構建阻塞性睡眠呼吸暫停症候群動物模型的方法

2023-09-13 03:54:10

構建阻塞性睡眠呼吸暫停症候群動物模型的方法【專利摘要】本發明公開了一種構建阻塞性睡眠呼吸暫停症候群動物模型的方法，將麻醉大鼠，通過插入島葉皮層與微量注射裝置直接相連的玻璃微電極，將藥物向核團內注射到腦內島葉皮層中。通過本發明的方法，刺激島葉皮層可以產生類似於阻塞性睡眠呼吸暫停症候群的呼吸困難症狀，可以成功構建阻塞性睡眠呼吸暫停症候群動物模型。【專利說明】構建阻塞性睡眠呼吸暫停症候群動物模型的方法【
技術領域：
】[0001]本發明屬於生物和藥物學【
技術領域：
】，具體而言，涉及一種構建阻塞性睡眠呼吸暫停症候群動物模型的方法。【
背景技術：
】[0002]阻塞性睡眠呼吸暫停症候群(obstructivesleepapneasyndromeOSA)近年來越來越受到人們的關注，目前OSA已成為高血壓、冠心病、心肌梗死及腦中風等發病的主要危險因素[1_6]，近幾年對其機制的研究已引起許多學者的關注。研究表明:0SA的發生受多種因素的影響，但根本原因是由於上呼吸道解剖和功能的改變，GG(GenioglossusGG)活動性喪失是引起OSA患者氣道閉塞的主要因素[7]。島葉皮質(InsulaCortexIC)是大腦顳葉皮層的一個區域，與大腦內的其他結構有著廣泛的神經聯繫。Ic、杏仁核、海馬回有呼吸單位參與醒覺的呼吸調節。來自呼吸道和肺內感受器的迷走神經刺激投射至Ijlc，Ic在健康人呼吸困難傳入過程發揮重要作用M。已有研究證實OSA患者血漿5-HT(5-hydroxytryptamine,5-HT)水平明顯異於正常人水平[9,]。而刺激Ic致使中縫核5-HT的釋放減少，可能參與睡眠呼吸調節[11]。[0003]OSA是具有潛在生命威脅的疾病，所引起的慢性呼吸衰竭是影響患者生活質量的最嚴重的症候群。OSA患者的夜間最低血氧飽和度常低於80%。長期低氧血症導致交感神經興奮，機體內環境紊亂，多臟器功能損害，患者後期常並發高血壓、腦出血、腦梗塞、心肌梗塞、肺源性心臟病、糖尿病、高血脂、心律失常是OSA常見的併發症，特別是夜間緩慢性心律失常，是夜間猝死的主要原因。現認為OSA是獨立於年齡、體重、飲食、遺傳等原因的高血壓發生、發展的重要危險因素。目前，睡眠呼吸暫停低通氣症候群與高血壓、中風、心梗及充血性心衰等疾患仍是世界性廣泛關注的問題，已成為醫學界、生物學界亟待解決的問題。[0004]由於阻塞性睡眠呼吸暫停症候群的發病機制不清，因而目前對該病的治療效果不理想，因此，如何構建阻塞性睡眠呼吸暫停症候群動物模型，為研究該病的發病機制以及研究該病的治療效果是本領域技術人員亟待解決的技術問題。【
發明內容】[0005]本發明的目的是提供一種構建阻塞性睡眠呼吸暫停症候群動物模型的方法，為了實現本發明的目的，擬採用如下技術方案:[0006]本發明一方面涉及構建阻塞性睡眠呼吸暫停症候群動物模型的方法，其特徵在於通過插入將麻醉動物島葉皮層與微量注射裝置直接相連的玻璃微電極，將藥物向核團內注射到腦內島葉皮層中。[0007]在本發明的一個優選實施方式中，所述的藥物中含有L-穀氨酸。[0008]在本發明的另一個優選實施方式中，所述的藥物為人工腦脊液配製的L-穀氨酸，優選的，所述的L-穀氨酸的濃度為5-20mmol/L。[0009]本發明另一方面還涉及L-穀氨酸在配製刺激腦內島葉皮層的藥物中的應用。[0010]在本發明的一個優選實施方式中，所述的應用是用於構建阻塞性睡眠呼吸暫停症候群動物模型。[0011]通過本發明的方法，L-穀氨酸刺激島葉皮層可以產生類似於阻塞性睡眠呼吸暫停症候群的呼吸困難症狀，可以成功構建阻塞性睡眠呼吸暫停症候群動物模型。此外，島葉皮層可能是OSA的皮層中樞，在島葉皮層及其傳導通路上的某個部位採取措施，可以幹預OSA的發生和發展，使之成為治療OSA的方法。【具體實施方式】[0012]實施例1[0013]材料:本實驗所用的試劑包括:L-穀氨酸(購自北京鼎國生物製品研究中心)，7.5%EDTA鈉和滂胺天藍(美國，Sigma公司)，鹽酸利多卡因(無錫市第七製藥有限公司)，生物素標記的羊抗鼠/兔IgG(二抗)和鏈黴菌抗生物素蛋白-過氧化酶(三抗)，(中國，福州邁新生物技術開發有限公司)，SerotoninRIA試劑盒(德國，LaborDiagnostikaNordGmbH&C0.KG);使用的儀器有:VDT_1型腦立體定向儀(日本，TAKAHASHICompany),BL-420E+生物技能實驗系統(中國，四川成都泰盟科技優先公司)，HTEC-500螢光光度儀(Japan,EIcomCorporation)等。[0014]分組:健康Wistar成年大鼠60隻，隨機分為3組:藥物刺激島葉組20隻(人工腦脊液配製lOmmol/LL-穀氨酸，pH7.4，0.3ul2_3min微量注射)，對照組20隻(L-Glu刺激島葉周圍組10隻，人工腦脊液刺激島葉組10隻)，假手術組20隻(僅行同前麻醉、頭部固定、島葉部位埋置套管)。[0015]麻醉:實驗用各組動物用20%urethane,6ml/kg,腹腔注射麻醉,使動物在整個實驗過程中處於淺麻狀態(有較靈敏的角膜反射，夾後肢可引起屈腿反射，但動物沒有任何自發活動)。