。
[0039] 圖4為TLR的激活導致ATX的表達上調。A :ΤΗΡ-1細胞;B :moDC細胞。圖中,** 表不在P〈〇. 01水平上差異顯者。
[0040] 圖 5 為 siIRF3 或者 siIRF7 抑制 TLR 介導 ATX 的表達。A :siIRF3/poly(I:C) ;B : siIRF3/LPS ;C :siIRF7/CpG。圖中,#表示在P〈0. 01水平上差異顯著。
[0041] 圖6為LPS、CpG和poly (I:C)誘導I型幹擾素的表達。
[0042] 圖7為IFN- α和IFN- β特異性中和性抗體對TLR介導的THP-I細胞中ATX表達 的影響。A:poly(I:C) ;B:LPS;C:CpG。圖中,#表示在P〈0. 01水平上差異顯著。
[0043] 圖8為IFN- α和IFN- β特異性中和性抗體對TLR介導的moDC細胞中ATX表達 的影響。A:poly(I:C) ;B:LPS。圖中,*表示在P〈0. 05水平上差異顯著,#表示在P〈0. 01 水平上差異顯著。
[0044] 圖9為SiIFNARl抑制TLR介導ATX的表達。
[0045] 圖10為腫瘤壞死因子-a (TNF-α )和幹擾素 -Y (IFN-Y )協同促進ATX表達。圖 中,表示在Ρ〈〇· 01水平上差異顯著。
[0046] 圖11為TNF- α和IFN- Y上調ATX的表達依賴於I型幹擾素 。A :TNF_ α對THP-I 細胞中IFN-β的表達具有促進作用;B :當IFN-β特異的中和性抗體存在時,TNF-α和 IFN-γ協同上調ATX表達的作用被顯著抑制;C :通過轉入SiIFNARl敲低細胞中IFNARl的 表達,阻斷I型幹擾素的信號通路,能夠抑制TNF- a和IFN- γ上調ATX表達的作用。圖中, **表示在Ρ〈〇· 01水平上差異顯著。
【具體實施方式】
[0047] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規方法。
[0048] 下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業途徑得到。
[0049] THP-I人單核細胞:購自ATCC公司,目錄號:TIB-202。用含有10% (體積分數) 的胎牛血清(Hyclone)的RPMI-1640 (Gibco)培養基培養,培養基中加入2mM L-穀氨醯胺 (Gibco),100 μ g/ml 鏈黴素(Gibco)和 100U/ml 青黴素(Gibco)。
[0050] 人臍靜脈內皮細胞(HUVEC):購自sciencell公司,目錄號:8000。T細胞系 Jurkat :購自ATCC公司,目錄號:TIB-152。腫瘤細胞系HEK293、SW480、A549和MCF-7,均購 自 ATCC 公司,目錄號分別為:〇^-1573、0(^-228、0(^-185和!^8-22。
[0051] Trizol :Invitrogen 公司;M-MLV :Promega 公司;RNAse 抑制劑:Promega 公司; BCA蛋白定量試劑盒:Thermo公司;iQ SYBR :Green supermix Bio-Rad公司;轉染試 劑 lipofectamine2000 :Invitrogen 公司;BSA :Amresco 公司;LPS :Sigma_Aldrich 公司 (產品目錄號為 L2880) ;CpG =InvivoGen 公司(產品目錄號為 tlrl-2216) ;poly(I:C): Sigma-Aldrich 公司(產品目錄號為 P9582) ; JAKs 抑制劑 Pyridone6 (P6) :Calbiochem 公司(產品目錄號為420099) ;PI3K抑制劑LY294002:Sigma-Aldrich公司(產品目錄 號為 L9908) ;NF-kB 抑制劑 BAY-ll-7082:Sigma-Aldrich 公司(產品目錄號為 B5556); 幹擾素 -β (IFN- β )中和性抗體:P印rotech公司(產品目錄號為500-P32B);幹擾 素 -α (IFN-α)中和性抗體:Peprotech公司(產品目錄號為500-P32AG) ;ECL發光顯色試 劑盒:Millipore 公司;Human IFN-α :Peprotech 公司(產品目錄號為 300-02AA) ;Human IFN-β :P印rotech 公司(產品目錄號為 300-02BC) ;Human IL4 :P印rotech 公司 200-04 ; Human GM-CSF :P 印 rotech 公司 300-03 ;TNF-a :p 印 rotech 公司(產品目錄號為 300-01A); IFN-Y :p印rotech公司(產品目錄號為300-02)。
[0052] 實施例1、I型幹擾素可以誘導免疫細胞中ATX的表達
[0053] -、I型幹擾素在THP-I人單核細胞中對ATX表達的誘導作用
[0054] 用I型幹擾素 IFN-a和IFN-β分別處理THP-I人單核細胞,通過實時定量反轉 錄PCR (qRT-PCR)和western blot分別檢測ATX mRNA和蛋白的表達水平。具體如下:
[0055] 1、用I型幹擾素 IFN- a和IFN- β分別處理THP-I人單核細胞
[0056] 分別將IFN-a (或IFN-β)加入培養有THP-I人單核細胞的細胞培養基中,使 IFN-a的終濃度為50ng/ml (使IFN-β的終濃度為10ng/ml)。處理時間設置三個時間梯 度:0h、2h 和 4h。
