ChangLiver細胞作為具有肝功能的細胞源的醫學應用的製作方法
2023-09-14 22:45:35
專利名稱：Chang Liver細胞作為具有肝功能的細胞源的醫學應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術和醫藥領域,具體涉及Chang Liver細胞的肝細胞功能研究，及其在體外培養增殖後在肝細胞移植和治療急性肝功能衰竭中的應用。
背景技術：
急性肝衰竭(Acute liver failure, ALF)死亡率很高，目前可根治急性肝衰竭的唯一方法是肝移植。但供肝的數量遠遠不能滿足患者的需求，很多急性肝衰竭患者在等待肝移植的過程中死亡。除肝移植外，急性肝衰竭尚有兩種有效治療方法，即肝細胞移植和生物人工肝。用人源性肝細胞充填的生物人工肝是治療急性肝衰竭的一種最有效的方法，可有效降低急性肝功能衰竭死亡率，可作為肝移植前的一種過渡性治療。肝細胞移植可以明顯降低急性肝功能衰竭死亡率，促進病肝再生和恢復，也可作為肝移植的過渡療法。肝細胞移植和生物人工肝都需要大量的肝細胞，但目前原代肝細胞的來源很困難，主要是可供分離肝細胞的肝臟來源不足，且原代肝細胞體外培養增殖極為困難。其他的一些可用細胞系，如幹細胞、永生化肝細胞、異種肝細胞等，都有或多或少的不足，如永生化肝細胞潛在的致瘤危險性，異種肝細胞強烈的排異反應，有關幹細胞的研究尚不充分等。Chang Liver細胞系，是上世紀80年代由國內學者自行建系的細胞系,其體外培養容易，來源方便，目前多作為許多實驗的對照組細胞。但Chang Liver細胞系是否具有肝細胞相關功能及是否能應用於肝細胞移植和生物人工肝，目前國內外文獻中尚無報導。
發明內容
本發明的目的是對Chang Liver細胞系進行肝細胞功能研究，並將其應用於肝細胞移植，研究其治療急性肝功能衰竭的效果，旨在提供一種新型可用、功能穩定、來源充足的具有良好肝功能的細胞系來源。本發明的技術方案是本發明選擇了目前國內應用較多且來源方便、經無限繁代的Chang Liver細胞系，對其進行肝細胞功能研究。將Chang Liver細胞解凍後進行培養增殖，其貼壁後增殖迅速，傳代周期較穩定，以新生牛血清培養2至3天即可傳代，可完全滿足實驗的需求。對ChangLiver細胞進行肝細胞功能檢測發現，Chang Liver細胞表達多種肝細胞特異性因子,包括白蛋白、膽紅素葡糖醛酸基轉移酶、細胞色素酶P450和轉氨酶等，表明其具有確切的肝細胞功能。為進一步驗證Chang Liver細胞對於急性肝衰竭的治療作用,本發明人選擇了大鼠90%肝切除誘導的急性肝衰竭模型。實驗中發現，實驗組大鼠肝切除術後存活時間明顯長於對照組，實驗組大鼠30天存活率達到40%以上，而對照組大鼠均於術後72h內死亡，其差異具有統計學意義(P〈0. 01)。對存活30天大鼠進行開腹觀察可見明顯肝臟再生。同時抽血檢測肝功能指標，證實Chang Liver細胞能有效改善肝功能。本發明的優點(I)本發明所用的細胞系Chang Liver細胞系來源方便，且易在體外大量培養增殖，適合臨床推廣。(2)本發明證明Chang Liver細胞具有良好的肝細胞功能，可以作為良好的人源肝細胞替代來源，用於在治療急慢性肝功能衰竭中的應用，為Chang Liver細胞在醫學實驗研究上的應用奠定了基礎。
圖1 : SD大鼠肝臟解剖圖。圖2 :顯微鏡下觀察Chang Liver細胞(X 100)。圖3 =RT-PCR檢測Chang Liver細胞肝細胞相關因子的表達。從上至下依次為白蛋白(ALB)、穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)、人凝血因子-X (HBCF-X)及內參GAPDH。圖4 :Western_blot檢測Chang Liver肝細胞功能分子的表達。從上至下依次為白蛋白(ALB)、細胞色素酶P450 (CYP3A4)、葡糖醛酸基轉移酶(UGT)及內參P-actin。圖5:Chang Liver細胞免疫螢光染色，FITC標記白蛋白(ALB)、TRITC標記細胞色素酶P450 (CYP)和葡糖醛酸基轉移酶(UGT)，雷射共聚焦顯微鏡下觀察其分泌情況。圖A、圖B分別為40倍及100倍下觀察所見，肝細胞質染成綠色顆粒狀。圖C、D為100倍下所見，肝細胞質染成橘黃色顆粒狀。E中藍色為DAPI所染胞核。F為陰性對照，胞質內見螢光顆粒表達。圖6 :Chang Liver移植、90%肝切除後分別測定並計算各組大鼠的存活率、谷丙轉氨酶、穀草轉氨酶、總膽紅素、直接膽紅素及鹼性磷酸酶水平。其中Gl為對照組，G2為移植Chang Liver細胞的實驗組。圖7 :裸鼠細胞種植後4周結果。
