一個編碼冰緣植物冷誘導蛋白的基因及其在抗寒轉基因菸草中的應用的製作方法

2023-09-14 23:13:05

專利名稱：一個編碼冰緣植物冷誘導蛋白的基因及其在抗寒轉基因菸草中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一個編碼冰緣植物冷誘導蛋白的基因，特別是涉及一個編碼高山離子 芥冷誘導的DEAD-b0X RNA解旋酶的基因，及其在抗寒轉基因菸草中的應用。
背景技術：
DEAD-box RNA解旋酶存在於從原核的細菌到真核的動植物的絕大多數生物中。這 些蛋白能夠利用ATP水解釋放的能量改變RNA的次級結構或者移走綁定的蛋白，從而幫助 RNA形成正確的摺疊形式。DEAD-box RNA解旋酶參與很多的RNA代謝過程，包括轉錄，前體 RNA的剪切，核糖體生物發生，RNA出核運輸，翻譯起始，細胞器基因表達，RNA降解等多種生 理過程(Rocak S andLinder P，2004，Nature Rev. Mol. Cell Biol.)。在模式植物擬南芥 中，DEAD-box RNA解旋酶基因組成一個含有58個成員的家族，即AtRHl_AtRH58 (Aubourg S,Kreis M, et al，1999，Nucleic Acides Research)。近年來，人們發現 DEAD-box RNA 解 旋酶參與高等植物脅迫應答，包括低溫脅迫，熱脅迫，鹽脅迫，滲透脅迫以及氧化脅迫。例如 已經發現擬南芥DEAD-boxRNA解旋酶FL2-5A4，PMH1，PMH2,以及大麥DEAD-box RNA解旋酶 HVD1在低溫脅迫下表達量增高，在菸草中過表達一個DEAD-box RNA解旋酶PDH45增強了 菸草的耐鹽性(Sanan-Mirshra N, Pham X H, Sopory S K, et al，2005，Proc. Natl Acad. Sci.) 0高山離子芥(Chorispora bungeana)是十字花科離子芥屬多年生植物，分布在高 海拔亞高山草甸和礫石質山坡上。其生存環境的特點是氣候寒冷、土層反覆凍融，空氣稀 薄、輻射強、勁風。高山離子芥在外部形態結構和生態策略上沒有顯著的抗性特徵，為了耐 受長期低溫、反覆凍融，強紫外、大風等不利的環境條件，勢必通過表達抗性基因來維持自 身的生理代謝和生長發育，以避免或減輕嚴酷的環境脅迫的危害。因此高山離子芥是理想 的研究植物抗性的的材料。為探索高山離子芥適應低溫脅迫的內在機制，本實驗室利用蛋白質組學的方法， 分析高山離子芥在低溫脅迫(0°c )和常溫(20°C )下的蛋白表達差異。用TCA-丙酮法 分別提取無菌苗的總蛋白，進行雙向電泳，對凝膠進行膠體考染並脫色，利用PDQUEST8. 0 軟體對電泳結果進行分析，發現其中一個蛋白在低溫脅迫下(0°C)積累量是正常條件 (20°C )的7倍，質譜分析表明該蛋白屬於DEAD-box RNA解旋酶家族，我們將該蛋白命名為 CbDRH(Chorisporabungeana DRH, CbDRH)。我們利用 RACE 技術，獲得編碼 CbDRH 基因全 cds 區。序列比對分析表明CbDRH與擬南芥AtRH30同源性最高，達90%。目前，在擬南芥中還 未見到關於AtRH30功能的報導。克隆該基因並應用到轉基因植物上對於培育抵抗低溫的 優良作物具有一定的價值。

發明內容
本發明的目的是提供一種高山離子芥DRH冷誘導蛋白基因及其編碼產物。本發明的另一目的提供高山離子芥DRH冷誘導蛋白基因在抗凍轉基因菸草中的應用。(a) 一種高山離子芥 DRH(Chorispora bungeana DRH,CbDRH)基因編碼序列，該基 因包含1452個核苷酸，編碼484個胺基酸，其分子量為52. 66KD。其核苷酸序列為序列表中 序列(a)所述，以下為核苷酸序列。ATGAGCTCCTATGATCGTAGATTTGCTGATCCGAATTCGTATCGCCAACGCTCTGGCGCCCCAGTTGGTCCATCTCAGCCAATGGATCCTTCTGCTGCACCGTACAATCCACGATACGGTGGTGGTGGTGGATATGGACCGTCTCCTGTAATGGCCGGTGATGGCTCCGGGTATAGTCGGTACCCAGCTTTCCAGCCACCTACTAGTGGTTTCTCCGTTGGTCGCGGCGGAGGAGGAGGAAGAGGCACATATGGTCAATACGGC
