一種生物神經環路活體成像系統的製作方法

2023-09-20 23:20:05

一種生物神經環路活體成像系統的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種生物神經環路活體成像系統，其包括多模式可調光源裝置、生物行為成像裝置、三軸載物運動裝置、感興趣區域實時追蹤裝置、生物神經環路成像裝置和控制裝置，多模式可調光源裝置向放置在三軸載物運動裝置上的經螢光標記的生物樣本投射照明光以及激發光；生物行為成像裝置用於獲取生物樣本的行為活動視頻，輸送給控制裝置，控制裝置控制三軸載物運動裝置的運動，對生物樣本進行實時鎖定；感興趣區域實時追蹤裝置用於將生物樣本中生物神經環路感興趣區域進行實時鎖定；生物神經環路成像裝置與生物行為成像裝置同步、用於獲取生物樣本中生物神經環路感興趣區域的視頻。本發明能夠實現生物行為活動與其神經環路的多尺度精確同步成像，可以用於開展小型模式生物神經環路的活體成像研究。
【專利說明】一種生物神經環路活體成像系統

【技術領域】
[0001] 本發明涉及成像裝置，尤其涉及一種生物神經環路活體成像系統。

【背景技術】
[0002] 目前國際領先的光學顯微成像技術包括受激發射減損（STED)、結構照明（SM) 和全反射結構照明（TIRF-SM)，光敏定位（PALM)和螢光光敏定位（FPALM)，隨機光學重建 (STORM)等，這些成像技術均突破了原有顯微成像技術的成像性能。光學顯微成像性能主要 包含時間解析度、空間解析度、視場和信噪比。在實際成像系統中，上述性能指標之間存在 相互制約，即追求某一項性能指標的提升都是以其它一項或多項性能指標的下降為代價實 現的。例如，高空間解析度成像技術會犧牲時間解析度，高時間解析度成像技術會犧牲空間 解析度和信噪比，大視場成像技術會犧牲空間和時間解析度等。目前國內外研製成功的生 物顯微成像技術，其時間解析度處於50Hz水平，尚無法捕捉動作電位(微米以及亞微米級 尺寸）在神經環路中100Hz以上的快速精細運動。


【發明內容】

[0003] 本發明的目的是提出一種生物神經環路活體成像系統，該成像系統能夠實現生物 行為活動與其神經環路的多尺度精確同步成像，可以用於開展小型模式生物神經環路的活 體成像研究。
[0004] 為實現上述目的，本發明提供了以下技術方案：
[0005] -種生物神經環路活體成像系統，其包括多模式可調光源裝置、生物行為成像裝 置、三軸載物運動裝置、感興趣區域實時追蹤裝置、生物神經環路成像裝置和控制裝置，其 中：所述多模式可調光源裝置向放置在所述三軸載物運動裝置上的經螢光標記的生物樣本 投射照明光以及激發光；所述生物行為成像裝置用於獲取所述生物樣本的行為活動視頻， 輸送給所述控制裝置，所述控制裝置控制所述三軸載物運動裝置的運動，對所述生物樣本 進行實時鎖定；所述感興趣區域實時追蹤裝置用於將所述生物樣本中生物神經環路感興趣 區域進行實時鎖定；所述生物神經環路成像裝置與所述生物行為成像裝置同步、用於獲取 所述生物樣本中生物神經環路感興趣區域的視頻。
[0006] 進一步地，所述感興趣區域實時追蹤裝置包括高速相機、第一二軸掃描鏡、顯微物 鏡和第一分光片，其中：所述多模式可調光源裝置出射的第一激發光通過所述顯微物鏡投 射在所述生物樣本上，所述生物樣本內的標記螢光受此激發後產生的第一發射光依次經 由所述顯微物鏡、第一二軸掃描鏡和第一分光片，在所述高速相機成像；所述控制裝置獲 取所述高速相機的圖像，並通過圖像處理算法估計所述高速相機拍攝的當前幀和上一幀 圖像中感興趣區域內少數螢光結構的兩軸平移量，控制所述第一二軸掃描鏡的動作以完 成感興趣區域的平移運動補償，使所述生物樣本中生物神經環路感興趣區域實時鎖定在 100X100 μ m的中心視場。
