病毒載體和基因治療應用的製作方法
2023-09-13 09:52:20
專利名稱：病毒載體和基因治療應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的病毒載體，它們的製備和基因治療用途。還涉及含有所述病毒載體的藥物組合物。更具體地，本發明涉及來自動物的重組腺病毒作為基因治療載體的應用。
基因治療在於通過向病體細胞或器官中引入一種遺傳信息以糾正缺陷或異常(突變、異常表達等)。該遺傳信息或在體外引入從器官中取出的細胞中，然後修飾後的細胞再返回機體中，或在體內直接引入適當組織中。在後一情形下，存在不同技術，其中各種轉染技術涉及DNA與DEAE—葡聚糖的複合物(Pagano等，J.Virol.1(1967)891)、DNA與核蛋白的複合物(Kaneda等，Science243(1989)375)、DNA與脂質的複合物(Felgner等，PNAS 84(1987)7413)、脂質體的使用(Fraley等，J.Biol.Chem.255(1980)10431)等。最近，使用病毒作為轉移基因的載體已顯示是這些物理轉染技術的有利替代技術。關於這一點，已經試驗了不同病毒感染某些細胞群的能力。特別是逆轉錄病毒(RSV、HMS、MMS等)、HSV病毒、腺伴隨病毒和腺病毒。
在這些病毒中，腺病毒具有用於基因治療的某些令人感興趣的特徵。特別是，它具有足夠大的宿主譜，能夠感染休止細胞，不整合在所感染細胞的基因組中。由於這些原因，腺病毒已用於體內基因轉移。實際上已製備了帶有不同基因(β—gal，OTC，α—1AT，細胞因子等)的來自腺病毒的不同載體。現有技術中描述的用於人體基因治療的所有腺病毒載體，迄今為止都是從人源的腺病毒開始製備的。因為這對這種應用似乎是最適合的。為了限制其在體內增殖並形成感染顆粒的可能性，所用腺病毒一般以某種方式修飾使其在所染細胞中無法複製。因此現有技術中描述的構建係為缺失E1(E1a和/或E1b)區及有時缺失E3區的的腺病毒，在此基礎上插入所感興趣的序列(Levrero等，Gene 101(1991)195；Gosh—Choudhury等，Gene 50(1986)161)。然而除這一階段需要修飾外，現有技術中描述的載體還存在其它限制其基因治療應用的缺陷，特別是與野生型腺病毒重組的危險。
本發明涉及來自動物的重組腺病毒在人體基因治療中的應用。本發明基於證實來自動物的腺病毒能夠高效地感染人細胞。本發明還基於證實來自動物的腺病毒在已測試的人細胞中不能增殖。本發明最後基於來自動物的腺病毒決不會被來自人的腺病毒反式互補這一令人驚異的發現，這完全消除了在人腺病毒存在下在體內重組並增殖，從而導致感染性顆粒形成的危險。這樣，本發明的載體就特別有利，因為使用病毒作為基因治療載體的固有危險如病原性、傳播、複製、重組等，都被大大減小，甚至消除。
本發明因此提供特別適於目標DNA序列在人體中轉移和/或表達的病毒載體。
本發明的第一個目的涉及含有外源DNA序列的來自動物的重組腺病毒在製備用於治療和/或外科處理人體的藥物組合物中的用途。
在本發明範圍內可用的動物腺病毒可以是除人腺病毒外的各種來源之腺病毒。人腺病毒是指自然感染至人體的腺病毒，一般用HAd或Ad表示。
具體講，本發明範圍內可用的動物來源腺病毒可來自狗、牛、鼠(如Mav1，Beard等，Virology75(1990)81)、羊、豬、禽類或猴(例如SAV)。