GGCGGAGGAGGCGGCGGCAGTGGTGGGAATTGGGGAGGACGTGGTGGTGGATCGAATAAAAGAGAGCTAGATAATGTTTCGCTTCCGAAGCAGAATTTTGGGAATCTTGTCCATTTCGAGAAGAATTTCTACGTGGAAAGCCCCGATGTGCAGGCGATGACAGAACAGGATGTTGCGATGTATAGAACCGGGAGGGATATATCCGTTGAAGGTCGTGATGTTCCTAAGCCGATTAGGATGTTCCAAGATGCTAACTTCCCAGATAATATTCTCGAAGCGATTGCTAAGTTGGGATTCACTGAGCCAACACCGATACAATCTCAGGGATGGCCAATGGCTTTGAAGGGTAGGGATCTGATTGGTATTGCTGAGACTGGCTCTGGTAAGACATTAGCTTACTTGTTACCAGCGTTGGTCCACGTAAGCGCACAACCTCGATTGAGTCAAGATGATGGCCCCATTGTGTTAATATTAGCGCCCACTAGAGAATTAGCTGTTCAGATTCAAGAGGAATCAAGGAAATTCGGTCTGCGATCTGGTGTTAGAAGCACTTGTATCTATGGTGGTGCTCCTAAAGGACCTCAGATTCGCGATCTTAGAAGAGGTGTTGAGATTGTAATTGCTACACCTGGTCGTTTGATCGATATGTTGGAGTGTCAACATACTAATTTGAGGAGAGTAACTTACCTCGTGTTAGATGAAGCTGACCGAATGTTAGACATGGGATTTGAACCCCAAATTAGAAAGATTGTATCTCAGATCCGACCTGATAGACAGACGCTGCTTTGGAGT6CAACATGGCCACGAGAGGTTGAATCTCTTGCCAGGCAGTTTCTACGAGATCCATATAAGGCCATTATTGGATCAGCAGATCTAAAAGCTAACCAGTCTATTAATCAAGTAATCGAGATTGTACCAACGCCAGAGAAATACGCCAGGCTTCTTGCACTGCTTAAACAGTTAATGGATGGGAGTAAAATCCTAATATTCGTGGAGACAAAGAGAGGGTGTGATCAAGTGACTAGACAATTGAGAATGGATGGATGGCCAGCTCTAGCCATACACGGTGACAAGAACCAATCGGAAAGAGATCGAGTCTTGTCAGAATTTAAGAGCGGAAGAAGCCCGATAATGACTGCCACTGATGTAGCAGCAAGGGGACTTGGTAGGACAACTGTAACACAATAG(b) 一種高山離子芥DEAD-box RNA解旋酶(CbDRH)蛋白的胺基酸序列，該胺基酸 序列包含DEAD-box蛋白家族特徵性的八個保守基序，因此屬於DEAD-box蛋白家族成員。 CbDRH胺基酸序列如序列表中序列2所述，以下為胺基酸序列。MSSYDRRFADPNSYRQRSGAPVGPSQPMDPSAAPYNPRYGGGGGYGPSPVMAGDGSGYSRYPAFQPPTSGFSVGRGGGGGRGTYGQYGGGGGGGSGGNWGGRGGGSNKRELDNVSLPKQNFGNLVHFEKNFYVESPDVQAMTEQDVAMYRTGRDISVEGRDVPKPIRMFQDANFPDNILEAIAKLGFTEPTPIQSQGWPMALKGRDLIGIAETGSGKTLAYLLPALVHVSAQPRLSQDDGPIVLILAPTRELAVQIQEESRKFGLRSGVRSTCIYGGAPKGPQIRDLRRGVEIVIATPGRLIDMLECQHTNLRRVTYLVLDEADRMLDMGFEPQIRKIVSQIRPDRQTLLWSATWPREVESLARQFLRDPYKAIIGSADLKANQSINQVIEIVPTPEKYARLLALLKQLMDGSKILIFVETKRGCDQVTRQLRMDGWPALAIHGDKNQSERDRVLSEFKSGRSPIMTATDVAARGLGRTTVTQ.本發明中的cbDRH基因和擬南芥AtRH30的DNA序列具有90%同源性，推測編碼相 似功能蛋白質，蛋白序列的同源性也為90%。
