一種用於預防和治療關節炎的含有蜘蛛酶的組合物的製作方法

2023-09-20 16:01:50

專利名稱：一種用於預防和治療關節炎的含有蜘蛛酶的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於預防和治療關節炎的含有蜘蛛酶(arazyme)作為活性成分 的組合物。
背景技術：
關節炎是指一種關節疾病。關節炎可以是從輕微到嚴重各種形式的損害，可能並 不總是惡化。關節炎有關的疾病是最常見的難治性退行性疾病，全球12%的人口罹患該疾 病。韓國約有200多萬人患有這種疾病。關節炎是顯示肌肉骨骼和結締組織炎症變化所造 成的所有肌肉骨骼系統症狀的統稱。這種疾病的特點是慢性炎症引起組織永久性損害，畸 形和退化，及其產生關節、骨、軟骨或脊髓的問題(Hofbause, L. C.，et. al.，Arthritis and Rheumatism 44 :253_259，2001)。關節炎分為退行性關節炎(骨關節炎)、類風溼性關節炎、強直性脊柱炎、反應性 關節炎、銀屑病關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性肌炎、風溼性多肌痛等。骨性關節炎或磨損又撕裂的關節炎，也稱為退行性關節炎，是最常見的所有關節 炎有關的疾病，通常發生在中年和老年人群。骨關節炎是一種影響脊椎和下肢關節(髖關 節、膝蓋和腳關節)的關節炎，超過60%的人在他們60歲或70歲時患上這種病。骨關節炎 是影響老年人的一種常見疾病。雖然這種疾病在60歲以上的人群中比較常見，但在45歲 以下的人群中，男性比女性更常見，而55歲以上的人群中，女性比男性更普遍。骨關節炎根 據病因主要分為原發性和繼發性兩大類。顯示原因不明的磨破關節軟骨的症狀，即顯示退 行性改變的骨關節炎被稱為原發性骨關節炎，通常在女性中發生。原發性骨關節炎的確切 原因和病因還不清楚。繼發性骨關節炎的原因大致可分為關節損傷、軟骨基質異常、軟骨下 骨畸形等。退行性關節炎是一種隨著年齡增長發病越來越頻繁的慢性關節炎，尤其是膝骨關 節炎，是一種具有高發病率的疾病。有報告指出，通常習慣久坐生活方式的韓國人，膝蓋彎 曲成0型，這會使膝蓋內部的壓力異常增加，到中年時會增加患骨關節炎的可能性。當此炎 症繼續下去，周圍肌肉萎縮可能會導致關節變形，造成各種社會損失，諸如醫療費用，降低 了老人的社會生活質量等。類風溼性關節炎是炎症性關節炎的最常見類型，至2%的人口罹患此疾病。類 風溼性關節炎由滑膜關節炎症導致，10歲以上的任何人都可能發生。但是，這種疾病在女性 中最常見，常發生在30至50歲之間。強直性脊柱炎是一種能引起脊柱和骨盆之間的關節發炎的疾病。有時發生在髖關 節。這種疾病更容易影響男性，男女患病比例約為3 1，通常在20至40歲之間出現。兄 弟姐妹或父母患有強直性脊柱炎的人罹患該疾病的概率是普通人的20倍。系統性紅斑狼瘡是幾種已知的結締組織疾病之一。系統性紅斑狼瘡是類似於類風 溼性關節炎的一種自身免疫性疾病。然而，這種疾病的發生頻率較低，其症狀沒有類風溼性 關節炎嚴重。90%患有這種疾病的人是處於20-30和40-50歲年齡段的年輕女性。
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藥物治療、運動療法、手術療法等都可用於關節炎的治療。其中，諸如止痛藥、腎上 腺皮質激素製劑、非留體抗炎藥等藥物，通常可以減少炎症和減輕疼痛，可用作藥物治療， 但並沒有專門的治療藥物可用。雖然市售有一種構成關節軟骨的成分，其作為保健補品來 發揮功效，但因其治療效果不能持久，因此需要更多的研究。雖然止痛藥能緩解疼痛，但它們沒有抗炎作用。除泰諾(Tylenol)外，止痛藥大都 可能引起嗜睡和便秘等。