更具體講，禽類腺病毒中可列舉出可在ATCC得到的血清型1—10，例如毒株Phelps(ATCC VR—432)、Fontes(ATCC VR—280)、P7—A(ATCC VR—827)、IBH—2A(ATCC VR—828)、J2—A(ATCC VR—829)、T8—A(ATCC VR—830)、K—11(ATCCVR—921)或編號為ATCC VR—831至835的毒株。在牛腺病毒中，可使用不同的已知血清型，特別是可在ATCC以編號ATCCVR—313、314、639—642、768和769得到的那些(1—8型)。還可舉出鼠腺病毒FL(ATCC VR—550)和E20308(ATCC VR—528)，5型(ATCC VR—1343)或6型(ATCC VR—1340)羊腺病毒；豬腺病毒(5359)，或猴腺病毒，特別是如ATCC編號為VR—591—594、941—943、195—203等的腺病毒。
在本發明範圍內優選使用來自狗的腺病毒，特別是所有CAV2腺病毒株〔例如Manhattan株或A26/61(ATCC VR—800)〕。狗腺病毒已作為許多結構研究的對象。例如，現有技術中已描述了腺病毒CAV1和CAV2的完全限制圖譜(Spibey等，J.GenVriol.70(1989)165)，已對E1a、E3基因以及ITR序列進行了克隆和測序(特別見Spibey等，Virus Res.14(1989)241；Linne，Virus Res.23(1992)119，WO 91/11525)。另外，狗腺病毒已被用於製備免疫狗抗狂犬病、細小病毒等的疫苗(WO 91/11525)。但迄今為止，這些現有技術中從未提出使用這些腺病毒進行人體中基因治療的可能性。而且從未測試過這種應用的益處。
本發明範圍內使用的腺病毒應優選缺陷型，即在被給予的生物體中不能自主增殖。如上文所述，申請人已證明這些源自動物的腺病毒能夠感染人細胞，但不能在其中增殖。在此意義上講，它們在人體中是天然缺陷的，並且與使用人腺病毒不同，不需要為此進行遺傳改造。雖然如此，這些腺病毒的缺陷特徵還可以通過基因組的遺傳改造而擴大，特別是所述病毒在細胞中複製所需序列的改造。這些區域或被消除(全部或部分)，或使得非功能化，或通過插入別的序列，特別是外源DNA序列來改造。
根據腺病毒的來源，複製所需序列可有些不同。然而它們一般位於靠近基因組末端的位置。例如對於CAV—2，已鑑定、克隆並測序了E1a區(Spibey等，Virus Res.14(1989)241)。它位於腺病毒基因組左端的2kb片段上。
另外，還可以在這些腺病毒上進行別的遺傳改造，特別是為了避免產生在人體中不利的病毒蛋白，為了能夠插入大片段外源DNA序列，和/或為了插入由另一動物或人腺病毒基因組決定的區域(例如E3基因)。
在本發明的意義上，「外源DNA序列」指引入病毒並希望其在人體中轉移和/或表達的所有DNA序列。
具體講，外源DNA序列可包括一種或多種治療基因和/或編碼治療多肽的一種或多種基因。
在一個具體實施方案中，本發明更具體涉及來自動物的腺病毒用於製備旨在轉移治療基因至人體的藥物組合物。可被如此轉移的治療基因是在靶細胞中轉錄及有時翻譯後產生具有治療效果的產物的所有基因。
這特別涉及具有治療效果的蛋白產物的編碼基因。這樣編碼的蛋白產物可為蛋白質、肽、胺基酸等。該蛋白產物可與靶細胞同源(即在不產生任何疾病的情況下在靶細胞中正常表達的產物)。在此情況下，某一蛋白的表達例如可以減緩由某一變化引起的在細胞中表達不足或表達的蛋白無活性或活性弱，也可以使所述蛋白過量表達。治療基因還可以編碼某一細胞蛋白的穩定性提高、活性改進等的突變體。這種蛋白產物也可以是對靶細胞異源的。此時，所表達的蛋白例如可補充或提供在細胞中不足的某一活性，以此來防治某種疾病。
