磁分離直接化學發光試劑及用該試劑的測試方法
2023-09-20 10:03:30 1
專利名稱：磁分離直接化學發光試劑及用該試劑的測試方法
技術領域：
本發明涉及一種磁分離直接化學發光試劑及採用該試劑的測試方法，特別是採用異魯米諾衍生物分作為標記物、納米磁性微珠作為分離材料的試劑。
背景技術：
現代臨床醫學技術的飛速發展，要求對越來越多人血或尿液中的微量活性物質進行精確定量測定，為臨床醫生診斷疾病，制定有效的治療方案，治療效果評價提供準確的依據，目前，實現人血清或尿液中微量活性物質精確定量分析的方法主要有放射免疫分析方法、酶免疫分析方法、酶促化學發光或吖啶酯標記的直接化學發光方法及三聯吡啶釕標記的電化學發光方法。
放射免疫分析法是採用放射性同位素I125作為示蹤劑，標記在抗原或相應抗體上，在γ射線探測儀上，通過對I125放射線強度的測定，來確定待測物質的含量，這種方法雖然較好地解決了微量活性物質的定量分析目的，但其存在的缺陷是很明顯的放射性同位素I125作為示蹤技術，在試劑的製造、貯存、應用操作過程中，對環境帶來汙染，給人體造成了嚴重的傷害；同時，由於I125半衰期的限制，決定了放射免疫分析試劑的有效期只有一個月；放免試劑的有效期也只有一個月；分離過程的非特異性導致結果的準確率差，還不能做急診標本。
酶免疫分析方法是採用HRP辣根過氧化物酶作為發光標記物，塑料微孔板作為載體和分離技術，OPD鄰苯二胺等作為顯色底物，1MH2SO4作為酶顯色反應的終止溶液，通過測定酶反應產物波長在492nm處的吸光度值來分析待測物質的濃度，這種方法主要用來進行大批量人血清標本的定性篩查，其缺陷是顯色產物的顏色強度隨時間的變化而變化，不能固定不變，顯色底物OPD等是強致癌物，同時對相當一部分微量激素的靈敏度不夠，反應時間太長，操作過程中難以規範化。
酶促化學發光免疫分析方法是採用鹼性磷酸酶AKP或辣根酶HRP作為標記物，用AMPPD(金剛烷)或魯米諾、H2O2作為發光底物；其優點是待測物轉變成可測定的光信號，顯著提高了分析的靈敏度，其缺點是影響酶活性的諸多因素，如環境溫度、溫育溫度和時間、保存條件等有將直接影響測定結果，試劑的穩定性不好；同時，該方法發光反應啟動緩慢，需要在37℃溫育一定的時間才能達到發光平臺，會更強地影響發光測定的結果。
另外，吖啶酯標記的直接化學發光方法、三聯吡啶釕標記的電化學發光方法等在分析過程中帶來試劑不穩定、分析結果準確率不高和測試速度不夠快等缺陷，給準確分析微量活性物質的量帶來了阻礙。
發明內容
本發明的目的在於針對上述現有技術中的不足之處，提供一種磁分離直接化學發光的試劑，特別是採用異魯米諾衍生物作標記物、納米磁珠作為分離材料的磁化學直接發光試劑。
本發明另一目的是用上述磁分離直接化學發光試劑的測試方法。
為實現上述目的，本發明是採用以下技術方案實現的所述的磁分離直接化學發光試劑包括發光標記物、分離試劑、FITC-抗體聯繫物和標準抗原或抗體，其中，發光標記物是異魯米諾衍生物，所述的異魯米諾衍生物結構式是
其中R1是C2H5、C3H7或C4H9，R2是NH2-(CH2)4、NH2-(CH2)6、NH2-(CH2)8或NH2-(CH2)10，優選ABEI和AHEI，其結構式中R1是C2H5，R2是NH2-(CH2)4或NH2-(CH2)6；所述的分離試劑是羊抗FITC包被的納米磁性微珠所述的納米磁性微珠，其是裡面包覆有Fe3O4或Fe2O3，外面含有-OH，-COOH，-NH2活性基團的微珠，優選-COOH和-NH2，其活性基團的含量是0.05-0.5eqm/g；所述的羊抗FITC包被的納米磁性微珠是在單抗或抗原上標記。