[0007] 進一步地，所述感興趣區域實時追蹤裝置還包括聚焦透鏡和二向色分光片，其中： 所述多模式可調光源裝置出射的第一激發光依次經由聚焦透鏡和二向色分光片，所述二向 色分光片的反射光通過所述顯微物鏡投射所述生物樣本。
[0008] 進一步地，所述生物神經環路成像裝置包括科學級相機和第二二軸掃描鏡；其中： 所述多模式可調光源裝置出射的第二激發光通過所述顯微物鏡投射在所述生物樣本上，所 述生物樣本內的標記螢光受此激發後產生的第二發射光依次經由所述顯微物鏡、二向色分 光片、第一二軸掃描鏡和第一分光片，投射在所述科學級相機上，得到由若干個巾貞內不同時 刻生物神經環路感興趣區域圖像經陣列排布組成的圖像，並同步傳輸給所述控制裝置；所 述控制裝置根據所述科學級相機的外觸發信號同步控制所述第二二軸掃描鏡在相機的幀 內和幀間逐一完成生物神經環路感興趣區域對應圖像子視場的移動切換。
[0009] 進一步地，所述生物神經環路成像裝置還包括薄膜變形鏡；所述薄膜變形鏡設置 在所述第一分光片與所述第二二軸掃描鏡之間的光路中，並與所述顯微物鏡的主平面滿足 物像共軛位置關係；所述控制裝置根據預先標定好的生物神經環路感興趣區域對應圖像各 個子視場的波前像差分布，控制所述薄膜變形鏡在相機的幀內和幀間逐一完成生物神經環 路感興趣區域對應圖像子視場的波前像差補償。
[0010] 進一步地，所述生物神經環路成像裝置還包括可調視場光闌；所述可調視場光闌 設置在所述第一分光片與所述薄膜變形鏡之間的中繼像面上的矩形通光區域，所述第一二 軸掃描鏡的動作能夠使所述生物樣本的生物神經環路感興趣區域鎖定在所述矩形通光區 域內。
[0011] 進一步地，所述生物神經環路成像裝置還包括第一濾光片、反射鏡和五稜鏡，其 中：所述第一濾光片設置在所述可調視場光闌與所述薄膜變形鏡之間的光路中，透射光經 由所述薄膜變形鏡依次經由所述反射鏡和五稜鏡，投射在所述第二二軸掃描鏡上。
[0012] 進一步地，所述生物行為成像裝置獲取所述生物樣本在照明光照射下的行為活動 視頻時，所述控制裝置通過圖像處理算法估計所述生物行為成像裝置拍攝的當前幀和上一 幀圖像中所述生物樣本的兩個平移量和旋轉量，通過控制所述三軸載物運動裝置完成包 含兩個平移量和一個旋轉量的生物行為成像幀間運動補償，使所述生物樣本實時鎖定在 5 X 5mm的中心視場。
[0013] 進一步地，所述生物行為成像裝置為0. 7?4. 5 X變焦鏡組、同軸照明光路和工業 級相機。
[0014] 進一步地，所述控制裝置包括計算機和FPGA (Field Programmable Gate Array， 現場可編程門陣列），其中：所述計算機用於接收外界傳輸的各種圖像信息和完成一部分 計算複雜度不高的圖像處理算法，經由所述FPGA完成剩餘的圖像處理算法和精確控制各 個硬體設備的操作時序以實現同步。
[0015] 進一步地，所述第一二軸掃描鏡和所述第二二軸掃描鏡的時間帶寬均為5kHz，所 述薄膜變形鏡的時間帶寬為10kHz。
[0016] 基於上述技術方案中的任一技術方案，本發明實施例至少可以產生如下技術效 果：
[0017] 由於本發明設置了多模式可調光源裝置、生物行為成像裝置、三軸載物運動裝置、 感興趣區域實時追蹤裝置、生物神經環路成像裝置和控制裝置，多模式可調光源裝置向放 置在三軸載物運動裝置上的經螢光標記的生物樣本投射照明光以及激發光；生物行為成像 裝置獲取生物樣本的行為活動視頻，並輸送給控制裝置，控制裝置控制三軸載物運動裝置 的運動，對生物樣本的活動區域進行實時鎖定；感興趣區域實時追蹤裝置能夠對生物樣本 中感興趣區域進行高速精確地補償進而實現實時鎖定；生物神經環路成像裝置與生物行為 成像裝置同步，用於獲取生物樣本的神經環路視頻，由此可以看出，本發明具有對生物小目 標和生物感興趣區域(神經環路）的實時追蹤功能，能夠實現生物行為活動與其神經環路的 多尺度精確同步成像，因此利用本發明可以開展小型模式生物神經環路信息傳遞的活體成 像研究，進而可以開展小型模式生物神經系統的動力學機制研究。