本發明意義上的治療產物中，特別可列舉酶、血衍生物、激素、淋巴因子白細胞介素、幹擾素等(FR9203120)，生長因子、神經遞質或它們的前體或合成酶，營養因子BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5等；原脂蛋白ApoAI、ApoAIV、ApoE等(FR9305125)、營養不良蛋白或小營養不良蛋白(FR9111947)，腫瘤的基因抑制劑P53、Rb、Rap1A、DCC、k—rev等(FR9304745)，凝集相關因子VII、VIII、IX因子等的編碼基因。
治療基因還可以是反義基因或序列，其在靶細胞中的表達可以控制細胞基因表達或細胞mRNA的轉錄。例如按照專利EP140308中描述的技術，這樣的序列可在靶細胞中轉錄成細胞mRNA的互補RNA，並因此阻斷它們翻譯成蛋白質。
如上所述，外源DNA序列還可以包括一種或多種編碼能夠在人體中產生免疫反應的抗原性肽的基因。在此具體實施方案中，本發明可製成使人體對特別是微生物或病毒有免疫性的疫苗。這特別涉及對EB病毒、B型肝炎毒(EP185573)、偽狂犬病毒、或對腫瘤特異(EP259212)的特異性抗原性肽。
一般，外源DNA序列還包括使得治療基因和/或編碼抗原性肽的基因在所染細胞中表達的序列。這涉及那些在所染細胞中易於發揮作用的天然負責目標基因表達的序列。還涉及不同來源的序列(負責其它蛋白質的表達，或合成的等同物)。特別是涉及真核細胞或病毒基因的啟動序列，例如涉及來自欲感染細胞基因組的啟動序列。同樣涉及來自包括所用腺病毒在內的病毒基因組的啟動序列。關於這一點，例如可舉出E1A、MLP、CMV、RSV等基因的啟動子。另外，這些表達序列可通過加入活化序列、調節序列等來修飾。另外，當所插入基因不合表達序列時，可在缺陷性病毒基因組中在該序列的下遊插入這樣的序列。
另外，外源DNA序列，具體在治療基因的上遊還含有引導合成的治療產物至靶細胞的分泌道中的信號序列。這種信號序列可為治療產物的天然信號序列，但還涉及所有其它有功能的信號序列，或人工信號序列。
本發明的缺陷腺病毒可用本領域技術人員已知的所有技術來製備。特別是可按專利申請WO 91/11525中描述的方法來製備。經典的製備技術是基於動物腺病毒與帶有想插入的外源DNA序列等的質粒間的同源重組。在所述腺病毒和質粒共轉染到一種適當細胞系中後發生這種同源重組。所用細胞系應優選能被所述腺病毒和質粒轉化的，在使用源自動物的改造的腺病毒時，需要時該細胞系可含有能夠補充腺病毒基因組缺陷部分的序列，該序列優選是整合形式以避免重組的危險。對於細胞系，例如可舉出獵兔狗的腎細胞系GHK(Flow實驗室)或MDCK細胞系。在文獻也描述了細胞的培養條件及製備病毒或病毒DNA的條件(特別見Macatney等，Science 44(1988)9；Fowlkes等，J.Mol.Biol.132(1979)163)。
然後回收增殖後的載體並按標準分子生物學技術純化。
本發明的另一目的在於含有外源DNA序列的源自動物的重組腺病毒，其中外源DNA序列包括至少一種如上所定義的治療基因。
本發明還涉及含有一種如前所述的源自動物的重組腺病毒的所有藥物組合物。可配製本發明的藥物組合物，以通過局部、口服、非胃腸道、鼻內、靜脈內、肌內、皮下、眼內、經皮等途徑給藥。
優選地，在本發明藥物組合物中含有針劑配方的藥用載體。特別是消毒、等滲的鹽水溶液(磷酸一鈉、磷酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等，或這些鹽的混合物)，或幹組合物，特別是凍幹品，它通過加入無菌水或生理血清能形成注射溶液。