本發明序列(a)的DNA序列有1452個鹼基組成，編碼序列表中由483個胺基酸殘 基組成的蛋白質序列(b)。雙向電泳檢測到CbDRH蛋白在低溫脅迫下(0°C)積累量是正常 條件(20°C )的7倍。含有本發明基因CbDRH的表達載體及細胞系也在本發明的保護範圍之內。利用 PCR技術得到CbDRH基因全cds區，並在兩端分別引入Smal和Xbal酶切位點，連接到克隆載 體PMD18-T上，用Smal和Xbal在37°C酶切過夜，回收目的基因片段。將帶有35s啟動子的 PBI121質粒用同樣的方法酶切過夜，並回收酶切產物。將回收的目的基因與回收的PBI121 載體用T4 DNA連接酶於20°C連接過夜，次日將連接體系轉化大腸桿菌DH5_a，菌落PCR篩選 陽性克隆並送去測序，經測序鑑定正確的克隆為含有真核表達載體PBI121-35s-CbDRH的 克隆。提取質粒PBI121-35s-CbDRH，通過轉化農桿菌LBA4404即得到含有該表達載體的農 桿菌菌株。利用農桿菌介導的轉化，將表達載體轉入菸草，經過篩選獲得組成型表達CbDRH 基因的轉基因菸草。檢測轉基因植株的抗低溫能力，結果表明轉基因植株的抗低溫能力遠 大於野生型。在冷脅迫下，轉基因菸草的葉綠素含量高於對照，同時，轉基因菸草比對照積 累更多的脯氨酸；在短時間凍脅迫(_4°C處理12小時)下，轉基因菸草的質膜滲漏率小於 對照。


圖1示低溫處理前後轉CbDRH基因菸草TL3和野生型對照生長狀態。a為25°C生 長狀態，b為_4°C，處理12hours後生長狀態。WT 野生型對照；TL3 轉基因植株。圖1顯 示轉入CbDRH基因的菸草在低溫下生長狀態明顯好於野生型對照。-4°C處理12hours，野生 型對照菸草已經萎蔫，而轉基因植株生長狀態良好。圖2示低溫處理前後轉CbDRH基因植株TL3和野生型對照的質膜離子滲漏率變 化。WT 野生型對照；TL3 轉基因植株。25°C下轉基因TL3植株的質膜離子滲漏率與野生型 無明顯變化；4°C處理3天轉基因植株TL3的質膜離子滲漏率與野生型亦無明顯變化；_4°C 處理12hoUrs後，野生型對照植株的質膜離子滲漏率是轉基因植株TL3的3倍。顯示-4°C 低溫下野生型對照植株受到的傷害遠大於轉基因植株。
具體實施例方式在本發明的下述實施例中，所用的實驗材料為高山離子芥(Chorisporabungeana) 禾口菸草(Nicotiana tabacum)。實施例1高山離子芥CbDRH基因克隆1.高山離子芥CbDRH基因3，端擴增1.1.利用Trizol法分離0°C處理一周的高山離子芥葉片中總RNA，其具體方 法是將高山離子芥葉片0. 05g放入研缽，加液氮覆蓋材料，迅速用力研成粉末，加入 lml Trizol，研磨至溶化，轉移到滅菌的印管中。12000gX5min，4°C離心。取上清，轉 移到新的印管中，加五分之一體積的氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置lOmin，待其分層。 12000gX 15min，4°C。用槍從表面慢慢往下吸，取上層水相轉移至另一新的印管中，一般取300-400ul足夠(切勿碰到下層)，用槍從表面慢慢往下吸，最後應距下層0. 4cm左右。在ep 管加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20min，12000gX10min，4°C。棄上清，加冰浴的75% 乙醇(用DEPC水配)lml，輕輕吹懸吹散。10000gX8min，4°C。棄乙醇，吸乾，殘餘的微量乙 醇空氣乾燥(不能太幹，否則不易溶解)。用20-30ulDEPC水溶解。少量用於電泳檢測，其 餘-80°C保存。1. 2根據生物信息學提供的序列資料設計以下特異性引物Outer primer 5' -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3，；Inner Primer 5' -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3，1. 3根據TaKaRa的RACE試劑盒設計程序，進行PCR反應。PCR擴增步驟如下