[0018] 除此之外，本發明的優選技術方案至少還存在以下優點：
[0019] 1、由於本發明中的多模式可調光源裝置出射的第一激發光通過顯微物鏡投射在 生物樣本上，生物樣本內的螢光受此激發後產生的第一發射光依次經由顯微物鏡、二向 色分光片、第一二軸掃描鏡和第一分光片；第一分光片的反射光在高速相機成像；控制裝 置通過獲取高速相機的圖像，並通過圖像處理算法估計高速相機拍攝的當前幀和上一幀 圖像中感興趣區域內少數螢光結構的兩軸平移量，控制第一二軸掃描鏡的動作以完成感 興趣區域的平移運動補償，從而可以將生物樣本中生物神經環路感興趣區域實時鎖定在 100 X 100 μ m的中心視場，因此本發明具有視場要求小的優勢，進而為本發明同時具備高時 間解析度和高空間解析度的顯微成像性能提供了有利條件。
[0020] 2、由於本發明中的多模式可調光源裝置出射的第二激發光通過顯微物鏡投射在 生物樣本上，生物樣本內的螢光受此激發後產生的第二發射光依次經由顯微物鏡、二向色 分光片、第一二軸掃描鏡和第一分光片；第一分光片的透射光通過第二二軸掃描鏡投射至 在科學級相機，得到由若干個幀內不同時刻生物神經環路感興趣區域圖像經陣列排布組成 的圖像，並同步傳輸給控制裝置；控制裝置根據科學級相機的外觸發信號同步控制第二二 軸掃描鏡在相機的幀內和幀間逐一完成生物神經環路感興趣區域對應圖像子視場的移動 切換，加之本發明所獲取的生物樣本中生物神經環路感興趣區域的視場範圍要求非常小， 也就是說，對於時間解析度、空間解析度、視場和信噪比四個相互制約的光學顯微成像性能 來說，本發明通過引入第二二軸掃描鏡並運用像元時分復用技術實現了科學級相機的超幀 頻成像性能，由此實現生物神經環路感興趣區域成像的高時間解析度。
[0021] 3、由於本發明還在第一分光片與第二二軸掃描鏡之間的光路設置了薄膜變形鏡， 控制裝置根據預先標定好的生物神經環路感興趣區域對應圖像各個子視場的波前像差分 布，控制薄膜變形鏡在相機的幀內和幀間逐一完成生物神經環路感興趣區域對應圖像子視 場的波前像差補償，本發明通過引入薄膜變形鏡並運用波前像差校正技術實現了生物神經 環路感興趣區域成像的高空間解析度。
[0022] 4、由於本發明的生物行為成像裝置在獲取生物樣本的行為活動視頻時，控制裝置 便可以通過圖像處理算法估計生物行為成像裝置拍攝的當前幀和上一幀圖像中生物樣本 的兩個平移量和旋轉量，然後通過控制三軸載物運動裝置完成包含兩個平移量和一個旋轉 量的生物行為成像幀間運動補償，因此可以將生物樣本實時鎖定在5X5mm的中心視場。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本申請的一部分，本發 明的示意性實施例及其說明用於解釋本發明，並不構成對本發明的不當限定。在附圖中：
[0024] 圖1為本發明所提供的生物神經環路活體成像系統的一實施例的原理示意圖；
[0025] 圖2為利用本發明所提供的生物神經環路活體成像系統獲得的生物行為活動與 神經環路的同步成像示意圖；
[0026] 圖3為圖1中感興趣區域實時追蹤裝置的一實施例的原理示意圖；
[0027] 圖4為圖1中感興趣區域實時追蹤裝直的另一實施例的原理不意圖；
[0028] 圖5為圖1中生物神經環路成像裝置的第一實施例的原理示意圖；
[0029] 圖6為圖1中生物神經環路成像裝置的第二實施例的原理示意圖；
[0030] 圖7為圖1中生物神經環路成像裝置的第三實施例的原理示意圖；
[0031] 圖8為圖1中生物神經環路成像裝置的第四實施例的原理示意圖；