因此，對關節僵硬或水腫來說效果不大。雖然抗炎藥物中的非留體抗炎藥可以像類固醇一樣減少炎症，但就藥理作用模式 或潛在的副作用而言，這類藥物與類固醇完全不同。非留體抗炎藥物尤其有助於消除由疼 痛以及炎症導致的僵硬和水腫。然而，當內服過量的非留體抗炎藥物或長期使用，會出現如 胃壁出血、胃潰瘍、消化不良等副作用。因此，本發明人對由Aranicola proteolyticus菌株產生的蜘蛛酶的效果進行了 研究，結果顯示，對已知與人退行性關節疾病的誘導病變相似的紐西蘭白兔動物模型誘導 骨關節炎，並採用蜘蛛酶治療，能抑制TNF-α的表達，並防止蛋白多糖和膠原蛋白從關節 軟骨流失，抑制關節炎的進展和保護關節，本發明人因此作出了本發明。

發明內容
本發明的目的之一是提供用於預防和治療關節炎的均含有由Aranicola proteoIyticus產生的蜘蛛酶作為活性成分的組合物和功能保健食品。為了實現上述目的，本發明提供一種含有蜘蛛酶作為活性成分的預防和治療關節 炎的藥物。本發明還提供一種用於預防和改善關節炎的含有蜘蛛酶作為活性成分的功能保 健食品。本發明還提供一種治療關節炎的方法，包括對罹患關節炎的個體施予藥學上有效 量的蜘蛛酶。本發明還提供一種預防關節炎的方法，包括給予個體藥學上有效量的蜘蛛酶。本發明還提供蜘蛛酶在製備預防和治療關節炎的藥物中的應用。此外，本發明還提供蜘蛛酶在製備預防和改善關節炎的功能保健食品中的應用。


結合附圖和以下具體描述，將更清楚地理解本發明的上述和其它目的、特徵及其 它優勢，其中圖1為示出TNF-α在血漿中表達水平的測量結果圖；圖2為示出目視觀察到的股骨髁變化的一組圖片M 內側；和紅色箭頭侵蝕部分，圖3為示出目視觀察到的股骨脛骨變化的一組圖片；圖4為示出目視觀察到的股骨髁和脛骨變化的各級評價結果的一組圖；圖5為示出觀察到的用蘇木精_曙紅對組織樣本染色的組織變化的一組圖片；圖6為示出通過甲苯胺藍染色給予蜘蛛酶對骨關節炎的影響的組織病理結果的一組圖片；圖7為示出通過偶氮卡紅染色給予蜘蛛酶對骨關節炎的影響的組織病理結果的 一組圖片；圖8為示出給予蜘蛛酶對關節炎的影響的組織病理變化分數的一組圖。
具體實施例方式通過參考附圖，對本發明優選的實施方案進行如下具體描述，有助於更清楚地理 解本發明的特徵和優勢。首先應注意基於發明人可以適當定義術語的概念以最佳描述其發 明的原則，本文中使用的術語和詞彙應解釋為與本發明技術精髓相應的意思或含義。另外， 應該認識到，省略有關本發明的熟知的功能和結構的詳細描述，以免不必要地掩蓋本發明 的重點。下面將給出本發明所用術語的定義。本文的術語「關節炎」表示各種細菌諸如結核桿菌等進入關節導致關節炎症的所 有症狀。本文的術語「預防」表示通過給予本發明的組合物抑制關節炎的形成或延遲關節 炎的進展的所有行為。本文的術語「治療」和「改善」表示通過給予本發明的組合物改善或有助於改變關 節炎的症狀的所有行為。本文的術語「給予」表示通過任何適當的方法將本發明預定的組合物引入到個體中。本文的術語「個體」表示所有動物，諸如人、猴子、犬、山羊、豬、大鼠等，其罹患關節 炎，其症狀可以通過給予本發明的組合物得到改善。本文的術語「藥學上有效量」表示應用於醫療時，足以在合理的收益或風險比率下 治療疾病的量，所述比率可以根據多種因素來確定，這些因素包括疾病的種類和嚴重程度、 藥物活性、敏感性、給藥時間、排洩率、給藥周期、聯用藥物和藥學領域熟知的其它因素。以下將對本發明進行具體描述。本發明提供含有蜘蛛酶作為活性成分的預防和治療關節炎的藥物。本發明的蜘蛛酶可以優選地按照包括如下步驟的方法來製備，但不限於此1)培養 Aranicola proteolyticus 菌株以得至Ij培養液；2)過濾所述培養液以得到上清液；和3)採用樹脂從上清液中純化蜘蛛酶。