一種質譜法檢測非小細胞型肺癌放療毒副作用相關多態性位點基因型的引物組及方法
2023-09-20 08:05:35 1
專利名稱：一種質譜法檢測非小細胞型肺癌放療毒副作用相關多態性位點基因型的引物組及方法
技術領域：
本發明設計一種基因多態性的質譜檢測的多核苷酸及方法，特別是涉及質譜法檢測非小細胞型肺癌放療毒副作用相關基因多態性位點基因型的引物組及方法。
背景技術：
單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP),主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。佔所有已知多態性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500 1000個鹼基對中就有I個，估計其總數可達300萬個甚至更多。SNP所表現的多態性只涉及到單個鹼基的變異，這種變異可由單個鹼基的轉換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由鹼基的插入或缺失所致。一般而言，SNP是指變異頻率大於1%的單核苷酸變異。SNP成為第三代遺傳標誌，人體許多表型差異、對疾病、毒物的易感性與耐受性，疾病臨床表現的多樣性(clinical phenotype diversity),以及對藥物治療的反應性上都起著重要的作用。放射療法是用X線，Y高能電子束等放射線照射在癌組織，由於放射線的生物學作用，能最大量的殺傷癌組織，破壞癌組織，使其縮小。其原理是依據大量的放射線所帶的能量可破壞細胞的染色體，使細胞生長停止。所以可用於對抗快速生長分裂的癌細胞。放射線治療最常作為直接或輔助治療癌症的方式。它作為治療惡性腫瘤的一個重要手段，對於許多癌症可以產生較好效果，但是放療會產生放射性肺炎、放射性食管炎，以及食慾下降、噁心、嘔吐、腹痛、腹瀉或便秘等諸多毒副反應。針對非小細 胞型肺癌，通常與化療合併治療腫瘤。在肺部腫瘤的放射治療中，肺組織往往會受到一定劑量的照射，造成不同程度的放射損傷。肺放射損傷所產生的併發症一急性放射性肺炎和放射性肺纖維化，是胸部腫瘤放射治療劑量的限制因素。動物試驗顯示，給予全肺根治劑量照射後，在數周至數月內將產生明顯的肺內充血、肺泡間質水腫、肺泡內充滿滲出液。隨後是炎症細胞浸潤，肺泡上皮細胞脫落。數周后，間質肺水腫轉變為膠原纖維，肺泡間隔增厚，結果造成氣體交換障礙。在淋巴瘤、縱隔腫瘤肺癌和乳腺癌的放射治療中，約5 15%的患者出現放射性肺炎的臨床症狀，常表現為低熱、咳嗽、胸悶，重者可出現呼吸困難、胸痛、持續性乾咳、痰中帶血、X光胸片可顯示與放射野一致的瀰漫性片狀密度增高影，CT可顯示肺間質密度增高的改變，當超過耐受劑量時，可以產生嚴重的放射性肺炎，臨床症狀嚴重，出現急性呼吸窘迫、高熱，常可導致患者死亡。患者度過急性期，肺炎症狀會持續數月，但組織學改變將繼續發展，逐漸進入肺纖維化期，在此階段仍易產生合併症危及生命。食管受到照射後可引起放射性食道炎、黏膜潰瘍，患者出現胸骨後燒灼感、吞咽疼痛、食道狹窄、纖維化，導致吞咽困難，甚至食道穿孔而危及生命。Phillips等報告單次大劑量照射後，第3天食管的基底層就有空泡形成並缺乏有絲分裂，同時角化的鱗狀細胞層變薄。7 14天增生的基底細胞和再生上皮區域與完全剝脫的區域同時出現，21天後出現基底細胞層增生加速和鱗狀細胞層增厚，使管壁僵硬，失去彈性，管腔進一步狹窄。文獻表明，人體相關基因的多態性位點的共有20個，相關基因及對應的位置點為:IL6的多態性位置點為rsl80079、:rsll556218, PGTS的多態性位置點為rs5275、rs20417、rs689470, IL4R的多態性位置點為:rsl801275，ILlO的多態性位置點為:rsl800872，ILlORA的多態性位置點為rs3135932，ILlA的多態性位置點為rsl800587、rsl7561, IL8的多態性位置點為rs4073, TNFRSF1B的多態性位置點為rsl061622, MIF的多態性位置點為rs755622，N0S3的多態性位置點為rsl799983，IL4的多態性位置點為rs2070874, NFKBlA的多態性位置點為rs8904，IL13的多態性位置點為rs20541、rsl80925及其他基因對應的多態位點等。相關基因的基因型可能是T/C型、G/T等類型，如果能確定多態性位點的基因型，就可以實現個體化治療，從而實現治療效果的最優化。文獻表明，炎症反應相關的細胞因子，其基因的單核苷酸多態性的個體差異，與放療導致的肺炎、食管炎敏感性相關。這些單核苷酸多態性的基因分型和個體對放射性療法引發的炎症發生的風險機率存在劑量效應。綜上所訴，綜合治療時應儘量選擇對所放療臟器毒性小的化療藥物，並針對病人使用合理個體化的放療劑量。目前人體多態性位點的基因型的檢測方法通常有直接測序法，液態晶片法等。其中，直接測序法的檢測成本較高，通量小；液態晶片法的特異性和準確率高，但是需要針對突變位點設計探針和相應的微球，成本高。因此，我們需要找到一種通量高，操作簡便，成本低的方法，以求可以實現對非小細胞型肺癌放療毒副作用相關基因多態性的檢測