[0032] 圖9為圖1的結構示意圖；
[0033] 圖10為圖1中多模式可調光源裝置的結構示意圖；
[0034] 圖11為科學級相機超幀頻時分復用的原理圖；
[0035] 圖12為控制裝置的原理示意圖。

【具體實施方式】
[0036] 下面通過附圖和實施例，對本發明的技術方案做進一步的詳細描述。
[0037] 本發明中所採用的生物樣本是未限制活動自由的活體。首先需要對生物樣本的生 物神經環路感興趣區域進行螢光標記，再利用特定波段的激發光對生物樣本感興趣區域進 行激發，然後利用本發明所提供的生物神經環路活體成像系統，同步獲取生物樣本的行為 活動視頻以及生物樣本中生物神經環路感興趣區域的視頻(如圖2所示)。
[0038] 如圖1-10所示，本實施例所提供的生物神經環路活體成像系統包括多模式可調 光源裝置1、生物行為成像裝置2、三軸載物運動裝置3、感興趣區域實時追蹤裝置4、生物神 經環路成像裝置5和控制裝置6。其中：多模式可調光源裝置1向放置在三軸載物運動裝 置3上的生物樣本投射照明光以及激發光。生物行為成像裝置2用於獲取生物樣本的行為 活動視頻，輸送給控制裝置6,控制裝置6控制三軸載物運動裝置3的運動，將生物樣本的行 為活動實時鎖定在5X5mm的中心視場。感興趣區域實時追蹤裝置4用於將生物樣本中生 物神經環路感興趣區域實時鎖定在100X 100 μ m的中心視場。生物神經環路成像裝置5與 生物行為成像裝置2同步、用於獲取生物樣本中生物神經環路感興趣區域的視頻。
[0039] 如圖10所示，多模式可調光源裝置1為觀測生物樣本提供反射型和透射型的照明 光和激發光，其光源模式包括窄譜帶光、寬譜帶光和雷射。各種模式下的光源的出光強度均 可調節。其中，寬譜帶光可作為照明光源使用，雷射和窄譜寬光可作為激發光源使用。窄譜 帶光和寬譜帶光均可由滷素燈11以及濾光片12來實現，雷射可由單臺半導體雷射器15來 實現，也可以由多臺半導體雷射器15、16和17通過合束器18來實現。對於以上三種光源 模式的輸出均使用光纖跳線13連接到已五維定位的FC/PC光纖調整架上，上述設計可避免 更換光源模式時重複調整光源在光路中的定位。此外，使用光纖跳線13可進一步整合出射 光斑的均勻性並控制出射光斑的數值孔徑，光纖跳線13的兩端均採用FC/PC接口 14。
[0040] 生物行為成像裝置2獲取生物樣本在照明光照射下的行為活動視頻時，控制裝置 6通過圖像處理算法估計生物行為成像裝置2拍攝到的當前幀和上一幀圖像中生物樣本的 兩個平移量（圖9中不出的X軸和y軸平移量）和z軸（圖9中不出的z軸旋轉量)，通過控 制三軸載物運動裝置3,完成包含兩個平移量和一個旋轉量的生物行為成像幀間運動補償。
[0041] 本實施例中，生物行為成像裝置2包括0. 7?4. 5 X變焦鏡組、同軸照明光路和工 業級相機。其中：變焦鏡組的成像放大率可以調節，同軸照明光路用於將多模式可調光源裝 置1出射的照明光投射並覆蓋整個生物樣本。工業級相機能夠完成針對成像目標的自動對 焦，即通過電動平移臺移動成像相機和前置鏡頭，通常完成5-7步移動，工業級相機實時傳 輸每步的圖像信號給控制裝置6,控制裝置6分析每步圖像中感興趣目標的輪廓的銳利程 度，由此擬合出準確的焦面位置，從而再經一次移動完成精確對焦。
[0042] 三軸載物運動裝置3包括一個支撐平臺31、培養皿32和三軸驅動機構（圖中未示 出）。培養皿32用於放置生物樣本，其直徑可以選用不超出90_的任意規格。培養皿32通 常是固定在支撐平臺31中央。所述三軸驅動機構為支撐平臺31的X軸平移、y軸平移和z 軸旋轉提供驅動力，其中的三軸指的是圖10中示出的X軸、y軸和z軸。