[0057] 2、實時定量反轉錄PCR(qRT-PCR)檢測
[0058] A. RNA 提取
[0059] (1)收集細胞樣品,用PBS溶液洗滌2遍,然後離心去上清。
[0060] (2)在沉澱中加入Iml的Trizol溶液,吹打混勻,室溫靜置5分鐘。
[0061] (3)加入氯仿(每Iml trizol加0· 2ml的氯仿),蓋緊離心管,用手劇烈搖蕩15 秒。
[0062] (4)室溫靜置5分鐘,12000g4°C離心15分鐘。
[0063] (5)將上層水相轉移到新的離心管中,加入0. 5ml異丙醇,混勻後放置10分鐘。
[0064] (6) 12000g,4°C離心 10 分鐘,棄上清。
[0065] (7)加入Iml的75% (體積分數)乙醇洗滌一次,7500g4°C離心5分鐘,棄上清, 沉澱烘乾10分鐘。
[0066] (8)加入20 μ I DEPC水溶解沉澱,放置於60°C水浴鍋溶解10分鐘。
[0067] (9)通過分光光度計測量RNA濃度,將製備好的樣品凍於-80°C冰箱儲存。
[0068] B. qRT-PCR
[0069] (1)反轉錄獲得cDNA
[0070] 取2μ g RNA,加入2μ I cKT)引物,70°C 10分鐘,立即放在冰上冷卻。按照 以下體系進行混合:加入 M-MLV5X 緩衝液 5μ 1,dNTPslOmMl μ 1,RNasinRibonuclease inhibitorO. 5 μ 1,M-MLV逆轉錄酶1 μ 1,補入DEPC水至終體積25 μ 1,將混合溶液放於 42°C水浴中反應1小時,72°C滅活10分鐘,凍存於_20°C冰箱儲存。
[0071] (2)螢光定量PCR檢測
[0072] 根據 IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)的操作手冊,利用 Bio-Rad 的 iCycleiQ real-time PCR儀器對目的基因 ATX進行檢測,結果通過Bio-Rad iQ5分析軟體進行檢測。 以GAPDH基因作為內參。
[0073] 擴增ATX基因的引物對如下:
[0074] ATX-F :5' -GACTATGACTATGATGGCTTAC-3' ;
[0075] ATX-R : 5,-GATGATGCTGTAGTAGTGAGT-3,。
[0076] 擴增GAPDH基因的引物對如下:
[0077] GAPDH-F :5,-TTAGCACCCCTGTCCAAGG-3,;
[0078] GAPDH-R : 5,-CCTACTCCTTGGAGGCCATG-3,。
[0079] 反應體系:2XRealqPCR MasterMix(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、 Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP) 25 μ I ;上遊引物Fly 1,下 遊引物虹41郵嫩模板2111。
[0080] 定量?〇?儀擴增反應條件設置:501:2111丨11;951:10111丨11;951:158--601:608(40個 循環);溶解曲線生成的反應程序為:95°C 15s,60°C 15s,95°C 15s。
[0081] 數據處理:用IQ5軟體獲得數據,用EXCEL軟體對數據進行處理分析。通過T-Test 檢驗進行統計學差異分析。
[0082] 3、western blot 檢測
[0083] Α·蛋白提取
[0084] (1)收集細胞,1500rpm離心5分鐘,棄除上清,用預冷的PBS清洗細胞沉澱兩次;
[0085] (2)吸乾殘餘的PBS,加入適量的細胞裂解液RIPA,吹打混勻,冰浴裂解30分鐘;
[0086] (3) 12000rpm4°C離心20分鐘,取上清轉移到新的離心管中;
[0087] B. BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度
[0088] (1)將溶液A和溶液B根據體積比50 :1配置成BCA工作液,充分混勻;
[0089] (2)將蛋白標準品等比稀釋至不同的濃度梯度
[0090] (3)在200 μ I BCA工作液中加入20 μ 1測量樣品,充分混勻,37°C反應30分鐘;
[0091] (4)用分光光度計選用BCA測量模式進行測量,繪製標準曲線。
[0092] C. Western 蛋白印跡
[0093] 1)電泳
[0094] 配置SDS-PAGE蛋白膠,取40 μ g樣品蛋白加入上樣緩衝液中,沸水浴5分鐘, 12000rpm離心2分鐘,冷卻後離心取上清上樣。先用80V恆壓電泳,等溴酚藍進入分離膠後 換成120V電壓進行電泳。
[0095] 2)全溼法轉膜
[0096] 將PVDF膜用甲醇活化15秒,然後放入蒸餾水中浸泡5分鐘,再放入轉膜緩衝液中 浸泡15分鐘。按照Bio-Rad溼轉儀方法進行轉膜,100V60分鐘。
[0097] 3)孵育抗體及顯色
[0098] (1)取出PVDF膜,用TBST洗滌一次,放入封閉液(5% (5g/100ml)BSA)中室溫孵 育1小時;
[0099] (2)用TBST洗漆3次,每次5分鐘,放入一抗(anti-human ATX,採用序列9所示 的ATX蛋白作為免疫原免疫兔子獲得的多克隆抗體)稀釋液中室溫孵育1小時;
[0100] (3)用TBST洗滌3次,每次5分鐘,放入二抗(羊抗兔IgG抗體,購自自北京中杉 金橋生物技術有限公司,目錄號:ZDR-5306)稀釋液中室溫孵育30分鐘;
