用於中藥農業自毒作用評價的方法

2023-09-20 08:09:05 2

專利名稱：：用於中藥農業自毒作用評價的方法
技術領域：
：本發明為中藥資源可持續發展的關鍵技術，具體涉及中藥農業自毒作用評價方法。*
背景技術：
：1中藥材連作障礙及原因藥用植物栽培中，存在一個突出問題，即隨著栽培年齡的增加或栽培地的連作，植株生育不良，品質和產量均大幅度下降。生產實踐中發現，土壤環境惡化是藥用植物栽培中普遍存在的問題，絕大多數根和根莖類藥材"忌"連作。如地黃連作引起嚴重病毒病，藥材減產，同一塊地在8~10年左右不能重茬；人參栽種到5-6年後發病率急劇增加，而且連作障礙嚴重，老參地通常幾十年不能重茬，等等。近年來，隨著栽培面積的不斷擴大及中藥材規範化種植(GAP)的推行，藥用植物栽培中的土壤環境惡化及連作障礙的危害日益突出。藥用植物多為宿根植物，生長周期多為2年，幾年甚至幾十年。這與生長周期短的作物不同，土壤環境惡化不僅表現為重茬，還表現為隨栽培年齡增加出現的一系列土壤環境問題。對於多年生或連作藥用植物，由於耕作，施肥、灌溉等方式固定不變，會導致土壤理化性質惡化，肥力降低，有毒物質積累，有機質分解緩慢，有益微生物種類和數量減少。因此，土壤環境惡化是藥用植物栽培中無法迴避的問題，不能僅藉助常規的輪作倒茬解決。而對藥用植物次生代謝產物的追求加劇土壤環境惡化。引起植物連作障礙的原因主要有土壤養分失衡、土壤微生物群落結構改變、植物毒素物質增加及土壤物理化學性質改變等。2藥用植物自毒作用植物在生長發育過程中不斷與根際土溶液進行著物質與能量的交換，通過各種途徑(如地上部分淋溶、根系分泌、植物殘體分解等)進入根際區的源於植物自身的化學物質，直接影響著根際區土壤中微生物的群落結構，微生物分解代謝又會產生新的化學物質，如此不斷地影響和改變著根際區微生態生境，反過來又對植物自身的生長發育產生影響。植物在長期適應環境的過程中，往往通過向環境釋放化學物質來抑制種內外其它植物的生長以提高其自身的生存競爭力，這種現象被稱為化感作用(Allelopathy)。自毒現象(autotoxicity)是化感作用的重要形式之一，它是指植物根分泌和殘茬降解所釋放出的次生代謝物，對自身或種內其它植物產生危害的一種現象，它是植物適應種內競爭的結果，許多作物的連作障礙與此相關。自毒作用是植物長期適應種內競爭的重要策略，在群體水平上實現了優勝劣汰，對物種的進化具有積極的作用。但就栽培中藥材而言，植物自毒造成的經濟損失是顯而易見的。因此，揭示自毒作用在藥用植物連作障礙中的地位具有重要意義。中藥農業可採用間作套作制度、避免連作等手段來緩解甚至是克服中藥的自毒現象。近年來，通過遺傳育種或轉基因工程的手段和方法，篩選自毒作用小的品種引起人們的重視。3藥用植物化感作用及自毒作用的研究方法自毒物質的提取分離和鑑定及其生物活性的檢測是研究植物化感作用的基礎，通常以待測樣品的植物部分，或者是與它相關的環境土壤作為提取源進行提取分離。藥用植物自毒現象研究至今沿用化感作用研究方法，缺少自己獨特的方法學體系。尤其是在完成化學分離鑑定後，如何評價根際土與藥材中所含次生代謝產物的相似度，至今是個空白。*