[0043] 作為三軸驅動機構的一種實現方式，三軸驅動機構可以包括平臺控制器、壓電陶 瓷致動器、光柵尺、步進電機控制器和步進電機。當進行X軸和y軸平移控制的時候，控制 裝置6將X軸和y軸平移量轉換成控制指令，並將控制指令經由1000M網線傳輸給兩個平 臺控制器，兩個平臺控制器再驅動支撐平臺31的前端的壓電陶瓷致動器（Piezoceramic Motor)作高速閉環運動，運動過程中一直由光柵尺監測支撐平臺31的當前位置，由此反饋 控制壓電陶瓷致動器的運動，最終實現精密的X軸和y軸平移運動。當進行Z軸旋轉控制 的時候，控制裝置6將支撐平臺31的旋轉運動量轉換成控制指令，並將控制指令經由RS232 串口線傳輸給步進電機控制器，步進電機控制器再驅動步進電機完成旋轉運動，以控制支 撐平臺31的旋轉運動，其中沒有測量反饋控制。本實施例中，三軸載物運動裝置3的運動 時間帶寬是10Hz，定位精度10 μ m。
[0044] 如圖3、圖9所示，感興趣區域實時追蹤裝置4包括高速相機41、第一二軸掃描鏡 42、顯微物鏡43和第一分光片44,其中：多模式可調光源裝置1出射中心波長為405nm的 第一激發光，該激發光通過顯微物鏡43投射在生物樣本上，生物樣本內的標記螢光受此激 發產生譜段為500?520nm的第一發射光，並依次通過顯微物鏡43、第一二軸掃描鏡42和 第一分光片44。
[0045] 第一分光片44的作用是反射波長小於530nm的光，透射大於530nm的光。由於生 物樣本內激發出的第一發射光波長小於530nm，因此，該部分發射螢光全被第一分光片44 反射到高速相機41上，並在高速相機41成像。
[0046] 控制裝置6同步獲取高速相機41的圖像，並通過圖像處理算法估計高速相機41 拍攝的當前幀和上一幀圖像中感興趣區域內少數螢光結構的兩軸平移量，從而控制第一二 軸掃描鏡42的動作(擺動方向和幅度)，以完成感興趣區域的平移運動補償，將生物樣本中 生物神經環路感興趣區域實時鎖定在100X 100 μ m的中心視場。
[0047] 本實施例中，高速相機41能夠完成針對成像目標的自動對焦，其自動變焦的原理 與工業級相機22相同，在此不再詳述。第一二軸掃描鏡42必須在幀間的等待時間內完成 動作，之後靜止下來，即進入圖像曝光時間，讓高速相機41完成曝光。例如，第一二軸掃描 鏡42的時間帶寬為5kHz，即是單步運動時間要求在200 μ s內完成。顯微物鏡43採用的是 數值孔徑〇. 6?0. 8、工作距離0. 5?2. 0mm、放大倍率25?60的顯微物鏡。
[0048] 如圖4、圖9所示,上述實施例中，感興趣區域實時追蹤裝置4還可以包括聚焦透鏡 45和二向色分光片46,其中：多模式可調光源裝置1出射中心波長為405nm的第一激發光， 依次經由聚焦透鏡45和二向色分光片46,投射到顯微物鏡43上，並且，該激發光通過顯微 物鏡43投射在生物樣本上，生物樣本內的標記螢光受此激發產生譜段為500?520nm的第 一發射光，並依次通過顯微物鏡43、二向色分光片46、第一二軸掃描鏡42和第一分光片44， 直至在高速相機41上成像。
[0049] 聚焦透鏡45可以作軸向移動用以改變第一激發光的聚焦面位置，由此實現對投 射在生物樣本上的激發光光斑大小的控制，即在焦平面附件光斑很小能量集中，在離焦平 面上光斑較大，從而實現控制激發光僅照射生物樣本的感興趣區域。聚焦透鏡45的軸向移 動可以通過手動方式完成，也可以採用電控的方式實現。
[0050] 二向色分光片46的作用是反射波長小於500nm的光，透射大於500nm的光。中心 波長為405nm的第一激發光經由二向色分光片46的反射，通過顯微物鏡43透射到生物樣 本上。由於生物樣本內的標記突光受此激發後產生譜段為500?520nm的第一發射光，因 此，該譜段發射光再經由顯微物鏡43,到達二向色分光片46,二向色分光片46將其全部透 射到第一二軸掃描鏡42上。