[0101] ⑷取出膜,用TBST洗滌3次,ECL發光顯色。
[0102] 4、結果
[0103] 結果顯示,IFN-α和IFN-β均可以誘導THP-I人單核細胞中ATX的表達(圖1中 Α)。
[0104] 二、I型幹擾素在人外周血免疫細胞中對ATX表達的誘導作用
[0105] 從人外周血中分離獲得外周血單個核細胞(PBMC),然後從PBMC中分離單核細胞 (monocyte)和非單核細胞(Non-monocyte)。分別用IFN-α和IFN-β處理上述三種細胞, 通過qRT-PCR檢測ATX mRNA的表達。具體如下:
[0106] 1、三種細胞的分離
[0107] 採新鮮抗凝健康人外周血,肝素抗凝後,用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單 個核細胞(PBMC)。
[0108] 將單個核細胞(PBMC)培養於37°C 5% CO2培養箱中,貼壁3小時後,把上清移出 到另一塑料培養瓶中,以37°C預溫的RPMI1640培養基輕洗去除非貼壁的細胞並倒入培養 瓶中,貼壁細胞即為單核細胞(monocyte),非貼壁細胞即為非單核細胞(Non-monocyte)。
[0109] 2、用IFN-α和IFN-β分別處理上述三種細胞
[0110] 待處理細胞:步驟1分離得到的外周血單個核細胞(PBMC)、單核細胞(monocyte) 和非單核細胞(Non-monocyte)。
[0111] 將IFN-α (或IFN-β )加入培養有待處理細胞的細胞培養基中,使IFN-α的終濃 度為50ng/ml (使IFN-β的終濃度為10ng/ml)。IFN-a的處理時間為2小時,IFN-β的 處理時間為4小時。實驗同時設置了未經I型幹擾素處理的陰性對照。
[0112] 3、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達
[0113] 參見步驟一 2進行。
[0114] 4、結果
[0115] 結果顯不,IFN-a 和 IFN-β 均可以誘導 PBMC、monocyte 以及 Non-monocyte 中 ATX的表達(圖1中B)。
[0116] 三、I型幹擾素在其他細胞中對ATX表達的誘導作用
[0117] 本發明的發明人還用I型幹擾素處理了人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、T細胞系 Jurka,以及幾種腫瘤細胞系(HEK293、SW480、A549 和 MCF-7),通過 qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達。具體的處理方法參見步驟二2進行。qRT-PCR檢測ATX mRNA的表達參見步驟二3 進行。
[0118] 結果顯示,I型幹擾素並不能夠誘導這些細胞中ATX的表達(圖1中C)。
[0119] 上述結果表明,I型幹擾素可以誘導免疫細胞中ATX的表達,而這種作用具有較強 的細胞特異性。
[0120] 實施例2、阻斷JAK-STAT、PI3K-AKT、NF- κ B通路可以抑制I型幹擾素誘導ATX的 表達
[0121] 一、三個信號通路抑制劑P6、LY和BAY的作用
[0122] I型幹擾素通過與細胞表面的I型幹擾素受體(IFNAR)相結合,進而激活 JAK-STAT、PI3K-AKT、NF- κ B等通路。本發明的發明人通過qRT-PCR檢測了相關通路的抑 製劑對IFN-α和IFN-β誘導ATX的表達影響。具體操作如下:
[0123] 待處理細胞:THP-I人單核細胞、外周血單個核細胞(PBMC)和單核細胞 (monocyte)〇
[0124] 供試信號通路抑制劑JAK-STAT信號通路的抑制劑Pyridone6 (P6)、PI3K-AKT信 號通路的抑制劑LY294002 (LY)以及NF- κ B信號通路的抑制劑BAY-11-7082 (BAY)。
[0125] 向培養有待處理細胞的細胞培養基中加入供試信號通路抑制劑,使供試信號通路 抑制劑的終濃度均為10μM;半小時後,再向其中加入IFN-α(或IFN-β),使IFN-α的終 濃度為50ng/ml (使IFN- β的終濃度為lOng/ml)。IFN- a的處理時間為2小時,IFN- β的 處理時間為4小時。
[0126] 通過qRT-PCR檢測ATX mRNA表達水平(參見實施例1步驟二3進行)。
[0127] 結果表明,JAK-STAT信號通路的抑制劑Pyridone6 (P6)、PI3K-AKT信號通路的抑 製劑LY294002 (LY)以及NF- κ B信號通路的抑制劑BAY-11-7082 (BAY)都能顯著抑制I型 幹擾素誘導的ATX表達(圖2)。
[0128] 二、siAKT、siJAKl、siTYK2、siSTATl 和 siSTAT3 的作用
[0129] 本發明的發明人還通過RNAi技術敲低相關信號通路中重要組分,進一步驗證這 些通路在IFN-a和IFN-β誘導ATX表達中的作用。具體如下:
[0130] UsiRNA 的合成
[0131] SiRNA(雙鏈)由上海吉馬公司按照表格中序列進行合成。
[0132] siSTATl :5, -GCUUCUUGGUCCUAACGCC-3'(序列 1);
[0133] siSTAT3 :5, -CCACUUUGGUGUUUCAUAA-3'(序列 2);
[0134] siAKT :5' -GCUGGAGAACCUCAUGCUG-3,(序列 3);
