一種異黃酮苷類化合物及其製備方法

2023-09-13 03:57:15 3

專利名稱：一種異黃酮苷類化合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及的化合物，其來自於東方擬無枝酸菌ATCC 43491的發酵液，為發酵液 中一種含量較低的組分，通過分離純化，經質譜(MS)、核磁共振氫譜(1H NMR)、核磁共振碳 譜(13C NMR)檢測，進行結構分析，確定該組分為一種新的化合物。


因此，本發明的首要目的在於，提供一種新的化合物t 本發明提供的化合物，如結構式(I)所示
本發明的另一個目的在於，提供如結構式(I)所示的化合物的製備方法。 本發明提供的化合物通過發酵培養東方擬無枝酸菌獲得。 根據本發明，使用的東方擬無枝酸菌為東方擬無枝酸菌ATCC 43491。 根據本發明，該化合物的製備方法還包括以下步驟
A)東方擬無枝酸菌發酵液離心，收集離心上清；
B)對步驟A獲得的離心上清，使用HPD100樹脂進行初純，收集洗脫液；
C)對步驟B中獲得的洗脫液使用中壓液相色譜精純，收集洗脫液。
3
根據本發明，HPD100樹脂初純包括以下步驟將離心上清液上樣到HPD100樹脂柱 上，用乙醇-水溶液梯度洗脫，收集乙醇體積百分比在25%到35%區段的洗脫液。根據本發明，中壓液相色譜精純包括以下步驟將步驟B中獲得的洗脫液上樣到 反相C-18柱；使用體積比為35 65的甲醇-水溶液1洗滌；使用體積比為44 56的甲 醇_水溶液2洗脫，收集洗脫液，獲得本發明提供的化合物溶液，其中，在上樣至C-18柱步 驟前，對步驟B中獲得的洗脫液進行濃縮，甲醇-水溶液2的pH為3. 8。本發明提供了結構式(I)所示的新的化合物，該化合物對白色念珠菌具有很好的 抑制作用，可用於開發抗菌藥物。