[0051] 如圖11所示，由於科學級相機的成像幀頻最高50Hz，無法滿足本發明對神經環路 成像的時間解析度1000Hz的要求，因此必須設法讓該科學級相機在一幀曝光時間，即20ms 內實現分時復用，因此本發明引入了第二二軸掃描鏡52。考慮到神經環路成像的視場可以 是500X500像素，科學級相機的全視場是2560X2160像素。於是將科學級相機的全視場 劃分為5X4個子視場，子視場間空餘幾行、幾列即可。也就是說，圖11中的A是科學級相 機的全視場，B是神經環路成像的子視場。使用第二二軸掃描鏡52,可以將中心視場平移到 任意子視場。若要求每個子視場曝光時間800 μ s，子視場幀間運動時間為200 μ s，幀間運 動時間內第一二軸掃描鏡42必須完成感興趣區域運動補償以及第二二軸掃描鏡52必須完 成子視場的平移(如圖11所示)。
[0052] 基於以上原因，如圖5、圖9和圖11所示，生物神經環路成像裝置5包括科學級相 機51和第二二軸掃描鏡52,其中：多模式可調光源裝置1出射中心波長為488nm的第二激 發光,通過顯微物鏡43投射在生物樣本上，生物樣本內的標記螢光受此激發後產生波長為 530?560nm的第二發射光，並依次經由顯微物鏡43、二向色分光片46、第一二軸掃描鏡42 和第一分光片44。二向色分光片46僅透射波長大於500nm的發射螢光至第一二軸掃描鏡 42,第一分光片44僅透射波長大於530nm的發射螢光至第二二軸掃描鏡52,經由第二二軸 掃描鏡52反射後，在科學級相機51成像，得到由若干個幀內不同時刻生物神經環路感興趣 區域圖像經陣列排布組成的圖像，並同步傳輸給控制裝置6。控制裝置6根據科學級相機 51的外觸發信號同步控制第二二軸掃描鏡52在相機的幀內和幀間逐一完成生物神經環路 感興趣區域對應圖像子視場的移動切換，從而可以獲得1000Hz成像時間解析度的生物神 經環路活體成像。
[0053] 加之本發明所獲取的生物樣本中生物神經環路感興趣區域的視場範圍要求非常 小，也就是說，對於時間解析度、空間解析度、視場和信噪比四個相互制約的光學顯微成像 性能來說，本發明通過引入第二二軸掃描鏡並運用像元時分復用技術實現了科學級相機的 超幀頻成像性能，由此實現生物神經環路感興趣區域成像的高時間解析度。
[0054] 本實施例中，科學級相機51能夠完成針對成像目標的自動對焦，其自動變焦的原 理與工業級相機22相同，在此不再詳述。科學級相機51的大數據量傳輸需同時滿足相機 緩存、CameraLink接口、PCI-E總線、計算機內存、計算機硬碟寫入的速度要求。第二二軸掃 描鏡52的時間帶寬為5kHz。
[0055] 同理，為了獲得生物神經環路感興趣區域成像的高空間解析度，生物神經環路成 像裝置5還包括薄膜變形鏡53(如圖6、圖9所示)，薄膜變形鏡53設置在第一分光片44與 第二二軸掃描鏡52之間的光路中，並同顯微物鏡43的主平面滿足物像共軛位置關係。
[0056] 以上所提到的第一激發光、第二激發光、第一發射光和第二發射光，以及對應的所 有二向色分光片、濾光片的波長、波段並不局限於上述實施例中所給出的具體數值，這些波 長和波段的具體數值均可根據關注的特徵螢光波長來自行改換設計。
[0057] 控制裝置6根據事先標定好的生物神經環路感興趣區域對應圖像各個子視場的 波前像差分布，控制薄膜變形鏡53在相機的幀內和幀間逐一完成生物神經環路感興趣區 域對應圖像子視場的波前像差補償。
[0058] 基於第一二軸掃描鏡42在子視場幀間運動時間內對感興趣區域的運動補償以及 第二二軸掃描鏡52在子視場幀間運動時間內對子視場的移動切換，再結合薄膜變形鏡53 在子視場幀間運動時間內對各子視場的波前像差校正，本發明可以使每個子視場的成像 空間解析度優於〇. 5 μ m，曝光時間控制為800 μ s，幀間運動時間控制為200 μ s，由此實現 1000Hz的成像時間解析度。