本發明採用的以下步驟進行分析測試的A、將分別標記有異魯米諾衍生物、FITC的單克隆抗體和待測血清混勻溫育；B、待免疫反應完成後，再加入羊抗包被FITC多克隆抗體的免疫納米磁性微珠；C、在外加磁場的作用下，將抗原-抗體複合物特異性分離，用洗液清洗後將底部試管放入測量室內；D、用自動注射泵泵入激發底物NaOH和H2O2；E、用光電倍增管計數試管內混合產物發出的光子數量，用分析儀分析得出待測物的結果。
本發明中，所述異魯米諾衍生物發光標記物的單克隆抗體是通過將異魯米諾衍生物發光標記物與二氯硫化碳或N-羥基琥珀酸聯接後，再與單克隆抗體聯接而得，所述的C步驟中，試管底部是以納米磁性微珠為載體。
所述的磁分離直接化學發光免疫分析測試方法可分為夾心法和競爭法，其設計式分別見圖1和圖2，在圖中Ab1*和Ag*分別表示在Ab1和Ag上標記異魯米諾衍生物ABEI或AHEI，Ab2FITC和AbFITC分別表示在Ab2和Ab上標記FITC小分子，FITC為異硫氰酸螢光磺， 表示在納米磁珠表面聯接抗FITC抗體。
根據本發明所述的磁分離直接化學發光分析方法，其技術效果有以下幾方面1、採用異魯米諾衍生物作為發光標記物，徹底克服了傳統的吖啶酯的容易水解的缺陷，作為直接化學發光模式，不但分析速度快，接近全自動直接化學發光的180個測試/小時，完全避免了酶促發光的酶活性易下降的缺陷；2、採用納米免疫磁性微珠作為抗體的載體和抗原-抗體免疫複合物的分離試劑，大大縮短免疫反應的時間，其中分離免疫反應時間僅需5分鐘，整個免疫反應時間僅需20分鐘，且測試結果的高準確率、高精密度；3、FITC和羊抗FITC抗體包被納米磁珠的橋聯抗體免疫設計技術，大大簡化了整個試劑系統的免疫學設計，在納米磁珠表面強大蛋白吸附容量特性支持下，使得納米免疫磁性微珠成為所有測試項目的公用試劑，簡化了生產程序。
圖1是磁分離直接化學發光免疫夾心法設計圖；圖2是磁分離直接化學發光免疫競爭法設計圖具體實施方式
本發明是採用人工合成異魯米諾衍生物作為發光標記物，直接標記在抗原或抗體上，通過CSCl2活化異魯米諾苯環側鏈上的NH2，形成異硫氰酸酯衍生物，通過其中的-N＝C＝S鍵直接與抗原或抗體上胺基聯接，分離純化，去除未連結的異魯米諾-N＝C＝S，異魯米諾的化學發光反應是在金屬Mn2+、Fe2+、ClO-等存在下，激發試劑NaOH造成的鹼性環境，通過異魯米諾衍生物與激發試劑H2O2的氧化反應，產生波長為400-600nm的可見光，構成一個典型的直接化學發光反應。
本發明中，納米磁性微珠表面基團的測定，是將磁珠分散在10-2M Nacl溶液中，採用電位滴定法來測量磁珠表面的-COOH或-NH2含量，滴定液用5×10-3M NaOH溶液，採用雙平行線法求得滴定終點，計算出每克磁珠的表面羧基、胺基或羥基含量為0.05-0.5eqm/g。
本發明中分析測試方法所用的分析儀，包括電源電路、自動注射泵1和2、測量室、發光室、光電倍增管計數器和輸出系統，同時還配置有計算機與中文界面的Windows控制軟體，可進行資料錄入、結果匯總、質量控制、結果儲存和結果查訊等功能，可完成多種分析模式的編程，定量或定性報告結果，自動生成並儲存、更新功能，兩點自動修正標準曲線。
實施例11、異魯米諾衍生物標記的單克隆抗體的製備取3.2mmolABEI三個試管，分別溶於0.2ml二次水中，3.5mmolCSCl2溶於0.3mlDMF中，二者混合均勻，室溫反應2h，分別取10mganti-CEA-α、anti-AFP-α和10mg anti-PSA-α單克隆抗體，用PH9.5碳酸鹽緩衝液調體積到1ml，加入上述活化的ABEI溶液，混勻後，室溫反應20h，過G-25凝膠柱純化；