在製備方法中，優選以Aranicola proteolyticus菌株作為產蜘蛛酶的微生物，更 優選使用1996年7月29日保藏在KRIBB (韓國生物技術資源研究所)的KCTC (韓國典型培 養物保藏中心)的Aranicola proteolyticus HY_3(保藏號=KCTC 0268BP)，但不限於此。Aranicola proteolyticus ΗΥ-3(Nephila clavata) W^JS^^i^ 的需氧型革蘭氏陰性菌，0. 5-0. 8mm大小，圓形，可移動，對過氧化氫酶呈陽性，但對氧化酶 呈陰性(W0 01/57222)。優選使用由上述方法得到的蜘蛛酶，更優選使用由下面的方法得到的蜘蛛酶。優 選藥品級的培養Aranicola proteolyticus的基本材料，當只進行純化操作時，更易於得到具有更高純度的產品。培養後，進行硫酸銨沉澱(或丙酮沉澱)，然後離心和過濾回收蜘蛛 酶。大部分由微生物產生的其它蛋白質與蜘蛛酶具有不同的沉澱濃度。回收蜘蛛酶後，通 過膜過濾進行首次純化以除去雜質，使用超過濾系統進行最終純化，以獲得純蜘蛛酶。所得 到的高濃度蜘蛛酶溶液用凍幹機凍幹，得到可用的蜘蛛酶粉末。本發明的蜘蛛酶可以通過下面的方法來製備，但不限於此1)將含有蜘蛛酶編碼區的核苷酸序列的DNA克隆到表達載體中；2)將步驟1)克隆的表達載體引入到宿主細胞；3)對步驟2)轉化的宿主細胞進行篩選；和4)從步驟3)篩選的宿主細胞中獲得表達的蜘蛛酶。在該方法中，步驟1)含有蜘蛛酶編碼區的核苷酸序列優選SEQ ID No 2所示的 DNA,或者在嚴格條件下與含有SEQ ID No 2所示的核苷酸序列的DNA雜交的DNA。該嚴格 條件在雜交後的洗滌過程中確定。例如，該嚴格條件是指室溫下用6X SSC和0.5% SDS洗 滌15分鐘，在45°C下用2 X SSC和0. 5% SDS洗滌30分鐘，在50°C下用0. 2 X SSC和0. 5% SDS洗滌30分鐘，重複洗滌兩次。更優選地，該嚴格條件是指在較高溫度下洗滌。具體地， 除最後兩次在60°C下用0. IXSSC和0. 洗滌外，其它與上述條件相同。本領域技術人員 可以確定或調整這種嚴格條件。此處的表達載體優選本領域技術人員熟知的常規革蘭氏陰 性菌或革蘭氏陽性菌。也可以使用市售的載體，更優選地，該載體包含用於更好篩查的藥物 抗性基因。只要不影響蜘蛛酶基因的任何載體都可以使用。在該方法中，步驟2)的宿主細胞可以選自細菌諸如大腸桿菌(E.coli)和枯草杆 菌(Bacillus subtilis)以及酵母菌諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假絲酵 母(Candia)和畢赤酵母(Phicia)，但不限於此。在該方法中，優選地，步驟3)中轉化的宿主細胞的篩選可通過將藥物抗性基因導 入載體來篩選，或者與DNA印跡(Southern blotting)或PCR結合來篩選，但不限於此。在該方法中，步驟4)得到的蜘蛛酶可以包括由任何蛋白純化方法獲得的蜘蛛酶。 例如，優選地，可以採用下述方法實現蛋白純化柱層析、過濾、超濾、鹽析、溶劑沉澱法、溶 劑萃取法、蒸餾法、免疫沉澱、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳、透析或重結晶、但不 限於此。可採用本領域技術人員熟知的常規的蛋白表達系統獲得由DNA編碼的蜘蛛酶。可 以從表達蜘蛛酶的細胞培養物中回收和純化蜘蛛酶。