發明內容本發明的目的是提供一種用於中藥農業自毒作用評估的方法。本發明的目的通過下述技術方案予以實現。本發明所述的用於中藥農業自毒作用評估的方法，具體包括如下步驟1)製備樣品分別取原植物根莖和根際土樣品適量，蒸餾水浸泡，離心沉澱，上清液抽濾後採用有機溶劑萃取，確定樣品所含化學成分的種類及含量；2)自毒物質相似性比較利用JC係數評價原植物的自毒作用JC=c/(a+b+c)%，公式中a為原植物根莖中特有組分數目，b為原植物根際土中特有組分數目，c為原植物根莖與根際土中3共有組分的數目；當JC大於5(W，表示有自毒作用存在，75%在自毒作用明顯，大於90%有嚴重自毒作用。通過種子發芽實驗，在完成化感作用生物學檢測的基礎上，根據次生代謝指紋圖譜的思路，使用不同溶劑分別提取藥材及根際土溶液，利用GC-MS、HPLC-MS等化學分離鑑別手段，分別對藥材及根際土所含化學物質進行分離鑑別，結合本發明所用JC係數，評價藥材及根際土的相似性，從而確定植物自毒是否為藥用植物化感作用的主導因子。JC為JC=c/(a+b+c)%,a為藥材中特有組分數目，b為根際土中特有組分數目，c為藥材與根際土中共有組分的數目(a，b所代表組分歸一化百分含量大於iy。，c所代表兩個共有組分中至少有一個的歸一化百分含量大於>1%)。*圖1不同濃度蒼朮根莖及根際土提取液對蒼朮種子發芽率、胚根長及胚芽長的影響I代表誤差線圖2蒼朮根莖及根際土乙醚及乙酸乙酯萃取液GC-MS色譜圖aa根莖乙醚萃取液，sa根際土乙醚粗取液，ae根莖乙酸乙酯萃取液，se根際土乙酸乙酯萃取液*具體實施例方式下面的實施例將對本發明作進一步的解釋，但是本發明並不僅僅局限於這些實施例，這些實施例不以任何方式限制本發明的範圍，本領域的技術人員在權利要求的範圍內所作出的某些改變和調整也應認為屬於本發明的範圍。1自毒物質的提取和試樣的製備自毒物質的提取和試樣的製備即是化學分析的必要步驟，也是生物學分析的基礎。根據自毒物質進人環境的途徑，常用水作為浸提溶劑在常溫條件下提取。同時在化感作用的研究中不應使用研碎的植物材料，因為在粉碎研磨過程中很多在自然條件下不釋放的酶、胺基酸、無機鹽和含氮物質也釋放出來，也會使提取液的滲透勢異常ra值發生變化。由於自毒物質具有濃度效應，同一種自毒物質在不同濃度下其作用的程度及性質不同，浸提液的濃度應該在自然狀態下可能的濃度範圍內。如果將植物栽種在無菌水、培養液或固體介質中，培養一段時間後，取培養液(基)收集根系分泌物進行分析。2化感作用的生物測定生物測定(bioassay)是植物化感研究非常重要的手段。根據研究對象特點和實驗條件，可選用以下一種或幾種方法進行生物測定①種子萌發試驗最常用的種子萌發實驗是在大小合適的培養皿或三角瓶中進行，將經挑選的種子放入含有不同濃度自毒物質的濾紙或瓊脂上，在有合適光照和溫度的培養箱中進行培養。種子萌發的標準是胚根突破種皮l-2mm，萌發的時間根據植物的不同一般為l-7d，用種子萌發的百分率來表示。為解釋自毒物質對種子萌發的延緩作用，可以採用萌發指數(I)來定量，連續5d記錄種子萌發情況，I用如下方法計算:1=2(5XX1+4XX2+3XX3+2XX4+1XX5)，式中X是指每隔24h萌發的種子數；Xl=24h記錄的萌發數；X2=48h記錄的萌發數，依次類推。②幼苗生長發育實驗它指受體植物在最初的生長發育、器官形成過程中的生物測定，逋常用胚根、下胚軸或胚芽鞘的伸長來表示，也可以通過稱量葉、莖、根的幹質量(生物重)來衡量自毒物質作用的強弱。幼苗生長生物測定的敏感性一般比種子發芽要好。③揮發性物質測定對於測定揮發性物質化感作用，可在密閉的容器中將植物材料或揮發性物質放在底部和上部，將無蓋的培養皿放在中間進行種子萌發實驗，容器必須每天通氣以保證足夠的氧氣供應。