一種三組份生物膠水及其製備與應用的製作方法
2023-09-13 05:07:30 3
(一)技術領域
本發明涉及一種用於軟組織及重要器官缺損修復的三組份生物膠水、及其製備與應用，可用於組織工程領域。
(二)
背景技術：
軟組織包括人體的皮膚、皮下組織、肌肉、肌腱、韌帶、關節囊、滑膜囊，神經、血管等。軟組織經常會由於外力作用導致創傷或缺損，其中小創傷可以自發修復，對於大創傷和缺損，機體的自修復能力十分有限。重要器官，如肝臟，心臟，也會由於先天性的疾病或者外力作用導致缺損，同樣，機體自我修復能力也十分有限。
對於大創傷和重要器官缺損，在臨床治療上也缺少相應的修復手段。目前主流的治療手段是自體組織移植和手術縫合，通過對缺損處先用止血布按壓止血，然後植入自體組織，再進行手術縫合來達到促進組織缺損修復的目的。但這些治療方式存在很多缺陷，如：按壓止血會導致組織壞死，自體組織供應不足以及手術縫合會導致疤痕等。另外，多數缺損修復需要二次手術才能完成，創傷也較大，給患者帶來不便、痛苦和經濟上的負擔。因此，我們希望找到一種簡單有效的治療手段，免去手術治療的不利影響。
近年來，水凝膠因其操作方便，可塑性強，同時又能夠為幹細胞增殖分化提供一個適宜的微環境等特點，受到了研究者的廣泛關注。美國alikhademhosseini研究團隊和中國研究團隊利用一種光交聯的水凝膠(gelma)混合靜電紡絲纖維(plga)作為敷料來促進傷口的癒合。(xinzhao,xiaomingsun,larayildirimeretal.cellinfiltrativehydrogelfibrousscaffoldsforacceleratedwoundhealing,actabiomaterialia,2016.10.017.)。韓國haeshinlee研究團隊合成了一種多巴胺改性的透明質酸的水凝膠用來治療肝臟和心臟缺損。(jisooshin,jungseunglee,changhyunleeetal.tissueadhesivecatechol-modifiedhyaluronicacidhydrogelforeffective,minimallyinvasivecelltherapy,adv.funct.mater.2015,25,3814-3824.)。
然而，上述的幾種水凝膠其本身的組織的黏附力或力學性質仍然有待改善，本發明利用醛基和氨基能夠反應形成席夫鹼的原理，醛基化的天然多糖可以和軟組織及重要器官缺損表面的氨基反應生成席夫鹼，使水凝膠能夠與軟組織或重要器官相整合，從而幹細胞等細胞可以遷移進入水凝膠內部進行增殖分化，形成新生組織。同時丙烯酸酐接枝的天然高分子可以光交聯快速成膠(最快可達1s)，這種三組份生物膠水，一方面具備可調節的力學特性，同時具有組織黏附性且原位成膠，操作方便，可以達到有效修復軟組織及重要器官缺損的目的，避免了二次手術帶給病人的痛苦。另外，製備生物膠水的原料均是天然高分子或多糖，無毒性，可降解，因此，這種三組份生物膠水是一種理想的軟組織及重要器官缺損修復材料。
(三)
技術實現要素：
本發明目的是提供一種用於軟組織及重要器官缺損修復的三組份生物膠水及其製備與應用，解決了目前臨床治療供體缺乏和移植物不能與缺損處吻合等問題。
本發明採用的技術方案是：
本發明提供一種三組份生物膠水，所述三組份生物膠水由質量濃度1～20％的醛基化天然多糖溶液，質量濃度1～20％的氨基改性天然生物高分子溶液和質量濃度1～15％的丙烯酸酐接枝天然高分子溶液按體積比1:0.1-2:0.1-2混合製成；所述醛基化天然多糖溶液以去離子水或ph值6～6.5的水為溶劑製成，其中天然多糖為葡聚糖、透明質酸、海藻酸鈉、羧甲基纖維素或硫酸軟骨素中的一種，醛基氧化率為20～50％；所述氨基改性天然生物高分子溶液以去離子水或ph值6～6.5的水為溶劑製成，其中天然生物高分子為透明質酸、明膠、海藻酸鈉、硫酸軟骨素、絲膠或膠原中的一種，氨基接枝率為40～80％；所述丙烯酸酐接枝天然高分子溶液以去離子水為溶劑製成，其中天然生物高分子為明膠、絲素蛋白、海藻酸鈉、羧甲基纖維素、透明質酸或葡聚糖中的一種，丙烯酸酐接枝率為45～85％。