優選地，本發明的蜘蛛酶選自如下蛋白組成的組中的一種，但不限於此(a)具有如SEQ ID No 1所示的胺基酸序列的蛋白；(b)由含有如SEQ ID No 2所示的核苷酸序列編碼區的DNA編碼的蛋白；(c)具有如SEQ ID NO=I所示的胺基酸序列通過替換、缺失、插入和/或添加一個 或多個胺基酸突變的胺基酸序列的蛋白，所述蛋白與含有如SEQ ID No :1所示的胺基酸序 列的蛋白具有同等功能；以及(d)由在嚴格條件下與含有SEQ ID No 2所示核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼 的蛋白，所述蛋白與含有如SEQ ID No :1所示的胺基酸序列的蛋白具有同等功能。在嚴格的條件下雜交能夠提供核苷酸序列具有高同源性的DNA，表明分離的蛋白 非常可能具有與蜘蛛酶功能相同的蛋白。具有高同源性的核苷酸序列表示核苷酸序列與 SEQ ID No :2所示的核苷酸序列具有70%或更高的同源性，優選地為80%或更高，更優選
7地為90%或更高，最優選地，與SEQ ID No :2所示的核苷酸序列具有95%或更高的同源 性。此外，可以使用與SEQ ID No :1所示的胺基酸序列具有70%或更高同源性的胺基酸序 列，優選地為80%或更高，更優選地為90%或更高，最優選地，可以使用與SEQ ID No 1所 示的胺基酸序列具有95%或更高同源性的胺基酸序列。本領域技術人員可以選擇常規算 法確定同源率。可以採用本領域技術人員熟知的方法在嚴格的條件下通過DNA-DNA雜交 進行雜交，如前所述，在雜交後洗滌過程中確定雜交中嚴格的條件(Hames和HigginS，EdS. Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, U. K. ,1985)。本發明提供一種含有蜘蛛酶作為活性成分的預防和治療關節炎的藥物。關節炎包括退行性關節炎、類風溼性關節炎、強直性脊柱炎、反應性關節炎、銀屑 病關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性肌炎或者風溼性多肌痛。為了研究蜘蛛酶對骨關節炎的影響，採用已知與人退行性關節疾病的誘導病變相 似的紐西蘭白兔動物模型，通過斷裂右前肢的前十字韌帶誘導骨關節炎，然後給予蜘蛛酶。在本發明中，從給予蜘蛛酶的兔中採集血液，從血液中分離血清，用ELISA法 (0皿肚11^1^ ，研發體系)在血清中分析1順-(1。結果確定，與對照組相比，給予蜘蛛酶的 試驗組抑制了參與初始炎症反應過程的TNF-α的表達。因此，可以確定通過抑制炎症誘導 因子TNF-α的表達，本發明的蜘蛛酶對誘導骨關節炎發病有效果。為了研究給予蜘蛛酶的兔關節軟骨的變化，從脛骨分離股骨，摘除周圍肌肉，然後 觀察關節軟骨表面。結果，觀察到給予蜘蛛酶的試驗組的軟骨損傷小於對照組。因此，可以 確定本發明的蜘蛛酶對關節炎具有療效。為了觀察組織變化和膠原蛋白及蛋白多糖的損失程度，製備已分離的股骨和脛骨 的組織切片，分別用蘇木精_曙紅(H&E)、偶氮卡紅和甲苯胺藍染色，隨後在光學顯微鏡下 觀察。結果，與對照組相比，給予蜘蛛酶的試驗組全部顯示較小的關節軟骨損傷或較少的蛋 白多糖和膠原蛋白損失。因此，由於本發明的蜘蛛酶顯示出的軟骨損傷與非甾體抗炎藥塞 來昔布類似，以及蛋白多糖和膠原蛋白的微弱的損失，可以確定蜘蛛酶能夠用於預防和治 療骨關節炎。通過結果可以確定，給予本發明的蜘蛛酶，能夠抑制已經誘導骨關節炎的動物模 型中骨關節炎的進展和緩解疾病的症狀。已證實，攝取蜘蛛酶能抑制炎症誘導因子TNF-α 的表達，阻止蛋白多糖和膠原蛋白從關節軟骨中損失。因此，本發明的蜘蛛酶可用於預防和 治療關節炎，進而抑制骨關節炎的進展和保護骨關節。除了蜘蛛酶以外，本發明預防和治療關節炎的藥物還可以含有一種或多種具有與 蜘蛛酶相同或相似功能的活性成分。對於給藥而言，除活性成分外，還可以通過加入一種或 多種藥用載體來製備藥物製劑。