(1)Outer PCR 反應。反應體系為，模板，2ul ;1 X cDNA dilution bufferll,8ul ；Gene specific outer primer(lOuM),2ul ；3' RACE outer primer(lOuM),2ul ； 10XLA PCR Buffer II (Mg2+free) ,4ul ；MgCl2 (25mM), 3ul ；LA Taq (5U/ul)，0. 25ul ；ddH20，28. 75ul ；反 應條件為，94°C，3min ；94°C，30s ；55°C，30s 72°C，lmin(30 循環)；72°C，10min ；4°C保存。
(2)Inner PCR 反應。反應體系為，Outer PCR 產物，lul ;dNTPmixture (2. 5mM each) ,8ul ； 10XLA PCR Buffer II (Mg2+free), 5ul ；MgCl2 (25mM), 5ul ；LA Taq (5U/ul), 0. 5ul ；Gene specific innerprimer(lOuM),2ul ；3' RACE inner primer(lOuM),2ul ;ddH20, 26. 5ul。反 應條件為，94°C，3min ；94°C，30sec ；55°C，30s ；72°C，lmin(30 循環)，72°C lOmin ；4°C保存。2.高山離子芥DRH基因5，端擴增2. 1去磷酸化處理按下列組分配製去磷酸化反應Total RNA(lug/ul) 2ul ； RNase inhibitor(40U/ul) :lul ；lOXAlkaline phosphatasebuffer(MgCl2 free) :5ul ; Alkaline phosphatase (calfintestine)(16U/ul),0. 6ul ；RNase free ddH20 :up to 50ul ； 50°C反應1小時。向上述反應液中加入20ul的3M CH3C00Na(PH5. 2)，130ul的RNasefree ddH20後，充分混勻。加入200ul的苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為25 24 1)，充分混 勻後13000Xg室溫離心5min。將上層水相轉移到新的Microtube中。加入200ul的氯仿， 充分混勻後13000Xg室溫離心5min。將上層水相轉移到新的Microtube中。加入2ul的 NAcarrier後均勻混合。加入200ul的異丙醇，充分混勻後，冰上冷卻lOmin。13000Xg 4°C 離心20min，棄上清。加入500ul的70%冷乙醇(RNase free ddH20配製)漂洗，離心5min， 棄上清後乾燥。加入7ul的RNase free ddH20溶解沉澱，得到CIAP-treated RNA。2. 2 「去帽子」反應配製「去帽子」反應液CIAP-treated RNA :7ul ； RNase inhibitor(40U/ul) lul ；10 X Tap reaction buffer :lul ；Tobaccoacid pyrophosphatase (0. 5U/ul) :lul。37°C反應 1 小時此反應液中 CIAP/TAP-treated RNA，取 5ul用於5』 RACE-Adaptor連接反應，剩餘的5ul保存於_80°C。2.3 5，RACE-Adaptor 的連接。配溶液。CIAP/TAP-treated RNA :5ul ； 5，RACE-Adaptor (15ul) :lul ；RNase free ddH20 :4ul ；65°C保溫 5min 後冰上放 2min，然後 加入下列試劑RNase inhibitor (40U/ul) :lul ；5XRNA Ligation buffer :8ul ；40% PEG 6000 :20ul ；T4 DNA ligase(40U/ul) :lul。16°C反應 1 小時。向上述反應液中加入 20ul 的 3M CH3C00Na (PH5. 2)，140ul 的 RNase free ddH20 後，充分混勻。加入 200ul 的苯酚 / 氯 仿/異戊醇(25 24 1)，充分混勻後13000Xg室溫離心5min。將上層水相轉移到新的 Microtube中。加入200ul的氯仿，充分混勻後13000Xg室溫離心5min。將上層水相轉移