實驗過程中，根據需要補充麻醉劑，一般為初劑量的1/5。以熱墊使肛溫保持在36°C。實驗在環境安靜、光線柔和的條件下進行。[0016]刺激島葉皮層:用耳棒將各刺激組動物固定在腦立體定位儀上，切開頭皮暴露顳骨。島葉皮層坐標為AP:+1.0，L:5.4-5.5，H:4.2~4.4。在大鼠呼吸平穩狀況下，通過插入島葉皮層與微量注射裝置直接相連的玻璃微電極，將藥物向核團內注射，為了避免因注射過快而發生短時間內顱內壓突然升高而影響神經元功能，注射時間至少持續3min，並密切觀察注藥前後大鼠的呼吸變化。[0017]以手術埋置同心圓電極，刺激組通過埋置在相應核團的微電極注射。呼吸運動和頦舌肌肌電用BL-420E2多導記錄儀記錄。動物出現呼吸暫停後，由內眥靜脈抽血，應用HTEC-500螢光光度儀(EIcomCorporation,Japan)檢測血漿五羥色胺含量。處死動物後，取橋腦下段和延髓上端之間腦幹組織行矢狀位切片，並取頦舌肌組織。然後行腦幹和頦舌肌HE染色及五羥色胺的免疫組化染色。[0018]主要觀察指標:觀察刺激島葉皮層後大鼠呼吸運動曲線和頦舌肌肌電變化、五羥色胺在大鼠腦幹神經細胞和頦舌肌細胞胞漿的表達及血漿五羥色胺含量的變化。[0019]結果:L_穀氨酸刺激島葉皮層後，動物出現呼吸暫停，頦舌肌肌電振幅由刺激前(100±59.47)μV,降低到刺激後(13.41±1.58)μV(P<0.01);肌電積分減少(93.51±0.99)%(與對照組(使用人工腦脊液注入島葉)比較)(P<0.01);腦幹神經細胞和顏舌肌細胞胞漿內五羥色胺棕黃色顆粒顏色變淡，數量減少，圖像灰度值明顯降低(1698936±725837)與對照組(3203352±194972)比較差異顯著(t=3.073.P<0.05)。顏舌肌細胞胞漿內的棕黃色顆粒顏色變淡，數量減少，圖像灰度值明顯降低(1698936±725837)與對照組(3203352±194972)比較差異顯著(t=3.073.p<0.05)；外周血五羥色胺濃度顯著低於對照組(P<0.05)。[0020]結論:穀氨酸剌激島葉皮層可以產生類似於阻塞性睡眠呼吸暫停症候群的呼吸困難症狀；阻塞性睡眠呼吸暫停症候群主要症狀一呼吸困難的腦內最高級代表區在島葉皮層。[0021]參考文獻[0022]1.SaboiskyJPjChamberIinNL，MalhotraA.potentialtherapeutictargetsinobstructivesleepapnoea.SaboiskyJPjetal.ShExpertOpinTherTargets.2009Jul；13(7):795-809.[0023]2.SaboiskyJPjStashukDWjHamiIton-WrightAjCarusonaAL,CampanaLMjTrinderJjEckertDJjJordanAS,McSharryDGjWhiteDPjNandedkarSjDavidWSjMalhotraA.Neurogenicchangesintheupperairwayofpatientswithobstructivesleepapnea.SaboiskyJPjetal.ShowAmJRespirCritCareMed.2012Febl；185(3):322-9.Epub20110ct20[0024]3.MckayLCjEvansKCjFrackowiakRSjCorfieldDR.Neuralcorrelatesofvoluntarybreathinginhumans.JApplPhysiol.2003；95:1170-8.[0025]4.HendersonLA,WooMA，MaceyPM，MaceyKEjFrysingerRCjAlgerJRjYan-GoFjHarperRM.NeuralresponsesduringValsalvamaneuversinobstructivesleepapneasyndrome.JApplPhysio12003:94(3):1063-1074.[0026]5.CuiLjWangJHjWangM，HuangMjWangCY，XiaH，XuJGjLiMX,WangS.1njectionofL—glutamateintotheinsularcortexproducessleepapneaandserotoninreductioninrats.SleepBreath2011.2011；Sep27..[0027]6.KouZYjLiMSjZhangCXjWangS.[Habenulaparticipatesthevasopressorresponsebystimulationoftheinsularcortex,central—，lateralamygdaloidnucleusrespectively].ZhongguoYingYongShengLiXueZaZh1.2003Nov；19(4):334-6.