一種抗腫瘤生物製品及其製備方法

2023-09-20 16:07:25

專利名稱：一種抗腫瘤生物製品及其製備方法
技術領域：
本發明是涉及生物技術領域，尤其是一種抗腫瘤生物製品及其製備方法。
背景技術：
白細胞介素-2(即白細胞介素-2)是80年代國際上開始研製的生物製品。它是繼傳統治療腫瘤的三大療法(手術、化學、放射療法)之後的第四種療法即生物療法(BRM) 的關鍵藥物。其本身大大劑量可有抗癌活性；用白細胞介素-2在人體外培養人的淋巴細胞，使淋巴細胞具有殺傷腫瘤細胞，而不損傷正常細胞，其殺傷腫瘤細胞能力大為增強的特性，並使淋巴細胞的數量得到大量、快速的增殖(此種經白細胞介素-2激活的淋巴細胞稱之為LAK細胞)。美國癌研究中心Rosenberg. SA用LAK細胞加白細胞介素_2治療晚期惡性腫瘤，獲得8例腫瘤完全消失的顯著效果。但是目前所使用的白細胞介素-2是來自人體的淋巴細胞、人的扁桃腺、人的脾，這些都是從車禍等死者身上及時採取或從活人身上採取，誘導培養白細胞介素-2 (而不用白細胞介素1-7等)，提取工藝複雜，設備昂貴，藥物來源困難，所以價格極高。也有採用基因工程方法，將人的白細胞介素-2基因摻入大腸桿菌中，生產的白細胞介素-2稱之為重組白細胞介素-2 (即白細胞介素- ，其價格也未降下來多少，用Rosenberg. SA的劑量，一人一療程，需1000萬元人民幣，且含有大腸桿菌毒素無法完全消除，人體使用發高燒，有毒素放應。因此，研發一種使用安全，價格低廉、藥源廣泛的細胞因子是現階段亟待解決的技術問題。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在於提供一種抗腫瘤生物製品及其製備方法。為解決上述技術問題，本發明的技術方案是一種抗腫瘤生物製品及其製備方法，是由下述方法得到的取新鮮豬血無菌操作製成細胞懸液，加入雞新城疫病毒或仙臺病毒於RPMI1640 的培養基中、誘導培養72 96小時，收穫上清液，上清液在超濾器中經300Kd超濾膜超濾， 取300Kd超濾膜的膜以下部分，再在超濾器中經5Kd超濾膜超濾，取5Kd超濾膜的膜以上部分，除菌後即為白細胞介素為主的複合細胞因子。上述用於一種抗腫瘤生物製品及其製備方法，具體步驟如下取新鮮豬脾無菌操作製成細胞懸液，加入雞新城疫病毒或仙臺病毒於RPMI1640 的培養基中、誘導培養72 96小時，收穫上清液，上清液在超濾器中經300Kd超濾膜超濾， 取300Kd超濾膜的膜以下部分，再在超濾器中經5Kd超濾膜超濾，取5Kd超濾膜的膜以上部分，除菌後即為白細胞介素為主的複合細胞因子。上述用於一種抗腫瘤生物製品及其製備方法，具體步驟如下(1)取新鮮豬脾放入慶大黴素溶液中浸泡2小時，用研磨器將脾研碎製成細胞懸液；
( 按體積比1 5加入生理鹽水稀釋，將稀釋後細胞懸液經200目細胞篩過濾，將濾液倒入離心管中，1500轉/分離心30分鐘，計數細胞數量，按6X IO6濃度加入到 RPM1640培養基中，按4000單位/ml加入慶大黴素，再加入雞新城疫病毒(NDV)或仙臺病毒各IOml於培養瓶中培養；(3)於37°C，5 7% CO2培養箱中培養48小時，取培養上清液，4000轉/分離心 30分鐘，棄沉渣，取上清，收穫上清液；(4)取步驟C3)所得上清液在超濾器中經300Kd超濾膜超濾，取超濾膜下部分，再在超濾器中經5Kd超濾膜超濾，取超濾膜上部分，即為細胞因子。上述用於一種抗腫瘤生物製品及其製備方法，具體步驟如下(1)取新鮮豬血1500轉/分離心30分鐘，取白細胞懸液加入RPM1640培養基，調節細胞濃度為6X106濃度，再加入雞新城疫病毒或仙臺病毒各IOml於培養瓶中培養；(2)於37°C，5 7% CO2培養箱中培養48小時，取培養上清液，4000轉/分，離心 30分鐘，棄沉渣，取上清，收穫上清液；(3)取步驟( 所得上清液在超濾器中經300Kd超濾膜超濾，取超濾膜下部分，再在超濾器中經5Kd超濾膜超濾，取超濾膜上部分，即為細胞因子。