可用的藥用載體包括生理鹽水、無菌水、林格氏液、緩衝鹽 溶液、右旋糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇、及其一種或多種混合物，以及必要時，還可加 入其它常規添加劑，如抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑等。還可通過另外添加稀釋劑、分散劑、表 面活性劑、粘合劑和潤滑劑來製備注射劑，如溶液、懸浮液、乳液等，粉末、片劑、膠囊劑、丸 劑、顆粒劑或注射用液體。此外，可針對每種疾病或根據個體，通過本領域和雷明頓的藥劑 學(Mack Publishing Company,Easton PA, 18th, 1990)中描述的適當方法，優選地以適當的 形式製備組合物。本發明預防和治療關節炎的組合物可以根據所需的方法口服或胃腸外(例如，靜脈、皮下、腹腔或局部注射)給藥。組合物的有效劑量可以根據體重、年齡、性別、健康 狀況、飲食、給藥時間、給藥方法、排洩率和疾病的嚴重程度來確定。蜘蛛酶的劑量為每天 0. 01-5000mg/kg,優選每天0. 01-10mg/kg,每天給藥一次，優選每天給藥數次。本發明還提供一種治療關節炎的方法，包括對罹患關節炎的個體給予藥學上有效 量的蜘蛛酶。本發明進一步提供一種預防關節炎的方法，包括對個體給予藥學上有效量的蜘蛛 酶。可以確定，由於本發明的蜘蛛酶能抑制炎症誘導因子TNF-α的表達和防止關節 軟骨蛋白多糖和膠原蛋白的損失，從而抑制關節炎的進展和保護關節，因此通過給予個體 含有所述蜘蛛酶的組合物，可有益於預防和治療關節炎。除了本發明的蜘蛛酶外，給藥還包括給予與蜘蛛酶相同或相似功能的一種或多種 活性成分。給藥可能通過口服或胃腸外起作用，並可以通常的藥物製劑形式給予。給藥單位可以包含個體劑量的1、2、3或4倍，或者1/2、1/3或1/4倍。個體劑量優 選地包含給藥一次的有效藥物的量，相當於每天常規給藥劑量的1、1/2、1/3或1/4倍。本 發明組合物的有效劑量為0. 01-5000mg/kg，優選0. 01-10mg/kg，優選一天給藥1-6次。本發明提供蜘蛛酶在製備預防和治療關節炎的藥物中的應用。可以確定，由於本發明的蜘蛛酶能抑制炎症誘導因子TNF-α的表達和防止關節 軟骨蛋白多糖和膠原蛋白的損失，從而抑制關節炎的進展和保護關節，因此其可用作預防 和治療關節炎的藥物的活性成分。本發明還提供含有蜘蛛酶作為活性成分的用於預防和改善關節炎的功能保健食
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ΡΠ O此外，本發明提供蜘蛛酶在製備預防和改善關節炎的功能保健食品中的應用。當本發明的Aranicola proteolyticus培養液或從其中分離的蜘蛛酶用作食品 添加劑時，Aranicola proteolyticus培養液或從其中分離的蜘蛛酶可以按照常規方法單 獨或與其它食品成分混合添加。採用上述相同的方式獲得和使用蜘蛛酶。可以根據使用 目的(預防、保健或治療)適當確定活性成分的混合量。一般來說，在製作食品或飲料時， Aranicola proteolyticus培養液或從其中分離的蜘蛛酶優選地以0. 01-10重量份添加， 更優選地，以0. 05-1重量份添加。然而，為了健康和衛生，或為了保持健康長期攝取，用量 可等於或小於上述範圍，但活性成分的用量可以相當於或高於上述範圍，因為就安全問題 而言，上述範圍都是無礙的。對食物的種類沒有特定的限制。可以添加原料的食品示例包括肉類、香腸、麵包、 麵包、巧克力、糖果、點心、甜點、比薩餅、麵條、麵粉製品、果糕、包括冰淇淋的乳製品、湯、飲 料、茶、飲料、酒精飲料和複合維生素等，一般意義的各類保健食品也包括在內。