[0028]7.LiMjWangJ，HuangM，LinWjWangM，YuLjWangS.Blockageofthehabenularnucleuscaneliminatedyspneainducedbyelectrostimulationoftheinsularcortex.NeuralRegenerationResearch2010:5(13):1025-1029。[0029]8.TheMinistryofScienceandTechnologyofthePeople’sRepublicofChina(2006).GuidanceSuggestionsfortheCareandUseofLaboratoryAnimals.2006-09-30.[0030]9.FieldsHLjBryJ，HentallI,ZormanG(1983).Theactivityofneuronsintherostralmedullaoftheratduringwithdrawalfromnoxiousheat.JNeurosc1.1983；3(12):2545-2552.[0031]10.WangS，FuQ，FuJ.Modulationofpreopticareaondischargesofparafascicularpainneurons.KexueTongba0.1983；28(3):401-405.[0032]11.CaoY，FujitoYjMatsuyamaK，AokiM(2006).Effectsofelectricalstimulationofthemedullaryraphenucleionrespiratorymovementinrats.JCompPhysiolANeuroetholSensNeuralBehavPhysiol.2006;192(5):497-505.[0033]12.CarleyDWjTrbovicSjRadulovackiM.SleepapneainnormalandREMsleep-deprivednormotensiveWistar-Kyotoandspontaneouslyhypertensive(SHR)rats.[J]PhysiolBehavj1996，59:827-831.[0034]13.LingL.SerotoninandNMDAreceptorsinrespiratorylong-termfacilitation.RespirPhysiolNeurobiol.2008Decl0;164(1-2):233-41.[0035]14.GraceKP，LiuH，HornerRL.5-HTlAreceptor-responsivepedunculopontinetegmentalneuronssuppressREMsleepandrespiratorymotoractivity.JNeurosc1.2012Febl；32(5):1622-33.[0036]15.SheltonL，BecerraL，BorsookD.Unmaskingthemysteriesofthehabenulainpainandanalgesia.ProgNeurobiol.2012Feb；96(2):208-19.[0037]16.WangS.Habenula—anewtargetfortreatmentofintractabledepression.ShengLiKeXueJinZhan.2011Dec；42(6):407-12.[0038]17.PobbeRLjZangrossiHJr.Thelateralhabenularegulatesdefensivebehaviorsthroughchangesin5-HT—mediatedneurotransmissioninthedorsalperiaqueductalgraymatter.NeurosciLett.2010Jul26；479(2):87-91.[0039]18.C.PeyronjJ.-M.Petit,C.RamponjM.JouvetandP._H.LuppijForebrainafferentstotheratdorsalraphenucleusdemonstratedbyretrogradeandanterogradetracingmethods,Neuroscience.1998；82:443-468.[0040]19.PollerWC，BernardR，DerstC，etal.Lateralhabenularneuronsprojectingtoreward-processingmonoaminergicnucleiexpresshyperpolarization-activatedcyclicnucIeotid-gatedcationchannels.Neuroscience.20110ctl3;193:205_16.[0041]20.RogerLuisHenschelPobbejHelioZangrossiJr.Thelateralhabenularegulatesdefensivebehaviorsthroughchangesin5-HT_mediatedneurotransmissioninthedorsalperiaqueductalgraymatter.NeuroscienceLetters,2010；479(2):87-91.