7到新的Microtube中。加入2ul的NAcarrier後均勻混合。加入200ul的異丙醇，充分混勻 後，冰上冷卻lOmin。13000Xg 4°C離心20min，棄上清。加入500ul的70%冷乙醇(RNase free ddH20配製)漂洗，離心5min，棄上清後乾燥。再加入6ul的RNase free ddH20溶解 沉澱，得到ligated RNA。2. 4 反轉錄反應。反應體系為ligated RNA，6ul ；Random primer (50uM),0. 5ul ； 5XM-MLV Buffer, 2ul ；dNTP mixture (lOmM each), 1 U 1 ；RNase inhibitor (40U/ul), 0. 25ul ；Reverse transcriptase M-MLV(RNaseH-) (200U/ul)，0. 25ul。反應條件為30°C， lOmin ；42°C, 1 小時；70°C，15min。保存於 _20°C。2. 5PCR反應。根據3，端測序結果，用Primer Premier軟體設計5，端特異引 物。(l)Outer PCR 反應。反應體系為5，特異性 out primer (10uM), 2ul ；5' RACE out primer (lOuM)，2ul ;cDNA 模板，lul;10XLA PCR Bufferll (Mg2+free), 5ul ；LA Taq(5U/ ul) ,0. 5ul ；MgCl2 (25mM), 5ul ；dNTP (2. 5mM) ,8ul ；ddH20，26. 5ul。反應條件為 94 °C, 2min ； 94°C，30s ；72°C，2min (5 循環)；94°C，30s ；70°C，2min (5 循環)；94°C，30s ；66°C，30s ；70°C 2min(30 循環)；68°C，lOmin ;4°C 保存。(2) Inner PCR 反應。5』特異性 inner primer (lOuM), 2ul ；5' RACE Inner primer (lOuM), 2ul ；Outer PCR 反應液，lul ;LA Taq (5U/ul), 0. 5ul ； dNTP (2. 5mM) ,8ul ； 10 X LA PCR Buffer II (Mg2+free)，5ul ;MgCl2 (25mM)，5ul ;ddH20， 26. 5ul。反應條件為:94°C,30s ；65°C，30s ；68°C，2min(30 循環)；68°C，5min ；4°C保存。3.基因拼接3，端基因測序結果與5，端基因測序結果通過DNA MAN軟體拼接，得到基因cDNA 序列全長。4.基因全長cDNA序列擴增利用cDNA為模板，引物如下CbDRH-上 CCATGGAAATGAGCTCCTATGATCGTAGAT，CbDRH-下 CTCGAGTTGTGTTACAGTTGTCCTACCAAGT。PCR 反應體系為CbDRH-上，lul ；CbDRH-下，lul ； 10 X Taq buffer, 2. 5ul ； cDNA 模板，lul ；dNTP，2ul ；Taq, lul ；MgCl2 (25mM), 2ul ；ddH20，14. 5ul。PCR 反應條件為95°C， 3min ；95°C，40s ；60°C，40s ；72°C 2min (30 循環)；4°C，⑴。擴增得到的CbDRH基因自起始密碼子至終止密碼子總長1452個鹼基，編碼483個