[0135] siJAKl :5' -GACAUGAUAUUGAGAACGA-3,(序列 4);
[0136] siTYK2 :5, -GCAUCCACAUUGCACAUAA-3'(序列 5);
[0137] 陰性對照(NC) :5' -UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'。
[0138] 2、siRNA 轉染及 IFN- a 或 IFN- β 的處理
[0139] A. siRNA 轉染
[0140] 待轉染細胞為THP-I細胞。
[0141] (1)根據吉瑪公司說明書,將合成的siRNA加入150μ 1無 RNase水溶解至濃度 (20 μ Μ),分裝凍存於-80°c。
[0142] (2)根據Lipofectamine2000說明書進行siRNA轉染,具體步驟如下:轉染前 用2ml新鮮培養基重懸I. 5-2X IO5個細胞,加入到35mm培養皿中;用250 μ I Opti-MEM 培養基稀釋siRNA至終濃度為25ηΜ或50ηΜ ;同時用250 μ I Opti-MEM培養基稀釋5 μ 1 Lipofectamine2000,輕輕混合,室溫放置5分鐘;將siRNA和Lipofectamine2000輕輕混 合,室溫放置20分鐘,然後加入到細胞培養基中,混勻。
[0143] B. IFN-α 或 IFN-β 的處理
[0144] 轉染48小時後,向其中加入IFN-α (或IFN-β),使IFN-α的終濃度為50ng/ ml (使IFN-β的終濃度為10ng/ml)。IFN-a的處理時間為2小時,IFN-β的處理時間為 4小時。
[0145] 3、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達
[0146] 參照實施例1步驟一 2進行。
[0147] 4、Western blot 檢測
[0148] 以β-actin作為內參,檢測該內參的一抗為anti-human β-actin (購自Santa Cruz Biotechnology公司,目錄號:sc-47778),二抗為羊抗小鼠 IgG抗體(購自北京中杉 金橋生物技術有限公司,目錄號:ZDR-5307)。
[0149] 檢測 AKT 蛋白的一抗為 anti-human AKT (購自 Cell Signaling Technology 公司,目錄號:9272);檢測JAKl蛋白的一抗為anti-human JAKl (購自Santa Cruz Biotechnology 公司,目錄號:sc-7228);檢測 TYK2 蛋白的一抗為 anti-human TYK2 (購自 Santa Cruz Biotechnology 公司,目錄號:sc-169);檢測 STATl 蛋白的一抗為 anti-human STATl (購自 Cell Signaling Technology 公司,目錄號:9172s);檢測 STAT3 蛋白的一抗為 anti-human STAT3(購自 Santa Cruz Biotechnology 公司,目錄號:SC-482X);檢測各蛋白 所用的二抗根據一抗進行選擇,為羊抗小鼠 IgG抗體(購自北京中杉金橋生物技術有限公 司,目錄號:ZDR-5307)或羊抗兔IgG抗體(購自自北京中杉金橋生物技術有限公司,目錄 號:ZDR-5306)。
[0150] 具體操作參照實施例1步驟一 3進行。
[0151] 結果顯示,siAKT、siJAKl、siTYK2、siSTATl 和 siSTAT3 都能夠抑制 IFN-α 和 IFN- β誘導的ATX表達(圖3)。
[0152] 上述結果表明,阻斷JAK-STAT、ΡΙ3Κ-ΑΚΤ、NF- κ B通路可以抑制I型幹擾素誘導 ATX的表達。
[0153] 實施例3、TLR的激活可以導致ATX的表達上調
[0154] 一、THP-I細胞中TLR配體對ATX表達的影響
[0155] Toll-like rec印tor (TLR)作為一類模式識別受體,是機體識別異物侵染的重要 感受器。本發明的發明人檢測了 TLR配體對ATX表達的影響。具體操作如下:
[0156] I、TLR配體處理THP-I細胞
[0157] 供試TLR配體有TLR4配體細菌脂多糖(LPS)、TLR3配體poly(I:C)和TLR9配體 CpG寡核苷酸。
[0158] (I)LPS 處理
[0159] 將LPS加入到培養有THP-I細胞的細胞培養基中,使其終濃度為0. 1 μ g/ml。處理 16小時。實驗同時設置未經處理的THP-I細胞作為對照。
[0160] (2) poly (I:C)和CpG寡核苷酸處理
[0161] A. poly (I: C)處理
[0162] 用250 μ I Opti-MEM培養基稀釋poly (I:C)至終濃度為10 μ g/ml ;同時用250 μ 1 Opti-MEM培養基稀釋5 μ I Lipofectamine2000,輕輕混合,室溫放置5分鐘;將poly (I: C) 和Lipofectamine2000輕輕混合,室溫放置20分鐘,然後加入到培養有THP-I細胞的細胞 培養基中,混勻。
[0163] B. CpG寡核苷酸處理
[0164] 用250 μ I Opti-MEM培養基稀釋CpG至終濃度為1 μ M ;同時用250 μ I Opti-MEM 培養基稀釋5μ I Lipofectamine2000,輕輕混合,室溫放置5分鐘;將CpG寡核苷酸和 Lipofectamine2000輕輕混合,室溫放置20分鐘,然後加入到培養有THP-I細胞的細胞培養 基中,混勾。