進一步，優選所述三組份生物膠水由質量濃度1～20％的醛基化天然多糖溶液，質量濃度1～20％的氨基改性天然生物高分子溶液和質量濃度1～15％的丙烯酸酐接枝天然高分子溶液按體積比1：1：2混合製成。
進一步，優選所述醛基化天然多糖溶液中天然多糖為葡聚糖、透明質酸或硫酸軟骨素中的一種。
進一步，優選所述氨基改性天然生物高分子溶液中天然生物高分子為透明質酸、明膠或海藻酸鈉中的一種。
進一步，優選所述丙烯酸酐接枝天然高分子溶液中天然生物高分子為明膠、透明質酸或葡聚糖中的一種。
進一步，優選所述醛基化天然多糖按如下方法製備：1)將天然多糖溶於去離子水或ph為6～6.5的水中，配製成質量濃度1～10％的溶液，待完全溶解後，加入氧化劑，20～35℃避光反應1～24h，之後用乙二醇終止反應；所述氧化劑為高碘酸鈉、高氯酸鈉、高碘酸鉀或高氯酸鉀中的一種，所述氧化劑與天然多糖的質量之比為0.5-1：1，所述乙二醇加入量與天然多糖等質量；
2)將步驟1)反應液以去離子水為透析液，15-35℃透析2～7天，之後取透析袋內溶液放置在-20℃下保存0.5～3小時，隨後在-80℃放置5～12小時；再在-50℃，1～99pa的條件下凍幹24～96小時，即得到醛基化天然多糖。
進一步，優選所述氨基改性天然生物高分子按如下方法製備：將天然生物高分子溶於去離子水，配製成質量濃度為1％～15％的溶液，隨後加入醯肼類有機物，完全混合後，加入催化劑，調節ph到3～7並維持4～8h，隨後室溫攪拌反應24h～48h，將反應液以去離子水為透析液，4-35℃透析2～7天，取透析袋內溶液在-50℃，1～99pa的條件下凍幹24～96小時，即得到氨基改性天然生物高分子；所述醯肼類有機物為聯氨或己二酸二醯肼；所述催化劑為等摩爾比的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基丁二醯亞胺(nhs)混合物或等摩爾比的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和1-羥基苯並三氮唑水合物(hobt)混合物，所述醯肼類有機物與天然生物高分子物質的量之比為1-30:1，所述催化劑與天然生物高分子物質的量之比為1-5:1。
進一步，優選所述丙烯酸酐接枝天然高分子按如下方法之一製備：(1)將天然高分子溶於去離子水或二甲基亞碸，配置成質量濃度為1％～15％的溶液，加入丙烯酸酐類有機物，完全混合後，加入催化劑，室溫攪拌反應24～48h，將反應液先用過量丙酮沉澱，重溶於去離子水，再以去離子水為透析液，4-30℃透析2～7天，取透析袋內溶液在-50℃，1～99pa的條件下凍幹24～96小時，即得到丙烯酸酐接枝天然高分子；所述催化劑為4-二甲基氨基吡啶；所述丙烯酸酐類有機物為甲基丙烯酸酐或甲基丙烯酸縮水甘油酯；所述丙烯酸酐類有機物體積用量以天然高分子質量計為0.1～5ml/g，所述催化劑與天然高分子的質量之比為0.1～1:1；(2)將天然高分子溶於去離子水或二甲基亞碸，配置成質量濃度為1％～15％的溶液，加入丙烯酸酐類有機物，完全混合後，室溫攪拌反應4～10h，將反應液以去離子水為透析液，15-30℃透析2～7天，取透析袋內溶液在-50℃，1～99pa的條件下凍幹24～96小時，即得到丙烯酸酐接枝天然高分子；所述丙烯酸酐類有機物為甲基丙烯酸酐或甲基丙烯酸縮水甘油酯；所述丙烯酸酐類有機物體積用量以天然高分子質量計為0.1～5ml/g。
本發明還提供一種所述三組份生物膠水在製備軟組織及器官缺損修復劑中的應用，所述所述修復劑是由三組份生物膠水與光引發劑混勻而成；所述光引發劑為苯基-2，4，6-三甲基苯甲醯亞膦酸鋰鹽(lap)，加入光引發劑的量為三組份生物膠水中丙烯酸酐接枝天然高分子質量的1～3％。所述修復劑使用方法如下：將三組份生物膠水與光引發劑混勻後，注射到軟組織及器官缺損處，先用波長為365nm～420nm的光照射1s～1min，即可完成對軟組織及器官缺損修復的應用操作。
