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甘氨酸的測定方法與甘氨酸測定試劑盒-9057的製作方法

2023-09-20 10:14:00 1

專利名稱:甘氨酸的測定方法與甘氨酸測定試劑盒-9057的製作方法
甘氨酸的測定方法與甘氨酸測定試劑盒-905技術領域:
本發明涉及食品檢驗測定技術領域,更具體地,本發明涉及甘氨酸測定方法及其試齊U盒。
背景技術:
甘氨酸為非人體必需胺基酸。甘氨酸有獨特的甜味,能緩和酸、鹼味,掩蓋食品中添加糖精的苦味並增強甜味。人體若攝入甘氨酸的量過多,不僅不能被人體吸收利用,而且會打破人體對胺基酸的吸收平衡而影響其它胺基酸的吸收,導致營養失衡而影響健康。甘氨酸不能被人體利用,只能分解轉化為熱能,這樣會增加肝臟負擔。而分解產物中的含氮化合物要通過尿液排出體外,又會增加腎臟負擔。如果大量、長期食用這類食品,可能造成肝腎損傷。部分含乳飲料企業為提高產品中蛋白質含量,在生產加工中違規使用甘氨酸,對青少年及兒童的正常生長發育很容易帶來不利影響。按照我國《食品添加劑使用衛生標準》GB2760規定,甘氨酸在作為食品添加劑只允許在調味劑與豆奶中使用,且最高限量為每公斤1克,但在含乳飲料中不允許使用。

