一種鴿腺病毒的檢測試劑盒的製作方法

2023-09-13 09:01:40

專利名稱：一種鴿腺病毒的檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於病毒檢測技術領域，具體涉及一種鴿腺病毒的檢測試劑盒。
背景技術：
鴿腺病毒感染是由腺病毒(Pigeon adenovirus，FADV)感染引起的急性傳染病，在健康和發病的鴿子中均能分離到腺病毒[1]。1953年，Rowe等首次從扁桃體組織塊培養物中分離出該病毒。此後眾多生物科技工作者相繼發現不同生物體的腺病毒[2]。1984年，Cousement首次敘述了比利時的糹鳥腺病毒感染[3]。鴿腺病毒對外界惡劣環境有較強的抵抗力，對脂溶劑也有抵抗力，抗熱耐酸能力強，但不耐甲醛[4_5]。在4°C可以保存70天，50°C則可以保存10-20分鐘，在56°C 2. 5-5分鐘內會很快死亡[6]。鴿腺病毒必須在其致病因子誘導下才會致病，沒有致病因子的影響，受 腺病毒感染的鴿子不會發病。鴿腺病毒在單獨發病時一般不致死，但大多數感染的病鴿同時也會並發有其他的一些疾病[7_9]。目前鴿腺病毒沒有十分有效的疫苗，不同生物的腺病毒有各自的特異性，不會交叉感染，所以不同動物的腺病毒疫苗也不可交叉使用。該病毒主要在鴿消化道和呼吸道中進行自我複製，在細胞內複製也會形成包涵體。肉眼可見病變以卡他性腸炎為主要病徵。病鴿表現精神萎頓、沉鬱、腹瀉、排淺黃色黏液狀糞便，貧血，黃疸，大腿肌肉出血嚴重的甚至會突然死亡。在早期有輕度呼吸道症狀[1°]。對於成年鴿群，會造成鴿群產蛋量下降。主要的病理症狀是腎臟腫脹、出血、心包積水、法氏囊及胸腺萎縮變小[1°_12]。鴿腺病毒的傳播方式主要是垂直傳播，由親代傳給子代。水平傳播主要通過糞便，飼料，鴿籠等途徑進行傳播。一旦傳入鴿群，則會迅速在鴿群中傳播開來，通常在首次見到本病例後2d內全群發病。臨床症狀通常會在I周內消失，因為隨著腺病毒很快地被清除，腸道上皮幾天後可再生。但是如繼發大腸埃希菌感染則導致更加嚴重和持久的疾病[3]。常規的診斷依靠電鏡、免疫染色或病毒分離，但是這些技術費時、費力，而且敏感性也差。參考文獻[I]De Herdt P，Ducatelle Rj Lepoudre C，et al. An epidemic of fatalhepatic necrosis of viral origin in racing pigeons(Columba livia)[J]. AvianPathol, 1995，24(3) :475-483[2]張俊峰，王之磊，周曉玲·禽的腺病毒病[J]. 2003. 6. 20:20-21[3]胡青海，黃建芳.鴿腺病毒感染[J]· 1999,21 (3) :67-68[4]Freick M，Muller H, RaueR. Rapid detection of pigeon herpesvirus, fowladenovirus and pigeon circovirus in young racing pigeons by multiplex PCR[J]. JVirol Methods, 2008，148(1-2):226-231[5]Vereecken M，de Herdt P，Ducatelle R. Adenovirus infections inpigeons:A review[J]. Avian Pathol，1998，27 (4):333-338[6]王兆平，沈建華，張海曉·鴿腺病毒病[J]· 2008，9 :41-43[7]Goryo M，Ueda Y，Umemura T，et al. Inclusion body hepatitis due toadenovirus in pigeons[J]. Avian Pathol, 1988，17(2):391-401[8]Hess M, Prusas C, Monreal G. Growth analysis of adenoviruses isolatedfrom pigeons in chicken cells and serological characterization of theisolates[J]. Avian Pathol, 1998, 27(2):196-199[9]Hess M, Prusas C, Vereecken M, et al. Isolation of fowl adenovirusesserotype 4 from pigeons with hepatic necrosis[J].Berl Munch Tierarztlffochenschr, 1998，111(4):140-142[10]智海東，王雲峰，解生亮，等.