本發明所述ph值6～6.5的水是指用鹽酸調節去離子水ph值至6～6.5。
由醛基化的天然多糖溶液和氨基改性的天然生物高分子溶液反應形成一層網絡結構，具有組織黏附性；丙烯酸酐接枝的天然高分子溶液添加光引發劑光交聯形成另一層網絡結構，可以增強水凝膠力學性能，通過注射到軟組織及重要器官缺損處原位成型達到修復的目的。所述的軟組織及重要器官缺損包括軟骨缺損，皮膚缺損，肝臟缺損和心臟缺損。所述的丙烯酸酐接枝的天然高分子溶液光交聯形成一層網絡，增強力學性能。
與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在：本發明提供的一種用於軟組織及重要器官缺損修復的三組份生物膠水的組織黏附性，成膠時間和力學強度，可以通過醛基化的天然多糖中醛基含量、氨基改性的天然生物高分子中氨基的接枝量、丙烯酸酐接枝的天然高分子中丙烯酸酐的接枝量，醛基化的天然多糖溶液濃度，氨基改性的天然生物高分子溶液濃度和丙烯酸酐接枝的天然高分子溶液的濃度來控制。通過增加天然多糖中醛基含量和提高醛基化天然多糖溶液濃度可以增加凝膠的組織黏附性，降低成膠時間和增強力學強度；通過增加氨基改性天然生物高分子中氨基的接枝量和氨基改性的天然高分子溶液濃度，可以降低成膠時間和增強力學強度；增加丙烯酸酐接枝的天然高分子中丙烯酸酐的接枝量和提高丙烯酸酐接枝的天然高分子溶液濃度可以增強力學強度。本發明採用改性的天然多糖和天然生物高分子，生物安全性好，用法簡單，避免了二次手術帶給病人的創傷，可用於組織工程領域。
(四)附圖說明
圖1為實施例1三組份生物膠水實物的照片。
圖2為實施例5三組份生物膠水原液注射到軟骨缺損處及成膠後的照片。
圖3為實施例5三組份生物膠水與軟骨整合的掃描電鏡圖。
圖4為實施例6三組份生物膠水內部孔隙及孔徑大小的掃描電鏡圖。
圖5為實施例2三組份生物膠水用於修復軟骨缺損的結果圖(16周後取樣)。
(五)具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述(以軟骨缺損修復為例)，但本發明的保護範圍並不僅限於此：
實施例1
1)醛基化天然多糖：將2g羧甲基纖維素溶於100ml去離子水配製成質量濃度2％溶液，待完全溶解後，加入1g高碘酸鈉，20℃避光反應1h，之後用1.8ml的乙二醇終止反應。將反應液倒入透析袋(透過分子量為8000-14000da)中以去離子水為透析液，15℃透析2天，之後放置在-20℃下保存0.5小時，隨後在-80℃放置5小時，再在-50℃，1pa的條件下凍幹24小時，獲得醛基氧化率為40％的醛基化羧甲基纖維素。
2)丙烯酸酐接枝天然高分子：將1mmol透明質酸溶於100ml去離子水，隨後加入1mmol聯氨，完全混合後，加入1mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和1mmol的n-羥基丁二醯亞胺(nhs)混合物，調節ph到3並維持4h，隨後20℃攪拌反應24h。將反應液倒入透析袋(透過分子量為8000-14000da)中以去離子水為透析液，10℃透析2天，以-50℃，1pa的條件下凍幹24小時，獲得氨基接枝率為80％的氨基改性透明質酸。
3)丙烯酸酐接枝天然高分子：將10g葡聚糖溶於100ml去離子水配製成質量濃度10％溶液，待完全溶解後，加入10ml的甲基丙烯酸縮水甘油酯。完全混合後，加入1g的4-二甲基氨基吡啶，室溫攪拌反應48h。將反應溶液先用過量丙酮沉澱，再重溶於水，倒入透析袋(透過分子量為8000-14000da)中以去離子水為透析液，4℃透析3天，以-50℃，99pa的條件下凍幹72小時，獲得丙烯酸酐接枝率為70％的丙烯酸酐接枝的葡聚糖。