胺基酸。實施例2.轉基因菸草的獲得構建真核表達載體PBI121-35S_CbDRH，轉化農桿菌LBA4404，利用葉盤法轉化煙 草。具體方法如下從平板上挑取含有目的基因的單菌落，接種到3ml YEP液體培養基 中(Rif 40u g/ml, Kan 100 u g/ml)於恆溫搖床上 28 °C，180rpm 暗培過夜至 0D 600 為 0. 6-0. 8。搖培過夜的菌液按-2%的比例，轉入新配置的含有相應抗生素的YEP培養 基中，在與上述相同的條件下培養6h左右，0D600為0. 5左右。5000rpm離心十分鐘收 集菌沉澱，用50mlYEP液體培養基重懸沉澱。取野生型菸草無菌苗的幼嫩葉片，去主脈， 將葉片剪成0. 5cm2的小塊，放入菌液中，浸泡lOmin(其間不斷搖動菌液使其侵染充分)。 取出葉片置於無菌濾紙上吸去附著的菌液。將侵染後的菸草葉片接種在MS+KT(2.0ug/ml)+IAA(1.0ug/ml)固體培養基上，28°C暗培養三天。將黑暗中共培養2_4天的菸草葉片 轉移到 MS+KT(2. Oug/ml)+IAA(l. Oug/ml) +Kan (lOOug/ml) +Cef (200ug/ml)中，用封 口膜封 好培養皿，在光照為30001uX、28°C、16h/8h光暗條件下選擇培養。約2_3周後，待不定芽長 到1cm左右時，切下不定芽並轉移到MS+Kan(200ug/ml)+Cef (200ug/ml)上進行生根培養，
獲得完整植株。提取轉化菸草的總DNA，PCR檢測CbDRH基因是否轉入，對擴增出合適條帶的植株 進一步提取總RNA，獲得cDNA，以cDNA為模板進一步進行PCR檢測，鑑定轉化成功的轉基因 植株。結果發現T2，T3，T6，T8，T13為轉基因植株。實施例3轉基因菸草的抗寒性檢測選取轉基因植株TL3，作為抗寒性檢測的對象(野生型作為對照)，將其置於_4°C 處理12h，觀察植株生長狀態，並測定質膜離子滲漏率。結果發現，野生型在處理後明顯萎 蔫，而轉基因植株尚保持較好的生活力(圖1)，轉基因植株的質膜滲漏明顯小於野生型(圖 2)。表明轉基因菸草的抗低溫能力高於野生型。
權利要求
一種高山離子芥冷誘導基因CbDRH，其核苷酸序列如序列表中序列1所示1)序列表中序列1的DNA序列；ATGAGCTCCTATGATCGTAGATTTGCTGATCCGAATTCGTATCGCCAACGCTCTGGCGCCCCAGTTGGTCCATCTCAGCCAATGGATCCTTCTGCTGCACCGTACAATCCACGATACGGTGGTGGTGGTGGATATGGACCGTCTCCTGTAATGGCCGGTGATGGCTCCGGGTATAGTCGGTACCCAGCTTTCCAGCCACCTACTAGTGGTTTCTCCGTTGGTCGCGGCGGAGGAGGAGGAAGAGGCACATATGGTCAATACGGCGGCGGAGGAGGCGGCGGCAGTGGTGGGAATTGGGGAGGACGTGGTGGTGGATCGAATAAAAGAGAGCTAGATAATGTTTCGCTTCCGAAGCAGAATTTTGGGAATCTTGTCCATTTCGAGAAGAATTTCTACGTGGAAAGCCCCGATGTGCAGGCGATGACAGAACAGGATGTTGCGATGTATAGAACCGGGAGGGATATATCCGTTGAAGGTCGTGATGTTCCTAAGCCGATTAGGATGTTCCAAGATGCTAACTTCCCAGALAATATTCTCGAAGCGATTGCTAAGTTGGGATTCACTGAGCCAACACCGATACAATCTCAGGGATGGCCAATGGCTTTGAAGGGTAGGGATCTGATTGGTATTGCTGAGACTGGCTCTGGTAAGACATTAGCTTACTTGTTACCAGCGTTGGTCCACGTAAGCGCACAACCTCGATTGAGTCAAGATGATGGCCCCATTGTGTTAATATTAGCGCCCACTAGAGAATTAGCTGTTCAGATTCAAGAGGAATCAAGGAAATTCGGTCTGCGATCTGGTGTTAGAAGCACTTGTATCTATGGTGGTGCTCCTAAAGGACCTCAGATTCGCGATCTTAGAAGAGGTGTTGAGATTGTAATTGCTACACCTGGTCGTTTGATCGATATGTTGGAGTGTCAACATACTAATTTGAGGAGAGTAACTTACCTCGTGTTAGATGAAGCTGACCGAATGTTAGACATGGGATTTGAACCCCAAATTAGAAAGATTGTATCTCAGATCCGACCTGATAGACAGACGCTGCTTTGGAGTGCAACATGGCCACGAGAGGTTGAATCTCTTGCCAGGCAGTTTCTACGAGATCCATATAAGGCCATTATTGGATCAGCAGATCTAAAAGCTAACCAGTCTATTAATCAAGTAATCGAGATTGTACCAACGCCAGAGAAATACGCCAGGCTTCTTGCACTGCTTAAACAGTTAATGGATGGGAGTAAAATCCTAATATTCGTGGAGACAAAGAGAGGGTGTGATCAAGTGACTAGACAATTGAGAATGGATGGATGGCCAGCTCTAGCCATACACGGTGACAAGAACCAATCGGAAAGAGATCGAGTCTTGTCAGAATTTAAGAGCGGAAGAAGCCCGATAATGACTGCCACTGATGTAGCAGCAAGGGGACTTGGTAGGACAACTGTAACACAATAG2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；3)該基因的讀碼框為自5』端第1到第1452位鹼基。
2.含有權利要求1所述基因的表達載體。
3.根據權利要求1所述的高山離子芥冷誘導基因CbDRH，其特徵在於所述與植物抗寒 有關的基因CbDRH，具有序列表中序列1的DNA序列。
4.一種由序列表中序列1的DNA序列所述的核苷酸序列所編碼的蛋白質，其胺基酸殘 基序列如序列表中序列2所示序列表中序列2所述胺基酸序列MSSYDRRFADPNSYRQRSGAPVGPSQPMDPSAAPYNPRYGGGGGYGPSPVMAGDGSGYSRYPAFQP PTSGFSVGRGGGGGRGTYGQYGGGGGGGSGGNWGGRGGGSNKRELDNVSLPKQNFGNLVHFEKNF YVESPDVQAMTEQDVAMYRTGRDISVEGRDVPKPIRMFQDANFPDNILEAIAKLGFTEPTPIQSQGffP MALKGRDLIGIAETGSGKTLAYLLPALVHVSAQPRLSQDDGPIVLILAPTRELAVQIQEESRKFGLRSG VRSTCIYGGAPKGPQIRDLRRGVEIVIATPGRLIDMLECQHTNLRRVTYLVLDEADRMLDMGFEPQIRKIVSQIRPDRQTLLWSATWPREVESLARQFLRDPYKAIIGSADLKANQSINQVIEIVPTPEKYARLLALLKQLMDGSKILIFVETKRGCDQVTRQLRMDGWPALAIHGDKNQSERDRVLSEFKSGRSPIMTATDVAARGLGRTTVTQ。
5.將含有權利要求1所述基因的表達載體PBI121-35S-CbDRH轉化農桿菌LBA4404，利用葉盤法轉化菸草獲得轉基因菸草。其在菸草抗寒育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一個高山離子芥冷誘導基因CbDRH，編碼產物及其在抗寒轉基因菸草中的應用。高山離子芥冷誘導的基因CbDRH是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。由上述基因CbDRH編碼的蛋白質，具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列或將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。該基因在低溫下蛋白水平上調了7倍，轉入CbDRH基因的轉基因菸草在低溫下比野生型菸草具有更高的抗寒性。這對於培育抗低溫的優良作物具有重要的理論及實際意義。
文檔編號C12N9/00GK101979582SQ20101023498
公開日2011年2月23日 申請日期2010年7月20日 優先權日2010年7月20日
發明者關淼, 向雲, 孫正龍, 安黎哲, 張華 , 楊玉, 白慕群, 盛紅梅, 陳書燕 申請人:蘭州大學