圖1是東方擬無枝酸菌發酵離心上清的HPLC檢測圖譜，其中，峰1為化合物 LYV091x01 的峰。圖2是中壓液相色譜精純後獲得的洗脫後溶液的HPLC檢測圖譜。圖3是化合物LYV091x01的質譜檢測結果。圖4是化合物LYV091x01的核磁共振氫譜的檢測結果。圖5是化合物LYV091x01的核磁共振碳譜的檢測結果。圖6是化合物LYV091x01的結構式。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用於說明本 發明而非用於限定本發明的範圍。在本發明的下述實施例中，使用的培養基組成如下斜面培養基高氏1號瓊脂培養基。種子培養基可溶性澱粉40g/L，去脂黃豆粉20g/L，甘油20g/L，葡萄糖15g/L， KN036g/L, KH2PO4O. 2g/L, MgCl2 · 6H20 0. 4g/L。發酵培養基乳糖20g/L，黃豆粉15g/L，氯化鈉3g/L，硫酸鎂lg/L，磷酸氫二鉀 lg/L。在本發明的下述實施例中，HPD100樹脂初純條件如下取發酵液離心上清液上HPD100樹脂柱，以乙醇-水溶液進行梯度洗脫，收集乙醇 體積百分比在25% -35%區段的洗脫液，濃縮得LYV091x01粗品溶液。中壓液相色譜純化條件如下色譜柱為反相C-18柱。樣品上柱後先用甲醇水=35 65 (體積比)溶液洗滌 除雜，然後用甲醇水(體積比)=44 56的溶液(磷酸調pH至3.8)洗脫，收集洗脫液， 以HPLC檢測洗脫液中產物。HPLC條件如下流動相配製用0. 2%的三乙胺溶液，磷酸調pH至3. 2作為緩衝液。緩衝液與乙 睛和四氫呋喃按92 7 1的比例混合，搖勻，作為A液；緩衝溶液與乙睛和四氫呋喃按 70 29 1的比例混合，搖勻，作為B液。超聲波脫氣20min，備用。色譜柱=Diamonsi1 C18，0DS，ID 4. 6*200mm
4 實施例1、東方擬無枝酸菌ATCC 43491發酵取東方擬無枝酸菌ATCC 43491斜面培養物，接種到種子培養基中培養，於28°C、 220r/min轉速的搖床上培養40小時，獲得種子培養液。將種子培養液接種到發酵培養基中，於28°C、220r/min轉速的搖床上培養120小 時，獲得發酵液。用4mol/L鹽酸酸化發酵液，調pH至3_4，離心收集上清液。實施例2、發酵液純化將實施例1中獲得的離心上清液進行HPLC檢測，結果如圖1所示，然後將離心上 清液分別經HPD100樹脂初純和中壓液相色譜精純，獲得純度達到98%的化合物，具體過程 如下A) HPD100 樹脂初純將離心上清液上樣到HPD100樹脂柱上，用乙醇-水溶液梯度洗脫，收集乙醇體積 百分比在25%到35%區段的洗脫液，然後將洗脫液濃縮，獲得粗品濃縮液。B)採用中壓液相色譜技術對步驟A中獲得的濃縮液進行精純，具體過程如下將上述粗品濃縮液上樣到在反相C-18柱上，先使用甲醇水=35 65(體積比) 溶液洗脫除雜，然後使用甲醇水=44 56(體積比)溶液(磷酸調？!1至3.8)洗脫，收 集洗脫液，以HPLC檢測洗脫液中產物，結果如圖2所示。根據圖2的結果，洗脫後溶液的純 度達到98%。將獲得的洗脫後溶液乾燥，獲得白色粉末，得LYV091x01精製品。實施例3、LYV091x01 鑑定LYV091x01的理化性質如下化合物LYV091x01為白色粉末，略帶微黃色，易溶於水，可溶於甲醇，不溶於丙酮、 丁醇、乙酸乙酯；以質譜(MS)、核磁共振氫譜(1H NMR)、核磁共振碳譜(13C NMR)對化合物 LYV091x01進行測定，結果如下化合物LYV091x01的質譜檢測結果如圖3所示，根據圖3的結果，[M+H]+ = 563，
5[2M+H]+ = 1125，推斷出化合物LYV091x01的分子量為562。化合物LYV091x01的核磁共振碳譜如圖4所示，其核磁共振氫譜的檢測結果如圖 5所示，對核磁共振碳譜和核磁共振氫譜的解譜結果如表2所示，其中，標識為a的數據於 500MHz檢測，標識為b的數據於400MHz檢測。表2、LYV091x01核磁共振的碳譜和氫譜測定結果 根據上述結果，本發明獲得的化合物LYV091x01的分子式為C27H3tlO13的結構式如 圖6所示，該結構在現有技術中未見有報導，是一種新的化合物，由於其結構式與已知的異 黃酮苷化合物類似，因此可以歸類為一種新的異黃酮苷化合物。實施例4、抑菌活性測定取直徑為90mm、高16_17mm的平皿，注入加熱融化的YPD培養基，待凝固後作為底 層培養基。取白色念珠菌ATCC10231菌種新鮮斜面，製成菌懸液，加到40°C左右的YPD培養 基中，傾倒在鋪有底層培養基的平板上，冷卻凝固。在制好的檢測培養平板上，放置加有LYV091x01濃度為10 μ g/ml的待測樣品液 20 μ 1的紙敏片(直徑6mm)，將平板於28°C培養2天，測得抑菌圈直徑為19mm。由此顯示化合物LYV091x01對白色念珠菌有顯著的抑制作用。綜上所述，本發明提供了一種新的化合物，該化合物對白色念珠菌具有很好的抑 製作用，可用於製備抑菌藥物，特別是用於抑制白色念珠菌的藥物。
權利要求
一種化合物，其特徵在於，所述化合物的結構式如式(I)所示F2009100528505C0000011.tif
2.根據權利要求1所述化合物的製備方法，其特徵在於，所述化合物通過發酵培養東 方擬無枝酸菌獲得。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，所述東方擬無枝酸菌為東方擬無枝 酸菌 ATCC 43491。
4.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於，所述方法還包括以下步驟A)東方擬無枝酸菌發酵液離心，收集離心上清；B)對步驟A獲得的離心上清，使用HPDlOO樹脂進行初純，收集洗脫液；C)對步驟B中獲得的洗脫液使用中壓液相色譜精純，收集洗脫液。
5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述HPDlOO樹脂初純包括以下步驟 將離心上清液上樣到HPDlOO樹脂柱上，用乙醇-水溶液梯度洗脫，收集乙醇體積百分比在 25%到35%區段的洗脫液。
6.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述中壓液相色譜精純包括以下步 驟將步驟B中獲得的洗脫液上樣到反相C-18柱；使用體積比為35 65的甲醇-水溶液 1洗滌；使用體積比為44 56的甲醇-水溶液2洗脫，收集洗脫液，獲得所述化合物溶液。
7.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，在上樣至所述C-18柱步驟前，對步驟 B中獲得的所述洗脫液進行濃縮。
8.根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述甲醇-水溶液2的pH為3.8。
全文摘要
本發明提供了一種異黃酮苷類化合物以及該化合物的製備方法。本發明提供的化合物，其結構如結構式(I)所示，該化合物通過發酵培養東方擬無枝酸菌獲得。本發明提供的化合物對白色念珠菌具有很好的抑制作用。
文檔編號C07H17/07GK101921300SQ200910052850
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月10日 優先權日2009年6月10日
發明者劉效穩, 夏興, 戈梅, 李秋爽, 楊天, 楊志鈞, 殷瑜, 羅敏玉, 金文翔, 阮麗軍, 陳代傑, 魏維 申請人:上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司;浙江醫藥股份有限公司新昌製藥廠