[0042]21.HerkenhamM，NautaW.Efferentconnectionsofthehabenularnucleiintherat.JCompNeurol，1979;187(I):19-47.[0043]22.EckenrodeTjBarrG，BattistiWjMurrayM.Acetylcholineintheinterpeduncularnucleusoftherat:normaldistributionandeffectsofdeafferentation.BrainRes,1987；418(2):273-286.[0044]23.FasoloA,VirgiliMjPanzicaG，ContestabileA.1mmunohistochemistryandneurochemistryofthehabenulo—interpeduncularconnectionafterpartialdevelopmentaldepletionofhabenularcholinergicneuronsintherat.ExpBrainResBull,1992；90(2):297-301.[0045]24.BernardRjVehRW.1ndividualneuronsintheratlateralhabenularcomplexprojectmostlytothedopaminergicventraltegmentalareaortotheserotonergicraphenucle1.JCompNeurol.2012Augl;520(II):2545-58.[0046]25.HerbstreitF，ZigrahnD，OchterbeckC，etal.Neostigmine/glycopyrrolateadministeredafterrecoveryfromneuromuscularblockincreasesupperairwaycollapsibilitybydecreasinggenioglossusmuscleactivityinresponsetonegativepharyngealpressure.Anesthesiology.2010Dec；113(6):1280-8.[0047]26.KubinjRODavies,AlPack:ControlofupperairwaymotoneuronsduringREMsleep.NewsPhysiolSc1.1998；13:91-7.[0048]27.AJelevjSSoodjHLiujetal.Microdialysisperfusionof5_HTintothehypoglossalmotornucleusdifferentiallymodulatesgenioglossusactivityacrossnaturalsleep-wakestatesinrats.JPhysiol(Lond).2001;532:467-481.[0049]28.VeaseySC.Serotonin.CulpritorPromisingTherapyforObstructiveSleepApnea?AmJRespirCritCareMed，2001，163(5):1045-1047.[0050]29.PengLjWangJ，ZhangLjLiuPjWangM，HuangM，LiuS，HeP，CuiLjLiMjWangS.Roleof5-hydroxytryptamineexpressionincerebellarPurkinjecellsinobstructivesleepapneasyndrome.NeuralRegenerationResearch2012；7(8):606-610.[0051]以上所述，僅為本發明的【具體實施方式】，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何不經過創造性勞動想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。因此，本發明的保護範圍應該以權利要求書所限定的保護範圍為準。【權利要求】1.構建阻塞性睡眠呼吸暫停症候群動物模型的方法，其特徵在於通過插入麻醉大鼠島葉皮層與微量注射裝置直接相連的玻璃微電極，將藥物向核團內注射到腦內島葉皮層中。2.根據權利要求1所述的方法，所述的藥物中含有L-穀氨酸。3.根據權利要求1所述的方法，所述的藥物為人工腦脊液配製的L-穀氨酸，優選的，所述的L-穀氨酸的濃度為5-20mmol/L。4.L-穀氨酸在配製刺激腦內島葉皮層的藥物中的應用。5.根據權利要求4所述的應用，所述的應用是用於構建阻塞性睡眠呼吸暫停症候群動物模型。【文檔編號】A61K31/198GK103948580SQ201410186848【公開日】2014年7月30日申請日期:2014年5月5日優先權日:2014年5月5日【發明者】李明嫻,劉攀,王敏,王紹申請人:吉林大學