禽腺病毒感染及其診斷[J]. 2010:33-35[IlJffada Y, Kondo H, Nakazawa M, et al. Natural infection with attaching and effacing Escherichia coli and adenovirus in the intestine of a pigeon withdiarrhea[J], J Vet Med Sci,1995, 57(3):531-533[12]Wang CH, Chang CM. Pathogenicity and gene analysis of adenovirus frompigeons with inclusion body hepatitis[J]. J Vet Med Sci, 2000，62 (9):989-99
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種鴿腺病毒的檢測引物。本發明還要解決的技術問題是提供上述鴿腺病毒的檢測試劑盒，以快速、準確的檢測出鴿腺病毒，及時隔離受病鴿，避免傳染。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下一種用於檢測鴿腺病毒的引物對，如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。一種鴿腺病毒檢測試劑盒，包含上述的引物對。一種鴿腺病毒檢測試劑盒，包括(I)鴿腺病毒陽性和陰性對照；(2)鴿腺病毒特異性引物對上遊引物Pl :如SEQ ID NO 1所示；下遊引物P2 :如SEQ ID NO 2所示；(3) DNA提取試劑採用Geneaid公司生產的病毒核酸提取試劑盒(Viral NucleicAcid Extraction Kit II)；(4)PCR 反應試劑:由上遊引物 Pl 15 μ L(IOmM)，下遊引物 P215 μ L(IOmM)，2XPCRMaster Mix 200 μ L, ddH20 (超純水)100 μ L 組成；(5)電泳檢測試劑由50 X TAE電泳緩衝液20mL，GoldView 100 μ L組成。採用上述試劑盒的檢測方法，包括如下步驟(I )DNA的提取採用Geneaid公司生產的的病毒核酸提取試劑盒(Viral NucleicAcid Extraction Kit II)，根據說明書提取病毒的DNA ;(2) PCR 擴增25「1^體系2\卩0 Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6.5 yL;上遊引物 Pl I μ L ;下遊引物P21yL和模板2yL ;；PCR反應條件94°C 5min，90°C lmin，61°C lmin，72°C lmin，36個循環；72°C IOmin ；4°C保存。( 3 )瓊脂糖凝膠電泳將PCR擴增產物加樣到1%的瓊脂糖中，將瓊脂糖放在電泳儀中進行電泳40分鐘左右，使用成像系統記錄結果；(4)判斷結果如果擴增出一條600bp特異性片段，則表明待檢組織鴿腺病毒陽性；如果沒有擴增出片段，則表明待檢組織鴿腺病毒陰性。有益效果由於本發明採用的引物來自鴿腺病毒基因中高度保守的區域，採用該 引物對能準確、快速、方便的判別病料中是否含有鴿圓環病毒，靈敏度達O. 04 μ L的模板DNA ;本研究針對鴿腺病毒基因中高度保守的區域設計引物，建立一種PCR檢測鴿腺病毒的方法。通過實驗證明該方法具有敏感性高、特異性好的特點，是一種快速準確檢測鴿腺病毒的方法，填補了國內空白。


圖I =FADV 的 PCR 檢測結果。其中，I =Marker, 2-4 PCR product。圖2 :不同的退火溫度檢測結果。其中，I. Marker，2.55 °C，3.61 °C，4.59 °C，5. 63°C,6. 57°C, 7. 65。。。圖3 :特異性鑑定檢測結果。其中，l.Marker，2.PiCV，3.PIHV，4.FADV。圖4 :敏感性試驗檢測結果。其中，I. Marker，2. 1:1,3. 1:2,4. 1:4,5. 1:8,6. 1:16,7.1:32,8.1:64,9. 1:128,10. 1:256,11. 1:512。圖5 :部分臨床病料檢測結果(5、6、7為陰性)。