3自毒物質分離鑑定自毒物質的分離包括各種中藥化學研究中常用的萃取法、色譜法等。當前，自毒物質化學鑑別應用最多的為氣質聯用及液質聯用技術。本發明為了評價中藥自毒作用，在自毒物質的提取和製備、自毒物質的生物學評價及自毒物質的物質的分離鑑定中，均要求同時提取、分析和鑑定根際土壤及藥材2套樣品。4自毒物質相似性比較對於生物學檢驗證明根際提取物及藥材提取物對該藥用植物本身有明顯抑制作用(自毒作用)的中藥材，利用本發明所用JC係數，結合分離鑑別到的自毒物質，評價藥材及根際土的相似性，從而確定植物自毒是否為藥用植物化感作用的主導因子及自毒作用的大小。JC為JC=c/(a+b+c)%，a為藥材中特有組分數目，b為根際土中特有組分數目，c為藥材與根際土4中共有組分的數目(a，b所代表組分歸一化百分含量大於W，c所代表兩個共有組分中至少有一個的歸一化百分含量大於》1%)。當JC大於50。/。，表示有自毒作用存在，75%在自毒作用明顯，大於90%有嚴重自毒作用。5研究實例本發明是在中藥蒼朮自毒作用的研究中形成的。蒼朮為常ffl中藥材，栽培蒼朮連作障礙嚴重，認為與植物自毒有關。具體操作如下-(1)自毒物質的提取和試樣的製備取蒼朮根莖40g,加蒸餾水適量，25。C浸泡24小時，減壓抽濾，定容至200mL,得到相當於蒼朮根莖200mg/ml的上清液，編號A200。將A200分別稀釋4倍和20倍，得到相當於蒼朮根莖50，10mg/ml溶液，編號A50和A10。取蒼朮根際土200g，加蒸餾水400mL，25'C浸泡24小時，減壓抽濾，得到相當於蒼朮根際土500mg/mli:清液，編號S500。將S500分別稀釋2.5倍和10倍，得到相當於蒼朮根際土200、50mg/ra丄的溶液，編號S200和S50。用作蒼朮化感作用的生物學的研究。(2)化感作用的生物測定設水(編號CK)，AIO、A50、A200、S50、S200及S500共7個處理，每個處理3個重複。每個重複選取20粒種子，0.1%HgCl消毒lOmin，隨機鋪在墊有濾紙的直徑為15cm的培養皿中，分別加入水、不同濃度根莖或根際土水提液各5mL,在25'C恆溫培養箱內培養。不斷觀察，第5天測量發芽率、第7測量胚根長，第14天測量胚芽長。通過SPSS10.0軟體，利用單因子方差分析結合多重比較分析種子發芽率、胚根長及胚芽長的差異。結果50mg/mL及200mg/niL根際土提取液對蒼朮種子發芽率、胚根長及胚芽長均無影響。500mg/mL根際土提取液對蒼朮種子發芽率無影響，稍抑制了蒼朮胚根與胚芽的伸L《但差異不顯著(p>0.05，圖l)。單因子方差分析結合多重比較分析表明，隨蒼朮根莖提取液濃度的增大，其對蒼朮種子發芽率、胚根和胚芽伸長的抑制作用顯著增大。經200mg/mL蒼朮根莖提取液處理的蒼朮種子發芽率、胚根長及胚芽長分別為對照的13%、32%及24%(p<0.05，圖1，表1=。表l不同濃度蒼朮根莖提取液處理對蒼朮種子發芽率、胚根長及胚芽K的影響濃度(mg/mL)發芽率(％)胚根長(％)胚芽長(％)tableseeoriginaldocumentpage5同一列標有不同字母表示處理間差異顯著(p<0.05)(3)自毒物質分離鑑定取蒼朮根莖及根際土樣品適量，蒸餾水浸泡24小時，其間多次震搖。離心使蒼朮根莖及土壤沉澱，上清液抽濾。