像其它傳統的飲料一樣，本發明組合物的保健飲料還可以包括各種風味調料或天 然的碳水化合物等=。上述天然碳水化合物可以是單糖諸如葡萄糖和果糖，二糖諸如麥芽 糖和蔗糖，多糖諸如糊精和環糊精，以及糖醇諸如木糖醇、山梨醇和赤蘚糖醇。作為甜味劑， 可以使用天然甜味劑如奇異果甜蛋白和甜菊提取物，合成甜味劑如糖精和阿斯巴甜。一般 來說，每100ml本發明的飲料中，天然碳水化合物的含量一般約為0.01-0. 04g，優選地為0. 02-0. 03g。除上述成分外，可向本發明的Aranicola proteolyticus培養液或從其中分離的 蜘蛛酶加入各種營養物質、維生素、礦物質、香料、著色劑、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有 機酸、保護性膠體增粘劑、PH值調節劑、穩定劑、防腐劑、甘油、醇、常被加入到蘇打中的二氧 化碳(carbonators)等。本發明的Aranicola proteolyticus培養液或從其中分離的蜘蛛 酶也可加入天然果汁、水果飲料、和可加入到蔬菜飲料的新鮮果肉。這些成份可以單獨使用 或結合使用。這些成分的混合比例其實並不重要，但以本發明的Aranicola proteolyticus 培養液或從其中分離的蜘蛛酶的重量為100份計，通常選擇按重量計0. 01-0. 1份之間的範 圍。以下將參考下面的實施例、實驗例和製備例具體描述本發明。然而，下面的實施例、實驗例和製備例僅作說明之用，不應以任何方式限制本發明 的範圍。蜘蛛酶的製備為了製備本發明的活性成分蜘蛛酶，在22 °C在培養基中培養Aranicola proteolyticus HY-3 (KCTC 0268BP)(胰蛋白腖0. 5%，酵母提取物 0. 5%，氯化鈉 0. 1%，氯 化鉀0.05%，氯化鈣0.02%，硫酸鎂0.02%) 18小時。通過膜過濾過濾培養液(2 μ m過濾 器，Satorius，美國)從細胞中分離上清液。通過膜過濾(IOkDa的膜過濾器，Pall sept, PALL公司，USA)濃縮該上清液。由於本發明的蜘蛛酶基本上具有負離子特性，因此通過 經50mM tris-HCl緩衝液(pH值7. 6)預處理的使用DEAE-纖維素(美國Sigma公司)的 離子交換樹脂(美國Sigma公司)和經20mM tris-HCl緩衝液(pH值7. 6)預處理的使 用Sephadex G_75(美國Sigma公司)的凝膠過濾交換樹脂來純化濃縮液。純化的酶液 在10% SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠)上電泳，並驗證條帶譜圖。結果，本 發明的蜘蛛酶被鑑定為不含亞單位的單體且在約51. 5kDa處顯示條帶。然而，Aranicola proteolyticus HY-3菌株(KCTC0268BP)可在各種市售培養基中培養，以生產蜘蛛酶，可以 通過各種方法分離和純化其培養液。本發明蜘蛛酶具有如SEQ ID No :1所示的胺基酸序 列，和編碼所述胺基酸序列的如SEQ ID No :2所示的核苷酸序列。實驗動物的安排實驗動物的飼養在本實驗中，本發明人採用紐西蘭白兔(Orient Co.，Ltd.，Seoul, Korea)。購買 時，實驗動物為9周齡，它們的體重範圍為1. 2-1. 5kg。動物15周齡時，開始進行實驗給藥， 它們當時的體重範圍在2. 1-2. 7kg。購買後，目視檢查動物，在動物實驗室適應7天。在適 應期間，觀察一般症狀，只選擇健康的動物進行實驗。這些動物在慶北國立大學獸醫學院病理部的動物實驗室進行適應和飼養，該實驗 室配備自動溫度/溼度調節器，其中溫度為22 士 2°C，相對溼度調節為55 士 10%，光照間隔 設定為12小時(09:00開燈和21:00關燈)。未檢出任何影響實驗的飼養環境變化。在整 個實驗期間，動物實驗室的溫度/溼度由自動溫度/溼度調節器調節，定期檢查(每3個月 1次)環境條件。從環境檢查中，未檢出任何可能影響試驗的變化。在整個實驗期間，一隻 動物安置在地板上一個帶有鋼網的養殖箱中，該養殖箱安裝有光亮的鋁合金和一個可移動 的糞便託盤(寬度480，長度610，高度450mm)。對於個體識別，同時使用油標籤的皮膚