[0165] p〇ly(I:C)和CpG寡核苷酸的處理時間均為6小時。
[0166] 實驗同時設置未經處理的THP-I細胞作為對照。
[0167] 2、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達
[0168] 參照實施例1步驟一 2進行。
[0169] 結果顯示,TLR4配體細菌脂多糖(LPS)、TLR3配體poly(I:C)和TLR9配體CpG寡 核苷酸都可以誘導THP-I細胞中ATX的表達(圖4中A)。
[0170] 二、單核細胞來源的樹突狀細胞中TLR配體對ATX表達的影響
[0171] 1、單核細胞來源的樹突狀細胞的獲得
[0172] 從人外周血中分離到單核細胞(具體分離方法參見前文),調整細胞濃度為 I X IO6 個 /L,接種於 6 孔培養板,0· 002L/ 孔,加入 rhGM-CSF (50 μ g/L)、rhIL-4 (50 μ g/ L),然後置37°C、5% CO2培養箱內培養,第3天採取半量換液並補加細胞因子,繼續培養 至第6天,獲得成熟的樹突狀細胞,即為單核細胞來源的樹突狀細胞(monocyte derived dendritic cell,moDC)。該 moDCs 中只表達 TLR3 和 TLR4,不表達 TLR9。
[0173] 2、1'1^配體處理111〇0(:細胞
[0174] 供試TLR配體有TLR4配體細菌脂多糖(LPS)和TLR3配體poly (I: C)。
[0175] (I)LPS 處理
[0176] 將LPS加入到培養有moDC細胞的細胞培養基中,使其終濃度為0. 1 μ g/ml。處理 16小時。實驗同時設置未經處理的moDC細胞作為對照。
[0177] (2) poly (I:C)處理
[0178] 用250 μ I Opti-MEM培養基稀釋poly (I:C)至終濃度為10 μ g/ml ;同時用250 μ 1 Opti-MEM培養基稀釋5 μ I Lipofectamine2000,輕輕混合,室溫放置5分鐘;將poly (I: C) 和Lipofectamine2000輕輕混合,室溫放置20分鐘,然後加入到細胞培養基中,混勻,處理 時間為6h。實驗同時設置未經處理的moDC細胞作為對照。
[0179] 3、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達
[0180] 參照實施例1步驟一 2進行。
[0181] 結果顯示,當用LPS和poly (I :C)分別處理moDCs時,均可以顯著上調moDCs細胞 中ATX的表達(圖4中B)。
[0182] 上述結果表明,TLR3、TLR4和TLR9等TLR的激活可以誘導免疫細胞中ATX的表達。
[0183] 實施例4、TLR激活導致ATX表達上調依賴I型幹擾素自分泌途徑
[0184] TLR的激活可以誘導I型幹擾素的表達,其中TLR3和TLR4是通過IRF3介導的I 型幹擾素的表達,而TLR9是通過IRF7介導I型幹擾素的表達。
[0185] 一、siIRF3和siIRF7對TLR激活誘導ATX的表達影響
[0186] 本發明的發明人通過轉入siIRF3或siIRF7,分別敲低IRF3和IRF7的表達,研究 其對TLR激活誘導ATX的表達影響。具體操作如下:
[0187] UsiRNA 的合成
[0188] SiRNA(雙鏈)由上海吉馬公司按照表格中序列進行合成。
[0189] siIRF3 :5,-ccacuuugguguuucauaa-3'(序列 7);
[0190] siIRF7 :5,-gccucuaugacgacaucga-3,(序列 8);
[0191] 陰性對照(NC) : 5 ' -UUCUCCGAACGUGUCACGU-3 '。
[0192] 2、siRNA 轉染
[0193] 待轉染細胞為THP-I細胞。參照實施例2步驟二2進行轉染,轉染48小時後,再 參照實施例3步驟一 1用TLR4配體細菌脂多糖(LPS)、TLR3配體poly (I: C)或TLR9配體 CpG寡核苷酸處理THP-I細胞。
[0194] 3、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達
[0195] 參照實施例2步驟二3進行。
[0196] 4、Western blot 檢測
[0197] 以β-actin作為內參,檢測該內參的一抗為anti-human β-actin (購自Santa Cruz Biotechnology公司,目錄號:sc-47778),二抗為羊抗小鼠 IgG抗體(購自北京中杉 金橋生物技術有限公司,目錄號:ZDR-5307)。
[0198] 檢測 IRF3 蛋白的一抗為 anti-human IRF3 (購自 Cell Signaling Technology 公司,目錄號:11904P);檢測 IRF7 蛋白的一抗為 anti-human IRF7 (購自 Cell Signaling Technology公司,目錄號:13014S);檢測各蛋白所用的二抗根據一抗進行選擇,為羊抗小 鼠 IgG抗體(購自北京中杉金橋生物技術有限公司,目錄號:ZDR-5307)或羊抗兔IgG抗體 (購自自北京中杉金橋生物技術有限公司,目錄號:ZDR-5306)。
[0199] 具體操作參照實施例1步驟一 3進行。
[0200] 5、結果