2、FITC標記CEA、AFP、PSA單克隆抗體取10mg抗CEA-β、AFP-β和PSA-β單克隆抗體，用PH9.5碳緩調體積到1ml，加入FITC100ug，置室溫反應20小時，過G-25凝膠柱純化；3、納米磁性微珠表面包被羊抗FITC多克隆抗體的製備納米磁性微珠的製備是按中國專利製備，專利號為CN92105584.6，磁珠的表面為含有-NH2的基團，其含量是0.17eq/g；取10ml磁珠，濃度為30mg/ml，用P7.4的PBS0.01M清洗二遍，最後懸浮在10ml0.01MPH7.4的PBS中，加50％戊二醛溶液10-100μl，使戊二醛終濃度為0.01-0.5％，加入純化的羊抗FITC IgG抗體100μg-1000μg，37℃反應2小時，在磁鐵上去上清，用含0.01-1％BSA的0.01MPH7.4的PBS清洗三遍，最後懸浮在該溶液中，加入0.01-0.5％的NaN34、磁分離直接化學發光試劑製備及結果分析取CEA、AFP和PSA標準品，血清標本各20μl，加入發光標記物單克隆抗體的ABEI和FITC單克隆抗體各40μl，混勻後在37℃的溫度下溫育，水浴15分鐘；待免疫反應發生後加入表面包被羊抗FITC多克隆抗體的免疫納米磁珠分離試劑40μl，混勻，水浴5分鐘，在外加磁場的作用下，上分離器分離4分鐘，倒去上清；再加應用洗液400μl，混勻，分離4分鐘，倒去上清；重複上述步驟分離一次後，直接將試管放入分析儀的測量室，自動泵泵入激發底物NaOH和H2O2發生直接發光反應，同時用光電倍增管計量光子數量，分析儀分析並列印出結果。
選擇20份臨床標本，按上述實驗過程進行分析測試，本實例中，原發性早期肝癌2例，肝癌切除術病人2例，直腸癌3例，前列腺類1例，前列腺肥大1例，正常人11例，其結果列於表1中。
表1
4#和6#病人為原發性早期肝癌病人，AFP值持續長時間增高，11#和14#為肝癌切除術並處於放療和化療中的病人，其血清中AFP濃度已經下降，但仍沒有降至正常值範圍，提示療效不明顯，仍有轉惡的可能；2#、8#和6#病人的AFP值也超過正常值，但臨床診斷是直腸癌，其CEA值明顯增高，尤其是16#，CEA更高達1270mIU/ml，這可能說明不同腫瘤標誌物間存在某種聯繫或交叉，1#和8#病人分別為前列腺類和單純前列腺肥大，其PSA測定值輕微升高。
從表1的數據分析來看，用本明所述的磁發光免疫分析測試方法所得出的結果有很好的臨床相符性。
實施例2異魯米諾衍生物單克隆抗體的製備和納米磁性微珠表面包被羊抗FITC多克隆抗體的製備方法與實施例1相同，本實施例所用的發光標記物是AHEI，磁珠的表面為含有-COOH的基團，其含量是0.3eq/g；分別取TSH、T3、T4、FT3和FT4標準品，血清標本各20μl，分別加入發光標記物單克隆抗體的AHEI和FITC單克隆抗體各40μl，混勻後在37℃的溫度下溫育，水浴15分鐘；待免疫反應發生後加入表面包被羊抗FITC多克隆抗體的免疫納米磁珠分離試劑40μl，混勻，水浴5分鐘，在外加磁場的作用下，上分離器分離4分鐘，倒去上清；再加洗液400μl，混勻，分離4分鐘，倒去上清；重複上述步驟分離一次後，直接將試管放入分析儀的測量室，自動泵泵入激發底物NaOH和H2O2發生直接發光反應，同時用光電倍增管計量光子數量，分析儀分析並列印出結果。