[0059] 本實施例中，薄膜變形鏡53採用的是可高速、精確電控鏡面面形的特殊類反射 鏡，時間帶寬為10kHz。本發明運用波前像差校正技術可實現對光學系統不同視場像差的實 時校正，使得神經環路成像接近系統衍射極限的高空間解析度，即可以獲得優於〇. 5 μ m空 間解析度的生物神經環路活體成像。
[0060] 如圖7、圖9所示，生物神經環路成像裝置5還包括可調視場光闌54,可調視場光 闌54設置在第一分光片44與薄膜變形鏡53之間的中繼像面上的矩形通光區域，矩形通光 區域的長度和寬度可電動調節，以保證生物樣本的生物神經環路感興趣區域經由感興趣區 域實時追蹤裝置4靜止位於可調視場光闌54的矩形通光區域內。
[0061] 如圖8、圖9所示，生物神經環路成像裝置5還可以包括第一濾光片55、反射鏡56 和五稜鏡57,其中：第一濾光片55設置在可調視場光闌54與薄膜變形鏡53之間的光路中。 第一濾光片55僅透射波長小於600nm的發射螢光至薄膜變形鏡53,經由薄膜變形鏡53反 射的發射螢光依次經由反射鏡56和五稜鏡57,投射在第二二軸掃描鏡52上。五稜鏡57的 作用是確保平行光產生90度折轉，以投射到第二二軸掃描鏡52上。
[0062] 上述各實施例中，如圖12所示，控制裝置6包括計算機61和具有獨立處理器和操 作系統的FPGA62,其中：計算機61用於接收外界傳輸的各種圖像信息和完成一部分計算復 雜度不高的圖像處理算法，經由FPGA62完成剩餘的圖像處理算法和精確控制各個硬體設 備的操作時序以實現同步。
[〇〇63] 基於本發明所獲取的生物樣本中生物神經環路感興趣區域的視場範圍要求非常 小，也就是說，對於時間解析度、空間解析度、視場和信噪比四個相互制約的光學顯微成像 性能來說，本發明通過引入第二二軸掃描鏡並運用像元時分復用技術實現了科學級相機的 超幀頻成像性能，同時結合引入薄膜變形鏡並運用波前像差校正技術，同時實現了生物神 經環路感興趣區域成像的0. 5 μ m成像空間解析度和1000Hz成像時間解析度的雙高水平， 對生物行為和生物神經環路感興趣區域在長時間序列下（0. 5-1. 0小時）進行同步成像。 [〇〇64] 最後應當說明的是：以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對其限制；盡 管參照較佳實施例對本發明進行了詳細的說明，所屬領域的普通技術人員應當理解：依然 可以對本發明的【具體實施方式】進行修改或者對部分技術特徵進行等同替換；而不脫離本發 明技術方案的精神，其均應涵蓋在本發明請求保護的技術方案範圍當中。
【權利要求】
1. 一種生物神經環路活體成像系統，其特徵在於： 包括多模式可調光源裝置、生物行為成像裝置、三軸載物運動裝置、感興趣區域實時追 蹤裝置、生物神經環路成像裝置和控制裝置，其中： 所述多模式可調光源裝置向放置在所述三軸載物運動裝置上的經螢光標記的生物樣 本投射照明光以及激發光； 所述生物行為成像裝置用於獲取所述生物樣本的行為活動視頻，輸送給所述控制裝 置，所述控制裝置控制所述三軸載物運動裝置的運動，對所述生物樣本進行實時鎖定； 所述感興趣區域實時追蹤裝置用於將所述生物樣本中生物神經環路感興趣區域進行 實時鎖定； 所述生物神經環路成像裝置與所述生物行為成像裝置同步、用於獲取所述生物樣本中 生物神經環路感興趣區域的視頻。
2. 如權利要求1所述的系統，其特徵在於： 所述感興趣區域實時追蹤裝置包括高速相機、第一二軸掃描鏡、顯微物鏡和第一分光 片，其中： 所述多模式可調光源裝置出射的第一激發光通過所述顯微物鏡投射在所述生物樣本 上，所述生物樣本內的標記螢光受此激發後產生的第一發射光依次經由所述顯微物鏡、第 一二軸掃描鏡和第一分光片，在所述高速相機成像； 所述控制裝置獲取所述高速相機的圖像，並通過圖像處理算法估計所述高速相機拍攝 的當前幀和上一幀圖像中感興趣區域內少數螢光結構的兩軸平移量，控制所述第一二軸掃 描鏡的動作以完成感興趣區域的平移運動補償，使所述生物樣本中生物神經環路感興趣區 域實時鎖定在100X 100 μ m的中心視場。