其中，I. Marker，2_7 :PCRproduct。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例I :試劑盒的製備。I、病料。從浙江、江蘇、安徽、山東、上海、福建等地的鴿場採取病鴿的135份血清；病料由金陵科技學院預防獸醫學教研室保存。2、試劑。DNA提取試劑盒(Viral nucleic acid extraction kit II) ；2xTaq Master Mix,南京博爾迪生物科技有限公司生產Aoldview核酸染料，賽百盛公司生產；瓊脂糖，北京拜爾迪生物科技有限公司；10xTBE ;Marker，上海科興生物技術有限公司。3、引物的設計和合成。根據已發表的腺病毒的基因序列，利用primer premier 5. O設計引物，由上海英俊公司合成。預計大小為600bp。上遊引物pFADV15』 -CAATAGCATCTCCGGGGTGG-3』 ；下遊引物pFADV25，-TTCGTAGCCGTCGTTGTTGA-3，。4、試劑盒中其他成分的製造。
4. IDNA提取試劑購自Geneaid公司生產的的病毒核酸提取試劑盒(ViralNucleicAcid Extraction Kit II)。4. 2超純水(ddH20)的製備。購自Takara 公司，ImL/ 管。4. 32XPCP master Mix 的製備。購自南京博爾迪生物科技有限公司，ImL/管。4. 4 50XTAE電泳緩衝液的製備。O. 5mol/L乙銨四乙酸二鈉((EDTA)溶液(ρΗ8· O)配製
EDTA18.61 g
滅_雙蒸水80mL
M氧化鈉調pH至8.0
滅菌雙蒸水加至100mL。50 X TAE電泳緩衝液配製
三羥甲基氨基甲烷(Tris)242g
冰乙酸57. ImL
0.5nio 1/L EDTA 溶液(pHS.O)IOOmL
滅菌雙蒸水加至IOOOmLo使用時滅菌雙蒸水稀釋50倍。4. 5Glodview核酸染料的製備。購自上海賽百盛基因技術有限公司，ImL/管。4. 6上樣緩衝液的製備。購自南京博爾迪生物科技有限公司，ImL/管。4. 7引物的製備。引物由上海英俊合成，20D/管。實施例2 :檢測方法。主要儀器如下PCR儀，西安天隆科技有限公司製造；電泳槽，北京鑫科奧商貿有限公司；成像系統，廈門億辰科技有限公司。具體方法如下(I) DNA 的提取米用 DNA 提取試劑盒(Viral nucleic acid extraction kitII )，根據說明書提取病毒的DNA (la)移取200 μ I血清樣品到I. 5mlEP管中，如果樣品不足200 μ 1，用PBS緩衝液調整至200 μ I。加400 μ I的VB lysis buffer到樣品中混勻。在室溫下放置lOmin。(lb)加450 μ I的AD buffer到樣品中立即混勻。移取上面600 μ I的混合液到VBcolumn。以13000rpm轉速離心lmin。離心後棄去下面的液體,再加上剩下的混合液到同一個VB column中。以13000rpm轉速離心lmin,棄去收集管中的液體,然後將VBcolumn轉移到新的2ml的收集管中。(Ic)加 400 μ I 的 Wlbuffer 到 VB column 中，以 13000rpm 轉速離心 lmin。棄去收集管中的液體。加600 μ I的Wash buffer到VB column中，以13000rpm轉速離心lmin,棄去收集管中的液體，以13000rpm轉速離心lmin。(Id)將乾燥的VB column放到一個乾淨的I. 5ml的EP管裡。加50 μ I的無RNA酶水到VB column管膜中心,靜置3min,直至水被完全吸收，以13000rpm轉速離心lmin。
(2) PCR 擴增25「1^體系2\卩0 Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6.5 yL;上遊引物 Pl I μ L ;下遊引物Ρ21 μ L和模板2 μ L ;PCR反應條件94°C 5min，90°C lmin，61°C lmin, 72°C lmin，36 個循環；72°C IOmin ；