注射所用病毒的劑量可與不同參數相適應，特別是所用給藥方法、有關的疾病、要表達的基因、還有要求的治療時間。一般地，本發明的重組腺病毒被配製成劑量為104—1014pfu/ml，優選106—1010pfu/ml，並以此形式給藥。pfu(空斑形成單位)相當於病毒溶液的感染能力，通過感染適當的細胞培養物，一般5天後測量被感染細胞的空斑數目。病毒溶液滴度pfu的測定技術在文獻中有充分的說明。
根據所插入的外源DNA序列，本發明的腺病毒可用於治療或預防許多疾病，包括遺傳病(營養障礙、囊性纖維變性等)、神經退化性(neurogegenerative)疾病(早老性痴呆、帕金森氏病、ALS等)、癌症、凝集失調或脂蛋白障礙引起的疾病、由病毒感染引起的疾病(肝炎、AIDS等)等。
藉助以下實施例將更完全地描述本發明，這些實施例是示範性的而不是限制性的。
圖1腺病毒CAV2 Manhattan株的限制性酶切圖譜(根據前述Spibey等的文章)。
圖2質粒p1，p2(圖2a)和p3(圖2b)的描繪。
圖3含有外源DNA序列的重組狗腺病毒的構建策略。
分子生物學的一般技術用於分子生物學中的常規方法如質粒DNA的製備性提取、質粒DNA的氯化銫梯度離心、瓊脂糖或丙烯醯胺凝膠電泳、電洗脫純化DNA片段、苯酚或苯酚—氯仿提取蛋白質、在含鹽介質中用乙醇或異丙醇沉澱DNA、在大腸桿菌中的轉化等都是本領域技術人員所熟知的，並在文獻中有充分的描述〔Maniatis T.等，「Molecular Cloning，a Laboratory Manual」，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1982；AusubelF.M.等(eds)，「Current Protocols in Molecular Biology」，JohnWileySons，New York，1987〕。
pBR322，p UC型質粒和M13系噬菌體是從市場上購得的(Bethesda Research Laborataries)。
關於連結，先將DNA片段用瓊脂糖或丙烯醯胺電泳按其大小分離，用苯酚或苯酚/氯仿混合物提取，用乙醇沉澱，然後按照供應商的推薦方法在噬菌體T4的DNA連結酶(Biolabs)存在下孵育。
按照供應商的說明，用大腸桿菌的DNA聚合酶I的Klenow片段(Biolabs)對凸起的5』末端補平。按照製造商的推薦方法，在噬菌體T4的DNA聚合酶(Biolabs)存在下對凸起的3』末端進行破壞。凸起的5』末端經核酸酶S1仔細處理進行破壞。
利用合成的寡聚脫氧核苷酸的體外定向突變是用Amersham提供的試劑盒按Taylor等開發的方法〔Nucleic Acids Res.13(1985)8749—8764〕來進行的。
和所謂的PCR技術對DNA片段的酶法擴增〔PolymeraseCatalyzed Chain Reaction，Saiki R.K.等，Science 230(1985)1350—1354；Mullis K.B和Faloona F.A，Meth.Enzym.155(1987)335—350〕可用「DNA thermal cycler」(Perkin ElmerCetus)按製造商的說明進行。
用Amersham銷售的檢測盒根據Sanger等研製的方法驗證核苷酸序列。實施例E1.用來自狗的腺病毒感染人細胞該實施例證明來自動物(狗)的腺病毒感染人細胞的能力。
E1.1所用的細胞系在該實施例中，使用了下列細胞系—人胚胎腎細胞系293(Graham等，J.Gen.Virol.36(1977)59)。該細胞系特別含有整合在其基因組中的人腺病毒Ad5基因組的左側部分(12％)。