3. 如權利要求2所述的系統，其特徵在於： 所述感興趣區域實時追蹤裝置還包括聚焦透鏡和二向色分光片，其中： 所述多模式可調光源裝置出射的第一激發光依次經由聚焦透鏡和二向色分光片，所述 二向色分光片的反射光通過所述顯微物鏡投射所述生物樣本。
4. 如權利要求3所述的系統，其特徵在於： 所述生物神經環路成像裝置包括科學級相機和第二二軸掃描鏡；其中： 所述多模式可調光源裝置出射的第二激發光通過所述顯微物鏡投射在所述生物樣本 上，所述生物樣本內的標記螢光受此激發後產生的第二發射光依次經由所述顯微物鏡、二 向色分光片、第一二軸掃描鏡和第一分光片，投射在所述科學級相機上，得到由若干個幀內 不同時刻生物神經環路感興趣區域圖像經陣列排布組成的圖像，並同步傳輸給所述控制裝 置； 所述控制裝置根據所述科學級相機的外觸發信號同步控制所述第二二軸掃描鏡在相 機的幀內和幀間逐一完成生物神經環路感興趣區域對應圖像子視場的移動切換。
5. 如權利要求4所述的系統，其特徵在於： 所述生物神經環路成像裝置還包括薄膜變形鏡； 所述薄膜變形鏡設置在所述第一分光片與所述第二二軸掃描鏡之間的光路中，並與所 述顯微物鏡的主平面滿足物像共軛位置關係； 所述控制裝置根據預先標定好的生物神經環路感興趣區域對應圖像各個子視場的波 前像差分布，控制所述薄膜變形鏡在相機的幀內和幀間逐一完成生物神經環路感興趣區域 對應圖像子視場的波前像差補償。
6. 如權利要求5所述的系統，其特徵在於： 所述生物神經環路成像裝置還包括可調視場光闌； 所述可調視場光闌設置在所述第一分光片與所述薄膜變形鏡之間的中繼像面上的矩 形通光區域，所述第一二軸掃描鏡的動作能夠使所述生物樣本的生物神經環路感興趣區域 鎖定在所述矩形通光區域內。
7. 如權利要求6所述的系統，其特徵在於： 所述生物神經環路成像裝置還包括第一濾光片、反射鏡和五稜鏡，其中： 所述第一濾光片設置在所述可調視場光闌與所述薄膜變形鏡之間的光路中，透射光經 由所述薄膜變形鏡依次經由所述反射鏡和五稜鏡，投射在所述第二二軸掃描鏡上。
8. 如權利要求1所述的系統，其特徵在於： 所述生物行為成像裝置獲取所述生物樣本在照明光照射下的行為活動視頻時，所述控 制裝置通過圖像處理算法估計所述生物行為成像裝置拍攝的當前幀和上一幀圖像中所述 生物樣本的兩個平移量和旋轉量，通過控制所述三軸載物運動裝置完成包含兩個平移量和 一個旋轉量的生物行為成像幀間運動補償，使所述生物樣本實時鎖定在5X5mm的中心視 場。
9. 如權利要求8所述的系統，其特徵在於： 所述生物行為成像裝置為〇. 7?4. 5放大倍率變焦鏡組、同軸照明光路和工業級相機。
10. 如權利要求1-9中任一項所述的系統，其特徵在於： 所述控制裝置包括計算機和FPGA，其中： 所述計算機用於接收外界傳輸的各種圖像信息和完成一部分計算複雜度不高的圖像 處理算法，經由所述FPGA完成剩餘的圖像處理算法和精確控制各個硬體設備的操作時序 以實現同步。
11. 如權利要求4所述的系統，其特徵在於： 所述第一二軸掃描鏡和所述第二二軸掃描鏡的時間帶寬均為5kHz，所述薄膜變形鏡的 時間帶寬為10kHz。
【文檔編號】A61B5/00GK104083146SQ201310255101
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2013年6月25日 優先權日:2013年6月25日
【發明者】毛珩, 陶樂天, 姜明 申請人:北京大學