[0201] 結果顯示,siIRF3可以抑制TLR4配體LPS和TLR3配體poly(I:C)處理THP-I細 胞時ATX的表達上調(圖5中A和B) ;siIRF7可以抑制TLR9配體CpG寡核苷酸處理THP-I 細胞時ATX的表達上調(圖5中C)。
[0202] 二、TLR配體誘導I型幹擾素的表達
[0203] I、TLR配體處理THP-I細胞
[0204] 參照實施例3步驟一 1進行。LPS的處理時間為2h,poly (I:C)和CpG寡核苷酸 的處理時間均為6h。實驗同時設置未經處理的THP-I細胞作為對照。
[0205] 2、qRT-PCR 檢測 IFN- α 和 IFN- β mRNA 的表達
[0206] 參照實施例1步驟一 2進行。
[0207] 其中擴增IFN-α基因的引物對如下:
[0208] IFN-α -F :5, -GATGGCCGTGCTGGTGCTCA-3,;
[0209] IFN- a -R : 5 ' -TGATTTCTGCTCTGACAACCTCCC-3 '。
[0210] 其中擴增IFN-β基因的引物對如下:
[0211] IFN-β -F : 5 ' -AAACTCATGAGCAGTCTGCA-3 ' ;
[0212] IFN-β -R : 5,-AGGAGATCTTCAGTTTCGGAGG-3,。
[0213] 結果顯示:TLR4隻可以介導IFN-β的表達,而不能介導IFN-a的表達;而TLR3 和TLR9既可以介導IFN-a的表達也可以介導IFN-β的表達(圖6)。
[0214] 三、IFN- a和IFN- β的中和性抗體對TLR介導的THP-I細胞中ATX表達的影響
[0215] 1、IFN-a或IFN-β的中和性抗體處理細胞
[0216] (DLPS/IFN-β中和性抗體處理
[0217] 向培養有THP-I細胞的細胞培養基中加入IFN-β中和性抗體,使其終濃度為 1 μ g/ml,30min後,再向其中加入LPS,使其終濃度為0. 1 μ g/ml,LPS處理16小時。實驗同 時設置未經處理的細胞以及經IgG處理的細胞作為對照。
[0218] (2) poly (I:C)或CpG寡核苷酸/IFN-a或IFN-β中和性抗體處理
[0219] A. poly (I:C)/IFN-a 或 IFN-β 中和性抗體處理
[0220] 向培養有THP-I細胞的細胞培養基中加入IFN-a中和性抗體(或IFN-β中和 性抗體),使其終濃度為1以8/1111,3〇1^11後,用25(^1(^1-1^培養基稀釋? 〇17(1:〇至 終濃度為1〇μ g/ml ;同時用250μ I Opti-MEM培養基稀釋5μ I Lipofectamine2000,輕輕 混合,室溫放置5分鐘;將poly (I: C)和Lipofectamine2000輕輕混合,室溫放置20分鐘, 然後加入到培養有THP-I細胞的細胞培養基中,混勻。poly (I: C) /IFN- α中和性抗體(或 IFN-β中和性抗體)處理時間為6h。
[0221] B. CpG寡核苷酸/IFN- α或IFN- β中和性抗體處理
[0222] 向培養有THP-I細胞的細胞培養基中加入IFN- α中和性抗體(或IFN- β中和性 抗體),使其終濃度為1 μ g/ml,30min後,用250 μ I Opti-MEM培養基稀釋CpG寡核苷酸至 終濃度為ΙμΜ;同時用250μ1 Opti-MEM培養基稀釋5μ1 Lipofectamine2000,輕輕混合, 室溫放置5分鐘;將CpG寡核苷酸和Lipofectamine2000輕輕混合,室溫放置20分鐘,然後 加入到培養有THP-I細胞的細胞培養基中,混勻。CpG寡核苷酸/IFN-α中和性抗體(或 IFN-β中和性抗體)處理時間為6h。
[0223] 實驗同時設置未經處理的細胞作為對照。
[0224] 2、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達
[0225] 參照實施例1步驟一 2進行。
[0226] 結果顯示,通過加入IFN-a或IFN-β的中和性抗體阻斷相應I型幹擾素的作用, 發現IFN-β的中和性抗體在THP-I細胞中能夠抑制TLR3、4、9活化導致的ATX表達上調, 而IFN-a的中和性抗體則沒有顯著的效果(圖7)。
[0227] 四、IFN- a和IFN- β中和性抗體對TLR介導的moDC細胞中ATX表達的影響
[0228] 1、IFN-a或IFN-β的中和性抗體處理細胞
[0229] (DLPS/IFN-β中和性抗體處理
[0230] 向培養有moDC細胞的細胞培養基中加入IFN-β中和性抗體,使其終濃度為Iyg/ ml,30min後,再向其中加入LPS,使其終濃度為0. lyg/ml,LPS處理16小時。實驗同時設 置未經處理的細胞以及經IgG處理的細胞作為對照。
[0231] (2) poly (I:C)/IFN-a 或 IFN-β 中和性抗體處理
[0232] 向培養有moDC細胞的細胞培養基中加入IFN-a中和性抗體(或IFN-β中和性抗 體),使其終濃度為1 μ g/ml,30min後,用250 μ I Opti-MEM培養基稀釋poly (I:C)至終濃 度為 1〇μ g/ml ;同時用 250μ I Opti-MEM培養基稀釋 5μ I Lipofectamine2000,輕輕混合, 室溫放置5分鐘;將poly (I: C)和Lipofectamine2000輕輕混合,室溫放置20分鐘,然後加 入到培養有THP-I細胞的細胞培養基中,混勻。poly (I: C) /IFN- α中和性抗體(或IFN- β 中和性抗體)處理時間為6小時。實驗同時設置未經處理的moDC細胞作為對照。