4)三組份生物膠水的應用：用去離子水將步驟(1)的醛基化羧甲基纖維素配製成質量濃度5％的溶液，用去離子水將步驟(2)的氨基改性透明質酸配製成質量濃度5％的溶液，用去離子水將步驟(3)的丙烯酸酐接枝的葡聚糖配製成質量濃度10％的溶液，然後按體積比1:1:2混合製成三組份生物膠水，添加佔三組份生物膠水中丙烯酸酐接枝天然高分子質量的3％的光引發劑苯基-2，4，6-三甲基苯甲醯亞膦酸鋰鹽(lap)，用注射器注射1ml到軟骨缺損處，該軟骨缺損是利用活體動物紐西蘭兔後腿關節人工造模，缺損為直徑4mm，深4mm的圓柱體，用波長為365nm的光照射30s，從而進行軟骨缺損修復。軟骨缺損得到很好修復，且新生軟骨也原組織界面癒合很好。
實施例2
1)醛基化天然多糖：將10g葡聚糖(分子量70000)溶於100ml去離子水配製成質量濃度10％溶液，待完全溶解後，加入10g高氯酸鈉，25℃避光反應3h，之後用9ml乙二醇終止反應。將反應液倒入透析袋(透過分子量為8000-14000da)中以去離子水為透析液，25℃透析7天，之後取截留液放置在-20℃下保存3小時，隨後在-80℃放置12小時，再以-50℃，99pa的條件下凍幹96小時，獲得醛基氧化率為50％的醛基化葡聚糖。
2)氨基改性天然生物高分子：將1mmol(購自sigma)明膠溶於100ml去離子水，隨後加入30mmol己二酸二醯肼。完全混合後，加入5mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和5mmol的1-羥基苯並三氮唑水合物(hobt)混合物，調節ph到7並維持8h，隨後40℃攪拌反應48h。將反應液倒入透析袋(透過分子量為8000-14000da)中以去離子水為透析液，20℃透析7天，取截留液以-50℃，99pa的條件下凍幹96小時，獲得氨基接枝率為75％的氨基改性明膠。
3)丙烯酸酐接枝天然高分子：將1g海藻酸鈉溶於100ml去離子水配製成質量濃度1％溶液，待完全溶解後，加入5ml甲基丙烯酸酐。完全混合後，室溫攪拌反應10h。將反應液直接倒入透析袋(透過分子量為8000-14000da)中以去離子水為透析液，25℃透析4天，取截留液以-50℃，1pa的條件下凍幹48小時，獲得丙烯酸酐接枝率為80％為丙烯酸酐接枝海藻酸鈉。
4)三組份生物膠水的應用：用去離子水將步驟(1)醛基化葡聚糖配製成質量濃度10％的溶液，用去離子水將步驟(2)氨基改性明膠配製成質量濃度10％的溶液，用去離子水將步驟(3)丙烯酸酐接枝海藻酸鈉配製成質量濃度15％的溶液，按體積比1:1:2的比例混合製成三組份生物膠水，添加佔三組份生物膠水中丙烯酸酐接枝天然高分子質量的2％的光引發劑苯基-2，4，6-三甲基苯甲醯亞膦酸鋰鹽(lap)，用注射器注射1ml到軟骨缺損處(缺損模型同實施例1)，用波長為405nm的光照射1min，從而進行軟骨缺損修復(結果如圖5所示)。軟骨缺損得到很好修復，且新生軟骨也原組織界面癒合很好。
實施例3
1)醛基化透明質酸：將2g透明質酸溶於100ml去離子水配製成質量濃度2％溶液，待完全溶解後，加入2g高碘酸鉀，避光25℃反應12h，之後用1.8ml乙二醇終止反應。將反應液倒入透析袋(透過分子量為8000-14000da)中以去離子水為透析液，15℃透析4天，之後取截留液放置在-20℃下保存1.5小時，隨後在-80℃放置10小時，再在-50℃，50pa的條件下凍幹48小時，獲得醛基氧化率為42％的醛基化透明質酸。
2)丙烯酸酐接枝海藻酸鈉：將1mmol海藻酸鈉溶於100ml去離子水，隨後加入15mmol己二酸二醯肼。完全混合後，加入3mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和3mmol的n-羥基丁二醯亞胺(nhs)混合物，調節ph到5並維持6h，隨後室溫攪拌反應36h。將反應液倒入透析袋(透過分子量為
8000-14000da)中以去離子水為透析液，25℃透析4天，取截留液以-50℃，50pa的條件下凍幹72小時，獲得氨基接枝率為65％的丙烯酸酐接枝海藻酸鈉。
3)丙烯酸酐接枝明膠：將10g(購自sigma)明膠溶於100ml去離子水配製成質量濃度10％溶液，待完全溶解後，加入5ml甲基丙烯酸酐。完全混合後，室溫攪拌反應5h。將反應液直接倒入透析袋(透過分子量為8000-14000da)中以去離子水為透析液，40℃透析5天，取截留液以-50℃，50pa的條件下凍幹48小時，獲得丙烯酸酐接枝接枝率為75％的丙烯酸酐接枝明膠。