發明內容
為了克服上述現有技術的不足，本發明提供了非小細胞型肺癌放療毒副作用相關基因多態性的質譜檢測的多核苷酸及方法。旨在解決現有技術通量低、成本高的問題。一種用於非小細胞型肺癌放療毒副作用相關基因多態性的質譜檢測的多核苷酸引物組，包括擴增引物對及其對應的延伸引物，其特徵在於，所述引物組選自下表組號對應的引物組，可以是下表一組或兩組以上的引物組，擴增引物對和延伸引物分別對應為選取組號所對應的擴增引物對和延伸引物:
組號擴增引物對_延伸引物_
1SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2SEQ ID NO:37
2SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4SEQ ID NO:38
3SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6SEQ ID NO:39
4SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8SEQ ID NO:40
5SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10SEQ ID NO:41
6SEQ ID NO:11 和 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:42
7SEQ ID NO:13 和 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:43
8SEQ ID NO:15 和 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:44
9SEQ ID NO:17 和 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:45
ip |seq id no:i9 和 seq id no:20 |seq id no:46 —
權利要求
1.一種用於非小細胞型肺癌放療毒副作用相關基因多態性的質譜檢測的多核苷酸引物組，包括擴增引物對及其對應的延伸引物，其特徵在於，所述引物組選自下表組號對應的引物組，可以是下表一組或兩組以上的引物組，擴增引物對和延伸引物分別對應為選取組號所對應的擴增弓1物對和延伸引物: _
2.一種非小細胞型肺癌放療毒副作用相關基因多態性的質譜檢測的多核苷酸的方法，步驟如下: (1)採集待檢全血樣本，提取基因組DNA； (2)向獲取的DNA中加入擴增引物對進行的基因，進行擴增反應；(3)使用SAP酶(鹼性磷酸酶)處理擴增產物，去除殘留在反應體系中多餘的脫氧核苷酸； (4)向經過處理後的擴增反應的產物加入延伸引物，進行延伸反應； (6)使用樹脂純化延伸產物； (7)將延伸產物轉移到特製的晶片上； (8)將晶片放置於質譜儀中進行檢測，讀取並分析檢測數據，確認樣本放療毒副作用相關基因多態性位點的基因型，其特徵在於:所述擴增引物對為權利要求1引物組中的擴增引物對，所述延伸引物為權利要求1引物組中的延伸引物。
3.根據權利要求2所述的非小細胞型肺癌放療毒副作用相關基因多態性的質譜檢測的多核苷酸的方法，其特徵在於:完成步驟(I)後，將提取物分成兩組完成(2)至(8)項步驟，第一組中用於擴增反應和延伸反應的的引物組是權利要求1引物組選自上表中組號2和或組號8中的引物組；第二組用用於擴增反應和衍生反應的引物組是權利要求1引物組選自上表中除組號2和組號8之外的一組或兩組以上。
4.根據權利要求2所述的非小細胞型肺癌放療毒副作用相關基因多態性的質譜檢測的多核苷酸的方法，其特徵在於:所述延伸反應步驟所使用的原料是經過質量修飾的雙脫氧核苷三磷酸(d dNTP)。
全文摘要
本發明涉及質譜法檢測非小細胞型肺癌放療毒副作用相關基因多態性位點基因型的引物組及方法,引物組包括擴增引物對和對應的延伸引物，分別在檢測方法中做擴增反應和延伸反應使用。本發明的有益效果在於本發明的引物可有效檢測非小細胞型肺癌放療毒副作用相關基因的基因型，且檢測成本低；通量高，使用384孔板進行實驗，可一次性對190例樣本同時進行檢測(除去對照孔)；準確率高，不出現假陽性的檢測結果。
文檔編號G01N27/62GK103224981SQ20131002762
公開日2013年7月31日 申請日期2013年1月24日 優先權日2013年1月24日
發明者張聰, 郝瑋, 陳然, 葉貴, 李小青, 周蕊, 梁超, 韓韜, 黃士昂, 塗贊兵, 陳忠, 方國偉 申請人:武漢康聖達醫學檢驗所有限公司