具體實施例方式為了更好地解釋本發明，以下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但本發明的內容不僅僅局限於以下實施例。實施例1 Chang Liver細胞的肝細胞功能檢測(一)細胞培養-80°C取出事先凍存的Chang Liver細胞,Chang Liver細胞購於中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，37°C水浴搖晃Imin使之溶解，加入15mL離心管中，同時加入少量MEM培養基以去除DMSO的影響，1200rpm/min離心3min，去上清，加入4mLMEM培養基，重懸細胞後投入T25細胞培養瓶中，置於37°C 5% C02培養箱中。每隔24h換液一次，大約3天左右細胞長到80% 90%融合後，按1:3比例傳代，待細胞擴增到足夠數量後進行後續實驗。在顯微鏡下觀察細胞(X100)，發現細胞解凍後12h內即可貼壁，24h後觀察細胞，間細胞生長較密集，呈多邊形，胞質豐富，其內可見一個或多個細胞核，核仁清晰(見圖2)。(二)RT-PCR檢測相關基因的表達1. Chang Liver 細胞 mRNA 的提取DDEPC ImL加入999mL雙蒸水 中製備DEPC水，留下部分作為後續實驗所用，餘下用來浸泡實驗器具，以去除RNA酶影響。
2)棄去T25培養瓶中的培養基，加入約2mL TransZol (約10cm2加ImL TransZol)，使細胞裂解，裂解的同時用槍頭反覆吹吸數次，室溫孵育5min後轉入Ep管。3)加入0. 4mL氯仿(每ImL TransZol加0. 2mL氯仿)，劇烈震蕩15s，室溫放置3min。dOOOOg/mimfC離心15min。此時可見Ep內液體分3層，其中RNA位於最上層水相中。5)轉上層水相至一新的Ep管中，加入ImL異丙醇(ImL TransZol加500 ii L異丙醇)，充分混勻後室溫放置lOmin。6) 10000g/min，4°C離心lOmin，去上清，可見於Ep管底和管側形成膠樣沉澱。7)加入2mL由DEPC水配製而成的75%乙醇，每ImL TransZol至少加ImL乙醇，劇烈渦旋振蕩。8) 7500g,4°C離心 5min。9)去上清，超淨工作檯開風機乾燥約5min，但不能完全乾燥。10)加入100 u L RNA溶解液以使沉澱溶解。11)55°C 60°C孵育lOmin，立即保存RNA樣本於-70°C或立即用於逆轉錄。
2.逆轉錄合成cDNA I)於0.2mL Ep管中依次加入以下試劑(20 ii L體系)
權利要求
1.Chang Liver細胞用於作為肝細胞移植的細胞源的應用。
2.Chang Liver細胞用於作為生物人工肝的細胞源的應用。
3.按權利要求1或2所述的ChangLiver細胞在治療急性肝功能衰竭疾病上的應用。
4.按權利要求1或2所述的ChangLiver細胞在治療其他肝功能衰竭疾病上的應用。
全文摘要
本發明對肝腫瘤細胞系Chang Liver細胞系進行了肝細胞功能研究，並將其應用於肝細胞移植。研究發現Chang Liver細胞具有良好的肝細胞功能，能夠表達多種肝細胞特異性因子，包括白蛋白、膽紅素葡糖醛酸基轉移酶、轉氨酶等。大鼠90%肝切除誘導的急性肝衰竭模型實驗表明，Chang Liver細胞能有效延長急性肝衰竭大鼠的存活時間，可成為生物人工肝較好的細胞來源，用於治療急性肝功能衰竭。
文檔編號A61P1/16GK103055349SQ20121039140
公開日2013年4月24日 申請日期2012年10月15日 優先權日2012年10月15日
發明者周平, 楊濤, 張利民 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院