10標記和每隻養殖箱的組區分卡。固體兔飼料(Agribrands Purina Korea, Inc.)自由飼喂， 瓶裝的自來水和測試材料混合的飲用水自由飲用。在實驗動物中誘導關節炎已知，不僅需要誘導重複的關節損傷，而且還需在兔模型中摘除膝半月板誘導與 人退行性關節炎類似的病變。通過撕裂前十字韌帶的方法誘導兔骨關節炎(Hulth A.等， Acta Orthp Scand. 41 :522_530，1970)。在本實驗中，撕裂兔的前十字韌帶以誘導關節不 穩，同時摘除內側半月板以誘導骨關節炎。撕裂所有實驗動物的右膝前十字韌帶以誘導關節不穩，同時摘除內側半月板以 誘導骨關節炎。對左膝進行Sharm-手術，用作給予受試材料的對照。按下述方法撕裂前 十字韌帶和摘除內側半月板。手術前動物禁食6-12小時，只供應飲用水。隨後，肌肉注 射 1. 25ml/6mg/kg 甲苯噻嗪麻醉劑(Rompun，Bayer Korea Ltd.)和 0. 2ml/10mg/kg 舒泰 50(Zoletil 50) (Virbac)以麻醉動物。兔被麻醉後，從兔膝內側撕裂皮膚和肌肉筋膜，由於 斷開了皮膚和膝蓋破裂，因此撕裂暴露的關節囊，部分股骨和脛骨暴露出來。暴露後，切斷 股骨關節面和脛骨關節面之間的前十字韌帶，摘除內側半月板。手術後，縫合撕裂的肌肉筋 膜和皮膚。手術後，按0. lml/10mg/kg注射抗生素慶大黴素(SamU Median Co.，Ltd. )3天， 以防止周圍組織因手術而發生感染。為了有效地誘導骨關節炎，實驗組的所有動物均使用 跑步機經受強迫運動任務，每天5分鐘。實驗動物的組織將實驗組分為3組，每組使用4-5隻體重在2. 1-2. 7kg的實驗動物。陽性對照組 每日供給塞來昔布(輝瑞製藥韓國有限公司)，濃度為每250-300ml自來水10mg/kg/天，試 驗組每天飼餵本發明的組合物，用250-300ml自來水稀釋至250mg/kg。用於陽性對照組的 塞來昔布(輝瑞)是非留體抗炎藥，通常指定給予骨關節炎的患者。與傳統的非留體抗炎 藥相比，雖然用塞來昔布對骨關節炎的患者顯示出較好的治療效果，但其治療骨關節炎，是 由於其較少誘發消化性潰蕩(Loewen PS. focus on clinical aspects. 4 :268_75，2002)。 陰性對照組的所有動物每天供應等體積的250-300ml自來水。每天採用相同的給藥途徑和 給藥方法飼餵所有動物等體積的受試材料和250-300ml自來水。[表 1]試驗組的組織
權利要求
一種預防和治療關節炎的藥物，含有蜘蛛酶(arazyme)作為有效成分。
2.根據權利要求1所述的預防和治療關節炎的藥物，其中所述蜘蛛酶為下述之一(a)具有如SEQID No 1所示的胺基酸序列的蛋白；(b)由含有如SEQID No :2所示的核苷酸序列編碼區的DNA編碼的蛋白；(c)具有如SEQID NO :1所示的胺基酸序列通過替換、缺失、插入和/或添加一個或多 個胺基酸突變得到的胺基酸序列的蛋白，所述蛋白與含有如SEQ ID No :1所示的胺基酸序 列的蛋白具有同等功能；以及(d)由在嚴格條件下與含有SEQID No 2所示核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼的蛋 白，所述蛋白與含有如SEQ ID No :1所示的胺基酸序列的蛋白具有同等功能。