[0233] 2、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達
[0234] 參照實施例1步驟一 2進行。
[0235] 結果顯示,通過加入IFN-α或IFN-β的中和性抗體阻斷相應I型幹擾素的作 用,發現在moDC細胞中IFN-β中和性抗體和IFN-a中和性抗體均能夠抑制TLR3配體 p〇ly(I:C)誘導ATX的表達,其中IFN-β中和性抗體的抑制作用更為顯著(圖8中A); IFN- β中和性抗體能夠抑制moDC細胞中TLR4配體LPS誘導ATX的表達(圖8中B)。
[0236] 五、SiIFNARl抑制TLR介導ATX的表達
[0237] I型幹擾素通過結合位於細胞表面的I型幹擾素受體(IFNAR)來發揮作用。IFNAR 由兩個亞基組成,即IFNARl和IFNAR2。本發明的發明人通過RNAi敲低細胞中IFNARl的表 達,研究其對TLR激活誘導ATX的表達影響。具體操作如下:
[0238] UsiRNA 的合成
[0239] SiRNA(雙鏈)由上海吉馬公司按照表格中序列進行合成。
[0240] siIFNARl :5' -CUGGGAUGGAUAAUUGGAU-3'(序列 6)
[0241] 陰性對照(NC) :5' -UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'。
[0242] 2、siRNA 轉染
[0243] 待轉染細胞為THP-I細胞。參照實施例2步驟二2進行轉染,轉染48小時後,再 參照實施例3步驟一 1用TLR4配體細菌脂多糖(LPS)、TLR3配體poly (I: C)或TLR9配體 CpG寡核苷酸處理THP-I細胞。
[0244] 參照實施例2步驟二2進行。
[0245] 3、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達
[0246] 參照實施例2步驟二3進行。
[0247] 4、Western blot 檢測
[0248] 以β-actin作為內參,檢測該內參的一抗為anti-human β-actin (購自Santa Cruz Biotechnology公司,目錄號:sc-47778),二抗為羊抗小鼠 IgG抗體(購自北京中杉 金橋生物技術有限公司,目錄號:ZDR-5307)。
[0249] 檢測 IFNARl 蛋白的一抗為 anti-human IFNARl (購自 Santa Cruz Biotechnology 公司,目錄號:sc-7391);二抗為羊抗小鼠 IgG抗體(購自北京中杉金橋生物技術有限公 司,目錄號:ZDR-5307)。
[0250] 具體操作參照實施例1步驟一 3進行。
[0251] 5、結果
[0252] 結果顯示,siIFNARl能夠抑制LPS、poly (I:C)和CpG寡核苷酸處理時THP-I細胞 中ATX的表達上調(圖9)。
[0253] 上述結果表明,TLR配體誘導ATX表達上調依賴I型幹擾素的產生,阻斷I型幹擾 素產生的途徑或者阻斷I型幹擾素髮揮功能的信號通路都能夠抑制TLR激活導致的ATX表 達上調。
[0254] 實施例5、腫瘤壞死因子-a (TNF- α )和幹擾素 -γ (IFN- Y )能夠協同上調ATX的 表達
[0255] 腫瘤壞死因子-a (TNF-α )和幹擾素 -Y (IFN-Y )兩種細胞因子,參與多種生命 活動,與自身免疫疾病密切相關。有多篇文章報導,ATX與自身免疫疾病相關。因此,本發 明的發明人分別用TNF-α和IFN-γ單獨或者組合處理THP-I細胞,檢測對ATX表達影響。 具體操作如下:
[0256] I、TNF- α 和 / 或 IFN- Y 處理 THP-I 細胞
[0257] 將TNF-α和/或IFN-Y分別單獨或者組合加入到THP-I細胞的培養基中,使 TNF-a的終濃度為50ng/ml,IFN-Y的終濃度也為50ng/ml。處理時間為16h。實驗同時 設置未經處理的細胞作為對照。
[0258] 2、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達
[0259] 參照實施例1步驟一 2進行。
[0260] 結果顯示,TNF-a和IFN-Y單獨處理對ATX表達的上調作用較小。而TNF-a和 IFN-γ共同處理是則能使ATX的表達顯著地升高(圖10)。
[0261] 上述結果說明,TNF- α和IFN- Y能夠協同誘導ATX的表達。
[0262] 實施例6、TNF- α和IFN- Y協同上調ATX表達依賴於I型幹擾素的作用
[0263] 有報導表明,TNF- α能夠促進I型幹擾素的表達(主要是IFN- β ),而I型幹擾素 和II型幹擾素(IFN-Y)具有協同作用。
[0264] 一、TNF- α對I型幹擾素的誘導作用
[0265] I、TNF- α 處理 THP-I 細胞
[0266] 將TNF- α加入到培養有THP-I細胞的細胞培養基中,使其終濃度為50ng/ml。處 理時間為2h。實驗同時設置未經處理的THP-I細胞作為對照。
[0267] 2、qRT-PCR 檢測 IFN- α 和 IFN- β mRNA 的表達
[0268] 參照實施例4步驟二2進行。
[0269] 結果顯示,TNF-α對THP-I細胞中IFN-β的表達具有促進作用(圖11中A)。