濾液加入等量乙醚萃取得到乙醚萃取液，剩餘水提液再用等量乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取液。所得乙醚及乙酸乙酯萃取液分別用旋轉蒸發儀在4'C濃縮至幹，再分別用乙醚或乙酸乙酯lmL溶解，用於GC-MS分析。乙醚及乙酸乙酯均為分析純。氣質聯用儀器為TRACEGC2000，DB-5MS石英毛細管柱0.25mmlDX30raX0.25nm，進樣溫度250'C，程序升溫從60'C到290°C，15°Cmin—'，載氣為He。EI源，70ev，接口溫度25(TC，源溫200'C,檢測溫度20(TC，進樣量lyl，35650全掃描。應用MAINLIB質譜資料庫計算機檢索系統分析質譜圖，進行未知物的鑑定。結果利用GC-MS分析，從蒼朮根莖中共鑑定出20個化合物，根際土共鑑定出27個化合物(圖2、表2)，包括烷、醇、苯、萘、酸及酯等成分。表2所列出的化合物均屬GC-MS鑑定匹配度大於75呢的化合物。表2蒼朮根莖及根際土提取物GC-MS鑑別到的有機化合物樣品成分樣品成分aa2、5—二炔基十八酸Sa1、2—二苯甲酸一(1-一丁基、2—葵基)酯B-桉葉醇2、6—二丁基對羥基甲苯茅術醇十六酸十五醛十四酸三十七烷醇aea萘酚2—甲氧基一4一乙烯基苯酚3—甲基一3—苯基一2—丙烯醛2、6—二丁基對羥基甲苯檸檬烯9一烯一2—十八烷氧醇乙基異別膽烷2、3—十六二烷酸一l一羥基一丙酯十六酸十八酸十四酸1、2—二苯甲酸異丁酯1、2—苯並異噻唑9一烯一—十八酸酯l一甲基一4一異丙基一l一羥基一環己烷對甲氧基酚2、6-二叔丁基對羥基苯丙酸酯十四酸甲酯十八醛十八酸甲酯十四酸Se1、2—二苯甲酸異丁酯1、2—苯並異噻唑3、7、ll一三甲基十二垸醇4一甲基，l一(l一甲基乙基)，1-乙酸一3—環己烯酯9-十六烯酸甘菊環2、6—二丁基對羥基甲苯檸檬烯十二驚乙基異別膽垸13—十五烷基一12、13—二十五醚十六酸異丙酯十六酸2-九烯醇十八酸十四酸十四酸三甲基矽酯aa根莖乙醚萃取液，sa根際土乙醚粗取液，ae根莖乙酸乙酯萃取液，se根際十乙酸乙酯萃取液(4)自毒物質相似性比較利用本發明所用JC係數，評價藥材及根際土的相似性，從而確定植物自毒是否為藥用植物化感作甩的主導因子。本研究中的目的，利用本發明的JC係數評價蒼朮的自毒作用JOc/(a+b+c)%,公式中a為蒼朮根莖中特有組分數目，b為蒼朮根際土中特有組分數目，c為蒼朮根莖與根際土中共有組分的數目(a，b所代表組分歸一化百分含量大於1%,c所代表兩個共有組分中至少有一個的歸一化百分含量大於》1%)。結果計算根莖及根際土中歸一化百分含量大於1%的組分的相似係數，乙醚萃取液中二者的相似係數為33.33%，乙酸乙酯萃取液中二者的相似係數為90.00%(表3)。可見，根莖與根際土乙酸乙酯萃取液中所含化合物非常相似，二者含量最大的組分一致，均為鄰笨二甲酸二異—廠酯(歸一化百分含量分別為35.36%、35.37%)。證明蒼朮有明顯自毒作用。表3蒼朮根莖及根際土所含化合物的組分的相似度比較*樣品組分數獨有組分數共有組分數組分總數相似係數(％)10782433.33sa17990182090,00S6202歸一化百分含量大於1%的組分。Aa根莖乙醚萃取液，sa根際土乙醚粗取液，ae根莖乙酸乙酯萃取液，se根際土乙酸乙酯萃取液實驗中發現，蒼朮根莖水提液能顯著抑制蒼朮種子發芽率及胚根和胚芽的伸長。