選擇261例臨床標本，其中臨床確診甲減37例，初診甲亢50例，隨診甲亢26例，治癒甲亢6例，甲狀腺瘤13例，甲狀腺腫5例，正常人對照120例，年齡18-68歲，男45例，凡研究對象靜脈採血，分離血清，-20℃貯存，一周內完成檢測，測試的結果經統列於表2中
表2從表2中列出的五項激素的測定結果顯示甲減37例病人，TDH值均明顯增高，T3、T4、T3、T4、FT3、FT4、均明顯降低，符合臨床診斷。對初診50例甲亢病人，TSH明顯降低，T3、T4、FT3、FT4明顯增高，對治療中的26例甲亢病人的五項激測定統計分析表明，T4值全部趨於恢復或接近正常值，T3則下降速度明顯慢於T4值，用本明所述的磁發光免疫分析測試方法所得出的結果有很好的臨床相符性。
本發明實施例子所述試劑的測試項目以甲狀腺激素和腫瘤標誌物的測定為例，但本發明並不限於測試這兩種項目。
權利要求
1.磁分離直接化學發光試劑，包括發光標記物、分離試劑、FITC-抗體聯繫物、標準抗原或抗體和激發底物，其特徵在於所述的發光標記物是異魯米諾衍生物，所述的異魯米諾衍生物的結構式是 其中R1是C2H5、C3H7或C4H9，R2是NH2-(CH2)4、NH2-(CH2)6、NH2-(CH2)8或NH2-(CH2)10。
2.根據權利要求1所述的磁分離直接化學發光試劑，其特徵在於所述的分離試劑是羊抗FITC包被的納米磁性微珠，所述的納米磁性微珠是裡面包覆有Fe3O4或Fe2O3，外面含有-OH、-COOH或-NH2活性基團的微珠。
3.根據權利要求1所述的磁分離直接化學發光試劑，其特徵在於所述的羊抗FITC包被的納米磁性微珠是在單抗或抗原上標記。
4.根據權利要求2或3所述的磁分離直接化學發光試劑，其特徵在於所述的激發底物是NaOH和H2O2。
5.根據權利要求4所述的磁分離直接化學發光試劑，其特徵在於所述的異魯米諾發光標記物是ABEI和AHEI，其結構式中R1是C2H5，R2是NH2-(CH2)4或NH2-(CH2)6。
6.根據權利要求5所述的磁分離直接化學發光試劑，其特徵在於所述的納米免疫磁性微珠表面含有基團是-COOH或-NH2。
7.根據權利要求6所述的磁分離直接化學發光試劑，其特徵在於所述的納米免疫磁性微珠表面含有基團的含量是0.05-0.5eqm/g。
8.採用上述磁分離直接化學發光試劑的測試方法，其包括以下步驟A、將分別標記有異魯米諾衍生物、FITC的單克隆抗體和待測血清混勻溫育；B、待免疫反應完成後，再加入包被羊抗FITC多克隆抗體的免疫納米磁性微珠；C、在外加磁場的作用下，將抗原-抗體免疫複合物特異性分離，用洗液清洗後，將試管放入分析儀的測量室內；D、用自動注射泵泵入激發底物NaOH和H2O2；E、用光電倍增管計數試管內混合產物發出的光子數量，分析儀分析得出待測物的濃度。
9.根據權利要求8所述的磁分離直接化學發光分析測試方法，其特徵在於異魯米諾發光標記物的單克隆抗體是通過將異魯米諾發光標記物與二氯硫化碳或N-羥基琥珀酸聯接後，再與單克隆抗體聯接而得。
10.根據權利要求8所述的磁分離直接化學發光分析測試方法，其特徵在於所述C步驟中，試管底部是以納米磁性微珠為載體。
全文摘要
本發明涉及一種磁分離直接化學發光試劑及其測試方法，主要是採用異魯米諾衍生物作為發光標記物，羊抗FITC多克隆抗體包被的免疫納米磁性微珠作為分離試劑，用NaOH和H
文檔編號C07D237/32GK1888901SQ200610060448
公開日2007年1月3日 申請日期2006年4月21日 優先權日2006年4月21日
發明者饒微, 宋洪濤, 李婷華, 邵佳, 閻穎, 王麗蓉, 黃國光, 劉海燕 申請人:深圳市新產業生物醫學工程有限公司