[0270] 二、IFN- β中和性抗體抑制TNF- α和IFNi協同上調ATX表達
[0271] 1、TNF-α和IFN-Y/IFN-β中和性抗體處理細胞
[0272] 向培養有THP-I細胞的細胞培養基中加入IFN-β中和性抗體,使其終濃度為 14 8/!111,3〇1^11後,將了嚦-〇和正^¥組合加入其中,使了嚦-〇的終濃度為5〇1^/1111, IFN-Y的終濃度也為50ng/ml。TNF-α和IFN-Y的處理時間為16h。實驗同時設置未經 IFN-β中和性抗體處理的對照組,以及採用IgG替代IFN-β中和性抗體處理的對照組。
[0273] 2、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達
[0274] 參照實施例1步驟一 2進行。
[0275] 結果顯示,當IFN-β特異的中和性抗體存在時,TNF-α和IFN-Y協同上調ATX表 達的作用被顯著抑制(圖11中Β)。
[0276] 三、siIFNARl抑制TNF- α和IFN- Y協同上調ATX表達
[0277] UsiRNA 的合成
[0278] 同實施例4步驟五1。
[0279] 2、siRNA 轉染
[0280] 待轉染細胞為THP-I細胞。參照實施例2步驟二2進行轉染,轉染48小時後,再 將TNF-α和IFN-γ組合加入到其中,使TNF-α的終濃度為50ng/ml,IFN-Y的終濃度也 為50ng/ml。TNF-α和IFN-Y的處理時間為16h。實驗同時設置未轉染的對照組。
[0281] 3、qRT-PCR 檢測 ATX mRNA 的表達
[0282] 參照實施例2步驟二3進行。
[0283] 4、Western blot 檢測
[0284] 參照實施例4步驟五4進行。
[0285] 5、結果
[0286] 結果顯示,通過轉入SiIFNARl敲低細胞中IFNARl的表達,阻斷I型幹擾素的信號 通路,能夠抑制TNF- α和IFN- γ上調ATX表達的作用(圖11中C)。
[0287] 上述結果表明,阻斷I型幹擾素的通路能夠抑制TNF- α和IFN- Y誘導的ATX表 達。
【權利要求】
1.1型幹擾素在如下任一中的應用: (al)在免疫細胞中誘導ATX蛋白表達; (a2)製備具有在免疫細胞中誘導ATX蛋白表達的功能的產品。
2. 能夠促進I型幹擾素表達和/或增強I型幹擾素作用的物質在如下任一中的應用: (bl)在免疫細胞中誘導ATX蛋白表達; (b2)製備具有在免疫細胞中誘導ATX蛋白表達的功能的產品。
3. -種具有在免疫細胞中誘導ATX蛋白表達的功能的產品,其活性成分為I型幹擾素 或能夠促進I型幹擾素表達和/或增強I型幹擾素作用的物質。
4. 根據權利要求2所述的應用或權利要求3所述的產品,其特徵在於:所述能夠促進I 型幹擾素表達和/或增強I型幹擾素作用的物質為如下中任一種: (1) Toll-Iike受體的配體; (2) 腫瘤壞死因子a和幹擾素Y混合物。
5. 根據權利要求4所述的應用或產品,其特徵在於:所述Toll-Iike受體的配體為 TLR4配體、TLR3配體或TLR9配體; 所述TLR4配體具體為細菌脂多糖;所述TLR3配體具體為poly (I: C);所述TLR9配體 具體為CpG寡核苷酸。 6. I型幹擾素信號通路抑制劑或抑制I型幹擾素產生的物質在如下任一中的應用: (cl)在免疫細胞中抑制ATX蛋白表達; (c2)製備具有在免疫細胞中抑制ATX蛋白表達的功能的產品。
7. -種具有在免疫細胞中抑制ATX蛋白表達的功能的產品,其活性成分為I型幹擾素 信號通路抑制劑或能夠抑制I型幹擾素產生的物質。
8. 根據權利要求6所述的應用或權利要求7所述的產品,其特徵在於:所述I型幹擾素 信號通路抑制劑為如下(a)-(c)中的任一種:所述抑制I型幹擾素產生的物質為如下(d): (a) JAK-STAT信號通路抑制劑、PI3K-AKT信號通路抑制劑或NF- K B信號通路抑制劑; 所述JAK-STAT信號通路抑制劑具體為Pyridone6 ;所述PI3K-AKT信號通路抑制劑具 體為LY294002 ;所述NF- K B信號通路抑制劑具體為BAY-11-7082 ; (b) siSTATl、siSTAT3、siAKT、siJAKl、siTYK2 或 siIFNARl ; 所述siSTATl為序列表中序列I所示的雙鏈RNA分子;所述siSTAT3為序列表中序列 2所示的雙鏈RNA分子;所述siAKT為序列表中序列3所示的雙鏈RNA分子;所述SiJAKl 為序列表中序列4所示的雙鏈RNA分子;所述siTYK2為序列表中序列5所示的雙鏈RNA分 子;所述siIFNARl為序列表中序列6所示的雙鏈RNA分子; (c) IFN-a中和性抗體或IFN-P的中和性抗體; (d) siIRF3 或 siIRF7 ; 所述siIRF3為序列表中序列7所示的雙鏈RNA分子;所述siIRF7為序列表中序列8 所示的雙鏈RNA分子。
9. 根據權利要求8所述的應用或產品,其特徵在於:所述I型幹擾素為IFN-a或 IFN- 3 〇
10. 根據權利要求1-8中任一所述的應用或方法,其特徵在於:所述ATX蛋白的胺基酸 序列如序列表中序列9所示。
【文檔編號】C12N15/85GK104312973SQ201410528355
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月9日 優先權日:2014年10月9日
【發明者】張俊傑, 宋建穩, 李頌 申請人:北京師範大學