實驗中，從蒼朮根莖中共鑑定出化合物20個次，根際土中共鑑定出化合物27個次，包括烷、醇、苯、萘、酸及酯等成分，尚6不包括更多的含量低未被鑑定出的化合物。迄今為止所發現的自毒物質幾乎都是植物的次生代謝產物，其中最常見的是低分子有機酸、酚類和內萜類化合物。本實驗所分離鑑定到的化合物中不乏此類物質，證明蒼朮根莖及根際土中均含有抑制其自身生長的自毒物質，即植物自毒素。本研究表明，JC在中藥自毒作用的鑑定和評價中簡單有效。權利要求1.一種用於中藥農業自毒作用評估的方法，其特徵在於包括以下步驟1)製備樣品分別取原植物根莖和根際土樣品適量，蒸餾水浸泡，離心沉澱，上清液抽濾後採用有機溶劑萃取，確定樣品所含化學成分的種類及含量；2)自毒物質相似性比較利用JC係數評價原植物的自毒作用JC＝c/(a+b+c)％，公式中a為原植物根莖中特有組分數目，b為原植物根際土中特有組分數目，c為原植物根莖與根際土中共有組分的數目；當JC大於50％，表示有自毒作用存在，75％在自毒作用明顯，大於90％有嚴重自毒作用。2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於a為原植物根莖中特有組分數目，b為原植物根際土中特有組分數目，c為原植物根莖與根際土中共有組分的數目。3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於a，b所代表組分歸一化百分含量大於1%,c所代表兩個共有組分中至少有一個的歸一化百分含量大於》1%。4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於採用GC-MS確定樣品所含化學成分的種類及含量5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述中藥為蒼朮。6.如權利要求4所述的方法，其特徵在於所述的有機溶劑為乙醚和乙酸乙酯。7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於取蒼朮根莖及根際土樣品適量，蒸餾水浸泡，離心沉澱，上清液抽濾後加入等量乙醚萃取得到乙醚萃取液，剩餘水提液再用等量乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取液。所得乙醚及乙酸乙酯萃取液濃縮至幹，再分別用乙醚或乙酸乙酯溶解。8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於氣質聯用儀器為TRACEGC2000,DB-5MS石英毛細管柱0.25nralDX30mX0.25um，進樣溫度250'C，程序升溫從60。C到290'C，15。Cmin1,載氣為He;EI源，70ev，接口溫度250。C，源溫200。C，檢測溫度200'C，進樣量lul，35650全掃描。全文摘要本發明是一種用於中藥農業自毒作用評估的方法，通過儀器分析確定樣品所含化學成分的種類及含量；在此基礎上利用JC係數評價原植物的自毒作用評價藥材及根際土的相似性，從而確定植物自毒是否為藥用植物化感作用的主導因子。該方法對於中藥自毒作用的鑑定和評價中簡單有效。文檔編號G01N33/00GK101551370SQ20081024073公開日2009年10月7日申請日期2008年12月24日優先權日2008年12月24日發明者吳志剛,林淑芳,郭蘭萍,黃璐琦申請人:中國中醫科學院中藥研究所