4)三組份生物膠水的應用：用去離子水將步驟(1)醛基化透明質酸配製成質量濃度10％的溶液，用去離子水將步驟(2)氨基改性海藻酸鈉配製成質量濃度15％的溶液，用去離子水將步驟(3)丙烯酸酐接枝明膠配製成質量濃度15％的溶液，按體積比1:1:2的比例混合製成三組份生物膠水，添加佔三組份生物膠水中丙烯酸酐接枝天然高分子質量的3％的光引發劑苯基-2，4，6-三甲基苯甲醯亞膦酸鋰鹽(lap)，用注射器注射到軟骨缺損處(缺損模型同實施例1)，用波長為380nm的光照射45s，從而進行軟骨缺損修復。軟骨缺損得到很好修復，且新生軟骨也原組織界面癒合很好。
實施例4
1)醛基化海藻酸鈉：將5g海藻酸鈉溶於100ml去離子水配製成質量濃度5％溶液，待完全溶解後，加入5g高氯酸鉀，35℃避光反應18h，之後用4.5ml乙二醇終止反應。將反應溶液倒入透析袋(透過分子量為8000-14000da)中以去離子水為透析液，30℃透析6天，之後取截留液放置在-20℃下保存2小時，隨後在-80℃放置10小時，再在-50℃，99pa的條件下凍幹48小時，獲得醛基氧化率為35％的醛基化海藻酸鈉。
2)氨基接枝硫酸軟骨素：將1mmol硫酸軟骨素溶於100ml去離子水，隨後加入20mmol己二酸二醯肼。完全混合後，加入2mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和2mmol的1-羥基苯並三氮唑水合物(hobt)混合物，調節ph到7並維持5h，隨後室溫攪拌反應48h。將反應液倒入透析袋(透過分子量為8000-14000da)中以去離子水為透析液，25℃透析6天，取截留液以-50℃，99pa的條件下凍幹72小時，獲得氨基接枝率為80％的氨基接枝硫酸軟骨素。
3)丙烯酸酐接枝羧甲基纖維素：將3g羧甲基纖維素溶於100ml去離子水配製成質量濃度3％溶液，待完全溶解後，加入3ml甲基丙烯酸酐。完全混合後，室溫攪拌反應10h。將反應液直接倒入透析袋(透過分子量為8000-14000da)中以去離子水為透析液，25℃透析5天，取截留液以-50℃，99pa的條件下凍幹72小時，獲得丙烯酸酐接枝率為65％的丙烯酸酐接枝羧甲基纖維素。
4)三組份生物膠水的應用：用去離子水將步驟(1)醛基化海藻酸鈉配製成質量濃度15％的溶液，用去離子水將步驟(2)氨基改性硫酸軟骨素配製成質量濃度15％的溶液，用去離子水將步驟(3)丙烯酸酐接枝羧甲基纖維素配製成質量濃度15％的溶液，按體積比1:1:2的比例混合製成三組份生物膠水，添加佔三組份生物膠水中丙烯酸酐接枝天然高分子質量的1％的光引發劑苯基-2，4，6-三甲基苯甲醯亞膦酸鋰鹽(lap)，用注射器注射到軟骨缺損處(缺損模型同實施例1)，用波長為365nm的光照射30s，從而進行軟骨缺損修復。軟骨缺損得到很好修復，且新生軟骨也原組織界面癒合很好。
實施例5
根據實施例3方法製成三組份生物膠水，並用注射器注射1ml覆蓋軟骨缺損處，先用波長為380nm的光照射45s，37℃恆溫箱中再讓醛基化的天然多糖和氨基改性的天然生物高分子反應，並與軟骨缺口表面氨基反應，待完全成膠後，如圖2所示，-20℃下存放2小時，隨後-80℃存放過夜，之後以-50℃，99pa的條件凍幹48小時，進行掃描電鏡制樣並拍攝，如圖3所示，生物膠水與軟骨可以很好的整合，界面光滑，說明生物膠水組織黏附性好。
實施例6
根據實施例3方法製成三組份生物膠水，先用波長為365nm的光照射30s，37℃恆溫箱中再讓醛基化的天然多糖和氨基改性的天然生物高分子反應，待完全成膠後，-20℃下存放3小時，隨後-80℃存放過夜，之後以-50℃，99pa的條件凍幹72小時，進行掃描電鏡制樣並拍攝，如圖4所示，分別為50倍，100倍和300倍的電鏡圖，可以看出，生物膠水內部孔隙率良好，孔徑大小在100～200微米之間，適合細胞的遷移，增殖和分化。