3.根據權利要求1所述的預防和治療關節炎的藥物，其中所述蜘蛛酶分離自 Aranicola proteolyticus 培養液。
4.根據權利要求3所述的預防和治療關節炎的藥物，其中所述Aranicola proteolyticus % Aranicola proteolyticus HY—3 (:KCTC0268BP)。
5.根據權利要求1所述的預防和治療關節炎的藥物，其中所述關節炎為退行性關節炎 (骨關節炎)、類風溼性關節炎、強直性脊柱炎、反應性關節炎、銀屑病關節炎、系統性紅斑 狼瘡、多發性肌炎或風溼性多肌痛。
6.根據權利要求1所述的預防和治療關節炎的藥物，其中所述預防和治療的藥物抑制 TNF-α的表達。
7.根據權利要求1所述的預防和治療關節炎的藥物，其中所述預防和治療的藥物抑制 關節軟骨的損傷。
8.根據權利要求1所述的預防和治療關節炎的藥物，其中所述預防和治療的藥物抑制 蛋白多糖從關節軟骨流失。
9.根據權利要求1所述的預防和治療關節炎的藥物，其中所述預防和治療的藥物抑制 膠原蛋白從關節軟骨流失。
10.一種治療關節炎的方法，包括對需要治療的對象給予藥學上有效量的蜘蛛酶。
11.一種預防關節炎的方法，包括對需要治療的對象給予藥學上有效量的蜘蛛酶。
12.蜘蛛酶在製備預防和治療關節炎的藥物中的應用。
13.一種用於預防和改善關節炎的功能保健食品，含有蜘蛛酶作為有效成分。
14.根據權利要求13所述的用於預防和改善關節炎的功能保健食品，其中所述蜘蛛酶 為下述之一(a)具有如SEQID No 1所示的胺基酸序列的蛋白；(b)由含有如SEQID No :2所示的核苷酸序列編碼區的DNA編碼的蛋白；(c)具有如SEQID NO :1所示的胺基酸序列通過替換、缺失、插入和/或添加一個或多 個胺基酸突變的胺基酸序列的蛋白，所述蛋白與含有如SEQ ID No :1所示的胺基酸序列的 蛋白具有同等功能；以及(d)由在嚴格條件下與含有SEQID No 2所示核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼的蛋 白，所述蛋白與含有如SEQ ID No :1所示的胺基酸序列的蛋白具有同等功能。
15.根據權利要求13所述的用於預防和改善關節炎的功能保健食品，其中所述蜘蛛酶 分離自 Aranicola proteolyticus 培養液。
16.根據權利要求15所述的用於預防和改善關節炎的功能保健食品，其中所述 Aranicola proteolyticus 為 Aranicola proteolyticus HY_3(保藏號KCTC 0268BP)。
17.根據權利要求13所述的用於預防和改善關節炎的功能保健食品，其中所述關節炎 選自下組退行性關節炎(骨關節炎)、類風溼性關節炎、強直性脊柱炎、反應性關節炎、銀 屑病關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性肌炎和風溼性多肌痛。
18.蜘蛛酶在製備預防和改善關節炎的功能保健食品中的應用。
全文摘要
本發明公開一種用於預防和治療關節炎的含有蜘蛛酶(arazyme)作為活性成分的組合物。更具體地，本發明的由Aranicola proteolyticus生產的蜘蛛酶通過抑制炎症誘導因子TNF-α的表達、防止蛋白多糖和膠原蛋白從關節軟骨流失來抑制關節炎的進展和保護關節，可有效用作預防和治療關節炎的組合物。
文檔編號A61K38/20GK101945665SQ200980104926
公開日2011年1月12日 申請日期2009年1月9日 優先權日2008年1月11日
發明者孫光熙, 樸鎬用, 申東夏, 鄭圭植 申請人:金英賽得科技有限公司