本發明的有益效果是上述用於一種抗腫瘤生物製品及其製備方法採取1萬至300Kd的低分子量蛋白質，取得包括白細胞介素-1至白細胞介素-7及幹擾素等多種因子(這些因子分子量均在1 萬至5萬分子量之間)的細胞因子，幾種細胞因子的共同作用，增強抗腫瘤作用的效果，其療效高，使用安全，價格低廉、藥源廣泛；以豬血和豬脾製取白細胞介素(白細胞介素)為主的抗腫瘤生物製品的生產方法，製備方法簡單，適合大規模工業化生產的需要。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明所述技術方案作進一步的說明。實施例1 一種抗腫瘤生物製品及其製備方法製備過程如下經檢疫新鮮的豬脾800g，立即放入慶大黴素溶液浸泡2小時；在超淨臺中無菌操作，用研磨器將脾研碎製成細胞懸液。按1 5比例加生理鹽水稀釋。200目細胞篩過濾， 沿管壁將濾液小心倒入離心管中，1500轉/分離心30分鐘，計數細胞數量，按7 X IO6濃度加入RPM1640培養基。按5000單位/ml加入抗菌素，再加入雞新城疫病毒5細1。培養瓶中培養，5 % C02，37°C，CO2培養箱中培養58小時。取培養上清，4000轉/分，離心30分鐘，棄沉渣，取上清，獲500ml上清液。上清液在超濾器中經分子量300Kd超濾膜超濾，取300Kd超濾膜的膜以下部分，再經5Kd超濾膜超濾，取5Kd超濾膜的膜以上部分，得35ml濃縮液。用分光光度計檢測，取蛋白質部分，得400ml白細胞介素-2細胞因子，CTLL細胞MTT法測白細胞介素-2活性為 4500u/ml，除菌分裝低溫保存。臨床治療腫瘤效果見下表抗腫瘤生物製品治療腫瘤的療效(％ )
權利要求
1.一種抗腫瘤生物製品及其製備方法，其特徵在於取新鮮豬血、豬脾，無菌操作製成細胞懸液；經分離淋巴細胞，加RPMI1640的培養基、接種雞新城疫病毒或仙臺病毒，誘導培養72 96小時，收集誘導培養液經超濾純化，除菌製成細胞因子。
2.根據權利要求1所述的一種抗腫瘤生物製品及其製備方法，其特徵在於經檢疫新鮮的豬脾600g，立即放入抗菌素溶液浸泡2小時；在超淨臺中無菌操作，用研磨器將脾研碎製成細胞懸液，按1 5比例加生理鹽水稀釋，200目細胞篩過濾，沿管壁將濾液小心倒入離心管中，1500轉/分離心30分鐘，計數細胞數量，按6 X IO6濃度加入RPM1640培養基，按4000 單位/ml加入抗菌素，再加入雞新城疫病毒(NDV)或仙臺病毒。培養瓶中培養，5 7% CO2, 37°C，CO2培養箱中培養48小時，取培養上清液，4000轉/分，離心30分鐘，棄沉渣，取上清， 獲400ml上清液。
3.根據權利要求1所述的一種抗腫瘤生物製品及其製備方法，其特徵在於經檢疫新鮮的豬血800ml，在超淨臺中無菌操作，1500轉/分離心30分鐘，取白細胞懸液加入RPM1640 培養基，調節細胞濃度為6 X IO6濃度，再加入雞新城疫病毒(NDV)或仙臺病毒，培養瓶中培養，5 7% CO2, 37°C，(X)2培養箱中培養48小時，取培養上清液，4000轉/分，離心30分鐘， 棄沉渣，取上清，獲上清液900ml。
4.根據權利要求1所述的一種抗腫瘤生物製品及其製備方法，其特徵在於上述上清液在超濾器中經300Kd超濾膜超濾，取300Kd超濾膜的膜以下部分，再在超濾器中經5Kd超濾膜超濾，取5Kd超濾膜的膜以上部分，即為白細胞介素為主的複合細胞因子。
全文摘要
本發明提供了一種抗腫瘤生物製品及其製備方法，採用了豬血和豬脾取代人的血和脾等淋巴組織，通過分離淋巴細胞，再用雞新城疫病毒或仙臺病毒誘導培養，經過純化除菌等方法製成抗腫瘤細胞因子。本發明的複合細胞因子能夠通過改變淋巴因子誘導細胞毒細胞作用，使其具有強大的抗腫瘤作用。
文檔編號A61K38/20GK102488891SQ20111042012
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月15日 優先權日2011年12月15日
發明者張偉, 王國新, 王智佳, 趙鋼 申請人:天津濟命生生物科技有限公司