—人KB細胞系來自人表皮癌，該細胞系及其培養條件可在ATCC得到(CCL17)。
—人Hela細胞系來自人上皮癌，該細胞系以及其培養條件可在ATCC得到(CCL2)。
—狗MDCK細胞系MDCK細胞的培養條件特別由Macatney等作了描述，Science 44(1988)9。
E1.2.感染用CAV2病毒(Manhattan株)感染了以上提到的細胞系的細胞。為此，約107/發酵單位(boite)細胞在10pfu/細胞的病毒存在下37℃孵育1小時。然後加入5ml培養基，在37℃繼續培養約48小時。此時，分析了被感染的細胞中附加體形式的DNA所得結果顯示所有這些細胞系在其細胞核中都存在CAV2的DNA，這證明了它們被狗腺病的可感染性。
E2.狗腺病毒在人細胞中無法增殖該實施例證明狗腺病毒儘管能夠感染人細胞，但不能在此細胞中增殖。
按照實施例1感染細胞後，按下述實驗方法測定了隨著時間的延長CAV2 DNA的量按Hirt等描述的技術(J.Virol.45(1983)91)回收細胞中附加體形式的DNA，通過與一系列標準品比較測定DNA的量。所得結果顯示病毒DNA的量在KB和293細胞中不增加，證明CAV2在這些細胞中完全不複製。在MDCK和Hela細胞中，觀察到CAV2病毒DNA的量有輕微增加。但病毒顆粒形成的測定中顯示CAV2在293、KB和Hela人細胞中都不發生增殖，而僅發生在MDCK細胞系中。通過收集感染細胞、凝固融化釋放可能存在的病毒、按以上描述的條件用所得上清液感染MDCK細胞，來測定病毒的增殖。培養48小時後，這樣感染後的MDCK細胞中不存在病毒DNA，說明在人細胞中不發生任何病毒增殖。
這些結果清楚地表明狗腺病毒在人細胞中不能增殖。
E3.證明狗腺病毒不會被人腺病毒反式互補本實施例表明狗腺病毒不在人細胞中增殖，不被人腺病毒的存在反式互補。
用腺病毒CAV2和人腺病毒Ad5共感染人細胞系293、KB和Hela以及狗細胞系MDCK。按實施例E1中的方法證實細胞中(狗或人)病毒DNA的存在，並如同測定增殖那樣測定了隨著時間的延長DNA的量。所得結果表明CAV2的DNA量在KB和293細胞中不隨著時間延長而增加，這說明人腺病毒Ad5的存在並不會通過反式互補而誘導CAV2在這些細胞中複製。用來自KB、293和Hela細胞的可能病毒感染的MDCK細胞中不存在病毒DNA，同樣說明即使在人腺病毒存在下，腺病毒CAV2在人細胞系中也不增殖。
E4.CAV2的基因組DNA文庫的構建從腺病毒CAV2的基因組限制性片段構建了一個質粒文庫。用SmaI和PstI酶消化CAV2並將SmaIA，B，C，D，E，F，I和J片段及PstIA，B，C，D，E，F，G，H片段(圖1)克隆在載體pGem3Zf+(Promega)中得到該文庫。帶有SmaI C片段的此質粒與帶有新黴素抗性基因的質粒pUC4KIXX(Pharmacia)共轉染到MDCK細胞中，以建立組成性地表達CAV2的E1A和E1B基因的MDCK細胞系。該細胞系使得可以構建這些區域缺失的重組病毒(參見E5.2)。
E5.構建帶有Ad2 MLP啟動子控制下的白介素—2基因的重組狗腺病毒設計了兩種策略來構建帶有人Ad2 MLP啟動子控制下的白介素—2基因的重組狗腺病毒。