4°C保存。( 3 )瓊脂糖凝膠電泳將PCR擴增產物加樣到1%的瓊脂糖中，將瓊脂糖放在電泳儀中進行電泳40分鐘左右，使用成像系統記錄結果；(4)判斷結果如果擴增出一條600bp特異性片段，則表明待檢組織鴿腺病毒陽性；如果沒有擴增出片段，則表明待檢組織鴿腺病毒陰性。實施例3 =PCR擴增條件的優化。對退火溫度進行優化，分別在其它條件都一致的情況之下，設定了 6個不同的退火溫度，分別是55°〇、571、591、611、631、651。用優化的條件對三個陽性鴿腺病毒的DNA進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳，擴增出一條大小為600bp左右的特異性片段，大小與預期相符，結果如圖I。對PCR條件的優化是通過六個不同的退火溫度實現的，六個不同的退火溫度所得的結果都很理想，結果如圖2，因為在多次的驗證中，ere具有更強的穩定性，所以現在把ere作為優化的最終結果。實施例4 :特異性試驗。用相同的方法提取鴿皰疹病毒(PIHV)、鴿圓環病毒的DNA，並和鴿腺病毒(FADV)的DNA —起作為模板，用設計的引物進行PCR擴增，對優化的PCR條件的特異性進行檢測。並將PiAV的PCR產物送到測序公司進行測序，測得的基因序列與已發表的PiAV的基因序列進行比對。用相同的方法提取PIHV、PiCV的DNA，並以此為模板，用設計的引物進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3。實施例5 :敏感性試驗。將鴿腺病毒的陽性DNA進行倍比稀釋，共做10^1:2°,1:2\1:22,1:2\1:2\1:25、1:26、1:27、1:28、1:29，然後用設計的引物進行擴增，對優化的PCR條件的敏感性進行檢測。
以提取的DNA為模板，從20 μ IDNA開始倍比稀釋，共做10管I: I、1: 2、1: 4、1: 8、1:16、1:32、1:64、1: 128、1:256、1:512，用設計的弓丨物進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳。結果表明PCR方法可檢測出O. 04 μ I的模板DNA，具有很高的敏感性。同時由於病料來自於六個不同的省份，說明其發病率較高，致死率也較高，結果如圖4。實施例6 :試劑盒穩定性的研究。試劑盒保存於_20°C，每隔3個月取出，重新以鴿腺病毒陽性DNA為模板進行PCR檢測，以電泳結果作為判斷依據，連續做該項研究一年時間。將PCR反應試劑混合後保存於-20°C。經過一年的保存和反覆凍融後，用FADV模板進行檢測，結果表明，該試劑盒的穩定性較好，一年之後仍然具有很高的檢出率，說明可以長期保存。實施例7 臨床病料檢測。 使用實施例2的方法對135份臨床病料進行檢測。135份鴿子血清所提的DNA中，其中有61份檢測為陽性，感染率很高，同時由於病料來自於六個不同省份的鴿場，說明其發病率較高，致死率也較高，部分結果如圖5。
權利要求
1.一種用於檢測鴿腺病毒的引物對，其特徵在於如SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
2.一種鴿腺病毒的檢測試劑盒，其特徵在於，它包含權利要求I所述的引物對。
3.根據權利要求2所述的鴿腺病毒的檢測試劑盒，其特徵在於包括 (1)鴿腺病毒陽性和陰性對照； (2)鴿腺病毒特異性引物對 上遊引物Pl :如SEQ ID NO 1所示； 下遊引物P2 :如SEQ ID NO 2所示； (3)DNA提取試劑採用南京博爾迪生物科技有限公司生產的DNA提取試劑盒；(4)PCR反應試劑由2x Taq Master Mix 12. 5 μ L，上遊引物P12 μ L，超純水6· 5 μ L組成； (5)電泳檢測試劑:由50X TAE電泳緩衝液20mL, GoldView 100 μ L組成。
全文摘要
本發明公開了一種用於檢測鴿腺病毒的引物對，如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。本發明還公開了包含上述引物對的試劑盒。由於本發明採用的引物來自鴿腺病毒基因中高度保守的區域，採用該引物對能準確、快速、方便的判別病料中是否含有鴿圓環病毒，靈敏度達0.04μL的模板DNA；本研究針對鴿腺病毒基因中高度保守的區域設計引物，建立一種PCR檢測鴿腺病毒的方法。通過實驗證明該方法具有敏感性高、特異性好的特點，是一種快速準確檢測鴿腺病毒的方法，填補了國內空白。
文檔編號C12R1/93GK102876812SQ20121040410
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月22日 優先權日2012年10月22日
發明者張志成, 戴鼎震, 孫海林 申請人:金陵科技學院