發明內容[要解決的技術問題]本發明的目的是提供一種甘氨酸的測定方法。本發明的另一個目的是提供一種甘氨酸測定試劑盒。[技術方案]本發明是通過下述技術方案實現的。本發明的方法是一種採用間接酶循環擴增法(Indirect Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)與酶(偶)聯法(Couple Reaction) 的聯用技術,利用測定還原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處的吸光度變化測定甘氨酸的方法。本發明甘氨酸測定方法的的技術原理是根據下述氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶 (EC 1. 2. 2. 2)、丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 1. 51)的系列催化反應完成 甘氨酸+2輔酶氰化氫合成酶氰化氫+ 二氧化碳+2還原型輔酶二氧化碳+乙酸+亞鐵細胞色素bl丙酮酸脫氫酶丙酮酸+高鐵細胞色素bl+水丙酮酸+輔酶A+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+乙醯輔酶A+還原型輔酶本發明的方法利用氰化氫合成酶(hydrogen cyanide synthase ;EC 1.4.99.5) 酶(偶)聯丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase ;EC 1. 2. 2. 2)、另一種丙酮酸脫氫酶 (pyruvate dehydrogenase ;EC 1. 2. 1. 51)酶促反應連續監測法。氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶(EC 1.2.2.2)作為作用酶,氰化氫合成酶功能為將甘氨酸酶解產生二氧化碳,丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 2. 2)的酶促作用使二氧化碳產生丙酮酸;丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 1. 51) 作為循環酶丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 1. 51)再將丙酮酸再次變回二氧化碳,使二氧化碳不斷地被重複循環利用。丙酮酸脫氫酶(EC 1.2. 1.51)又作為顯色酶,將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰),從而得以測定還原型輔酶在 340nm處吸光度上升的速度,這樣可以通過測量340nm處吸光度上升的速度,可以測算甘氨酸的濃度大小。本發明是通過下述技術方案實現的。本發明涉及一種甘氨酸的測定方法。該甘氨酸測定方法的步驟如下A、樣品準備A. 1標準樣品的製備將一定量的甘氨酸溶於水或緩衝液中,再將甘氨酸濃度調整到1毫摩爾/升,得到的溶液作為標準樣品;A. 2待測樣品的製備待測液體樣品直接測試,無須預處理;將一定量的待測固體樣品像製備標準樣品一樣溶於水或緩衝液中;A. 3空白樣品所述的水或緩衝液作為空白樣品,其甘氨酸濃度為0毫摩爾/升;B、試劑溶液的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶 (EC1. 2. 2. 2)、丙酮酸脫氫酶(EC 1.2. 1. 51)、乙酸、亞鐵細胞色素bl與輔酶A,然後將它們混合均勻,用水溶解得到所述的試劑溶液,它們的濃度分別是20-500mmo 1 /L、 0.001-7mol/L、0. l_5mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、I-IOOmmol/ LU-lOOmmol/L 與 l-lOOmmol/L ;C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合,在溫度15-45°C下反應5-60分鐘,在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設副波長)下進行測定,測定其吸光度隨時間的變化;D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標準樣品的吸光度隨時間的變化;E、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時間的變化;F、數據處理由步驟C-E)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化,根據下式計算得到
甘氨酸的含量
權利要求
1.一種利用酶循環擴增法、酶比色法及酶聯法技術的甘氨酸濃度測定方法,其測定的技術原理是根據下述氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶(EC 1.2. 2. 2)、丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 1. 51)的系列催化反應完成甘氨酸+2輔酶氰化氫合成酶氰化氫+ 二氧化碳+2還原型輔酶二氧化碳+乙酸+亞鐵細胞色素bl丙酮酸脫氫酶丙酮酸+高鐵細胞色素bl+水丙酮酸+輔酶A+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+乙醯輔酶A+還原型輔酶。
2.一種甘氨酸的測定方法,其特徵在於該方法的步驟如下 2. 1樣品準備2. 1.1標準樣品的製備將一定量的甘氨酸溶於水或緩衝液中,再將其濃度調整到1毫摩爾/升; 2. 1.2待測樣品的製備待測液體樣品直接測試,無須預處理;將一定量的待測固體樣品像製備標準樣品一樣溶於水或緩衝液中; 2. 1.3空白樣品所述的水或緩衝液作為空白樣品,其甘氨酸濃度為0毫摩爾/升; 2. 2試劑溶液的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶(EC1. 2. 2. 2)、丙酮酸脫氫酶(EC 1.2. 1.51)、乙酸、亞鐵細胞色素bl與輔酶A,然後將它們混合均勻,用水溶解得到所述的試劑溶液,它們的濃度分別是20-500mmol/L、0. 001-7mol/L、0. l-5mmol/ L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-100mmol/L ;2. 3待測樣品與在步驟2. 2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合,在溫度15-45°C下反應5-60分鐘,在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制,可以不設副波長)下進行測定,測定其吸光度隨時間的變化;2. 4在與步驟2. 3)同樣的條件下測定步驟2. 1. 1)標準樣品的吸光度隨時間的變化; 2. 5在與步驟2. 3)同樣的條件下測定在步驟2. 1. 3)使用的水或緩衝液作為空白溶液的吸光度隨時間的變化;2.6數據處理由步驟2. 3-2. 5)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化,根據下式計算得到甘氨酸的含量
3.根據權利要求1、2所述的測定方法,其特徵在於使用全自動生化分析儀測定時,待測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下自動取樣,然後在下述條件下進行測定測定方法為速率法,溫度37°C,反應時間10分鐘,測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測甘氨酸樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500,反應方向為正反應,延遲時間1/0分鐘,檢測時間4/5分鐘。
4.根據權利要求1、2或3所述的測定方法,其特徵在於,所述的穩定劑是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩定劑;所述的緩衝液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、咪唑-鹽酸緩衝液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液、硼砂-鹽酸緩衝液、巴比妥鈉-鹽酸緩衝液、硼酸-硼砂緩衝液、二乙醇胺緩衝液或「PBS」緩衝液的緩衝液;所述的輔酶是一種或多種選自NADP+、 NAD+ 或 thio-NAD+ 的輔酶。
5.根據權利要求1、2或3所述的測定方法,其特徵在於 5. 1所述的試劑溶液配製成如下單劑試劑它是由所述的緩衝液、穩定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A、氰化氫合成酶、 丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 2. 2)與丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 1. 51)組成的; 5. 2所述的試劑溶液配製成如下雙劑試劑試劑1,它是由所述的緩衝液、穩定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl與輔酶A組成的; 試劑2,它是由所述的緩衝液、穩定劑、氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶(EC 1.2.2.2)與丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 1. 51)組成的;其中輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 2. 2)、丙酮酸脫氫酶(EC1. 2. 1. 51)、 乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置是不限定的。5.3所述的試劑配製成如下三劑試劑試劑1,它是由所述的緩衝液、穩定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl與輔酶A組成的; 試劑2,它是由所述的緩衝液、穩定劑、丙酮酸脫氫酶(EC 1.2.2.2)與丙酮酸脫氫酶 (EC 1. 2. 1. 51)組成的;試劑3,它是由所述的緩衝液、穩定劑與氰化氫合成酶組成的; 其中輔酶、氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 2. 2)、丙酮酸脫氫酶(EC1. 2. 1. 51)、 乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。
6.一種甘氨酸測定試劑盒,其特徵在於6. 1它由下述粉狀試劑組成,在使用時用水將它們溶解得到具有下述濃度範圍的可直接使用的液體試劑緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L輔酶0. l-5mmol/L氰化氫合成酶1000-80000U/L丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 2. 2) 1000-80000U/L 丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 1. 51) 1000-80000U/L乙酸l-100mmol/L亞鐵細胞色素bll-100mmol/L輔酶 Al-100mmol/Lo6. 2根據權利要求6. 1所述的甘氨酸測定試劑盒,其特徵在於它有組成如下的試劑1 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L輔酶0.l-5mmol/L乙酸l-100mmol/L亞鐵細胞色素bll-100mmol/L輔酶Al-100mmol/L組成如下的試劑2 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L氰化氫合成酶1000-80000U,丙酮酸脫氫酶(EC 1.2. 2. 2)1000-80000U/丙酮酸脫氫酶(EC 1.2. 1. 51)1000-80000U/6. 3根據權利要求6. 1所述的甘氨酸測定試劑盒,其特徵在於它有組成如下的試劑1 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L輔酶0.l-5mmol/L乙酸l-100mmol/L亞鐵細胞色素bll-100mmol/L輔酶Al-100mmol/L組成如下的試劑2 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L丙酮酸脫氫酶(EC 1.2. 2. 2) 1000-80000U/丙酮酸脫氫酶(EC 1.2. 1. 51) 1000-80000U/組成如下的試劑3 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L氰化氫合成酶1000-80000U/L。
全文摘要
本發明涉及利用酶循環擴增法、酶比色法及酶聯法技術的甘氨酸含量的測定方法、試劑的組成及成分,其測定的技術原理是依據氰化氫合成酶、丙酮酸脫氫酶(EC 1.2.2.2)、丙酮酸脫氫酶(EC 1.2.1.51)的系列催化反應完成,本發明還涉及一種甘氨酸測定試劑盒。本發明的測定方法靈敏度高、誤差小,因此本發明的測定方法與試劑盒可以廣泛地應用於食品檢驗。
文檔編號G01N33/68GK102298049SQ201010215540
公開日2011年12月28日 申請日期2010年6月25日 優先權日2010年6月25日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司

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