E5.1第一種策略是在E4區和整個CAV2基因組右側的ITR之間、在SmaI限制位點插入目標外源DNA序列(MLP啟動子—白介素—2基因)。這種重組體的構建或用連接方法進行，或通過帶有目標外源DNA序列的質粒和CAV2基因組之間體內重組來進行。用於獲得帶有MLP啟動子控制下的白介素—2基因的重組腺病毒的質粒按以下方法構建(圖2)—通過將特別帶有右側ITR、一個SmaI位點和E4基因的CAV SalIB片段(圖1)克隆到質粒pGem 3Zf+(Promega)中，獲得第一個稱為p1的質粒，在p1上有一個單一的SmaI位點；—將外源DNA序列(MLP啟動子—白介素—2基因)從p1質粒的SmaI位點引入p1中，從而產生質粒p2；及—然後將基因組文庫的PstID片段中含有的帶有部分E3基因的PstI—SalI片段克隆到p2中的相應位點，產生質粒p3(圖2)。
這樣得到的質粒用於按如下兩種方法(見圖3)製備重組腺病毒a)用SalI消化的質粒p2與CAV2的SalIA片段體外連接，連接產物轉染到MDCK細胞中(圖3a)，b)共轉染到MDCK細胞中後，p3質粒與CAV2的SalI片段之間重組。然後按本領域技術人員已知的技術分離並擴增所得重組腺病毒。
這些操作能夠構建帶有白介素—2的重組狗腺病毒，該腺病毒可用於將此治療基因轉移到人體中(圖3)。
E5.2設計的第二種策略是基於組成性表達CAV2 E1A和E1B基因的MDCK細胞系(參見實例E4)的使用。此細胞系使得能實現缺失這些區域的狗腺病毒的反式互補，以及構建其中用外源DNA取代E1區的重組病毒。為此，構建了含有CAV2基因組左末端(ITR序列和包衣序列)和外源DNA序列的質粒。在缺失其自身左末端的CAV2腺病毒基因組的存在下，將此質粒共轉染到如上所述的MDCK細胞中。為了將其用於人體，將產生的重組狗腺病毒回收、需要時擴增並保存。
權利要求
1.含有外源DNA序列、源自動物的重組腺病毒在製備用於治療和/或外科處理人體的藥物組合物中的用途。
2.權利要求1的用途，用於製備轉移治療基因至人體中的藥物組合物。
3.權利要求1的用途，用於製備疫苗。
4.權利要求2的用途，其特徵在於治療基因是編碼治療蛋白產物的基因。
5.權利要求2的用途，其特徵在於治療基因是反義基因或序列。
6.權利要求1—5之一的用途，其特徵在於腺病毒選自狗、牛、鼠、羊、豬、禽類和猴的腺病毒。
7.權利要求6的用途，其特徵在於腺病毒為狗腺病毒，優選選自CAV—2腺病毒株。
8.權利要求1—7之一的用途，其特徵在於腺病毒基因組沒有複製所需序列。
9.權利要求8的用途，其特徵在於腺病毒基因組沒有E1A和E1B區。
10.含有至少一種插入的治療基因的動物來源重組腺病毒。
11.權利要求10的腺病毒，其特徵在於治療基因如權利要求4和5中所定義。
12.權利要求10的腺病毒，其特徵在於它還含有使得插入的治療基因表達的啟動序列。
13.權利要求10—12之一的腺病毒，其特徵在於它還含有誘導治療基因表達產物分泌的信號序列。
14.權利要求10—13之一的腺病毒，其特徵在於腺病毒選自狗、牛、鼠、羊、豬、禽類和猴的腺病毒。
15.權利要求14的腺病毒，其特徵在於腺病毒為狗腺病毒，優選選自腺病毒CAV—2株。
16.權利要求10—15之一的腺病毒，其特徵在於其基因組至少缺少複製所需序列。
17.權利要求16的腺病毒，其特徵在於它含有另一動物腺病毒或人腺病毒的區域。
18.含有一種或多種按照權利要求10—17之一的腺病毒的藥物組合物。
全文摘要
本發明在於含有外源DNA序列的動物來源重組腺病毒在製備用於治療和/或外科處理人體的藥物組合物中的用途。
文檔編號A61K35/76GK1124040SQ94192150
公開日1996年6月5日 申請日期1994年5月6日 優先權日1993年5月18日
發明者H·哈達德, B·科隆歐思基, M·伯裡考迪特, E·威格尼 申請人:羅納-布朗克羅萊爾股份有限公司