一種生物學控制方法
2023-09-20 07:41:00
專利名稱：一種生物學控制方法
技術領域：
本發明涉及一種生物學控制方法，這種方法使用螺旋藻(Spirulina)粉末作為控制劑或抑制劑來控制和抑制真菌感染或傳染。本發明進一步涉及生物和動物的生物學控制方法，更具體地說，就是使用經過處理的螺旋藻粉末作為控制劑或抑制劑來抑制害蟲及其相關疾病的生物學控制方法。
背景技術：
依據國際食品和藥物標準，螺旋藻作為一種蛋白來源被批准用於人類和動物的食用。螺旋藻還含有多種類胡蘿蔔素、維生素和礦物質(HayashiHayashi，「Calcium Spirulan，來源於藍綠藻中的盤狀螺旋藻，是一種阻礙有被膜病毒複製的抑制劑」。J.Nat Prod.(1996)59，p.83)。
正如從上述文章和美國專利No.5585354(Hayashi等)所見到的，螺旋藻還具有抗病毒能力。經過熱水處理的螺旋藻提取物已被公開，其中的一種多糖鈣已被提純。純化的提取物治療病毒性疾病有效。
美國專利No.4845085(sesin)揭示了一種來源於Nostoc Sp.的半合成混合物具有抗真菌能力。然而這種混合物至多只顯示出抗絲狀真菌的能力。來源於螺旋藻類的次級代謝產物還被用作防汙濁劑(DE19646324(摘要))。
此外，據報導螺旋藻還具有以下一些生物學活性，如降低血糖(糖尿病)；降低血膽固醇和其它一些作用(Hayashi等)。螺旋藻其它的生物學活性已經被公開，例如Amirani的文章(化學文摘91169142n)；美國專利No 4886756(Kawamura)公開了來源於螺旋藻的一種限制性內切酶；J6303391(摘要)公開了一種方法，這種方法利用螺旋藻製備具有生理活性的物質。
現在已知，可以應用某種製劑來阻礙競爭性生物(害蟲或汙染物)的生長和建立，或者促進伴生生物的生長。
然而，現在還沒有控制和抑制競爭性生物的生物學控制方法，由此可以通過外源因素在不改變螺旋藻基因型的情況下，維持螺旋藻和伴生生物之間的共生關係。
本發明人沒有看到任何報導說螺旋藻是特異性的抗真菌劑(或殺真菌劑)，也沒有看到任何報導說螺旋藻可以作為農業和園藝中害蟲的生物控制劑。
本發明的目的是使用經過處理的螺旋藻混合物來填補此項空白。本發明的進一步目的是提供改進的生物學控制方法，由此可以通過不使用可見光來調控螺旋藻的活力。
發明概述本發明提供了一種生物學控制方法，這種方法與伴生生物(一種與抗真菌劑存在共生關係的夥伴)協同控制和抑制真菌汙染的生長和影響，此方法中抗真菌劑是經過處理的螺旋藻混合物，該方法包括以下步驟經過處理的螺旋藻混合物的製備；把所述混合物應用到以下被選擇的作用部位或其附近園藝產品、蘑菇菌種、農業產品及其組合，其中所述製備方法包括以下步驟乾燥的螺旋藻再次水化，給予培養物以應激刺激；並通過冷凍乾燥將螺旋藻製成粉末。
優選地，本方法進一步包括了控制螺旋藻混合物活力的方法，此方法使用可見光，其中螺旋藻混合物被製成液體培養物噴霧劑來應用。
更具優勢的是，本混合物葉綠素綠顏色的深淺可以作為專利藥製備物保存期長短的一種指標。
本發明還提供了一種抑制或驅除害蟲的生物學控制方法，其中使用的殺蟲劑是經過處理的螺旋藻混合物，此方法包括以下步驟經過處理的螺旋藻混合物的製備；把本混合物應用到以下被選擇的作用部位或其附近，這些作用部位包括欲被抑制，驅除或控制的含有害蟲的液體；害蟲出沒地的食餌存放處或其附近；已知的害蟲飛行路徑上；其中所述製備方法包括以下步驟乾燥的螺旋藻再次水化，給予培養物以應激刺激，通過冷凍乾燥將螺旋藻製成粉末。
甲殼蟲和昆蟲是優選的害蟲，更具體地說，在農業、園藝和醫藥領域中昆蟲被認為是害蟲。也優選誘餌存放處包含害蟲誘惑劑。
實施本發明的最佳方案單就實例而言，本發明的優選實施方案將參考一系列實例進行詳述，它們僅為例證。
在進行優選實施方案的描述中，真菌汙染、伴生生物和製劑的含義如下真菌汙染-分別產生分生孢子(conidia)或子囊(asci)的半知菌(Deutermycota)和子囊菌(Ascomycota)。
伴生生物-與螺旋藻有共生關係的夥伴。
製劑-藍細菌中螺旋藻屬細胞的存活培養物，具有光合作用和固氮代謝活性。
使用以下進行實驗真菌感染由座菌科(Hypocreaceae)-綠色木黴(TrichodermaViride Canterbury/CTV1)。
真菌感染由紐西蘭，Canterbury大學動物部提供。
伴生生物～擔子菌(Basidiomycota)肺形側耳(pleurotus Pulmonaries Canterbury CPP1)的一種或是香菇(Lentinula edodes)Western Biologicals，C10、C13、C40(Shiitake mushroom)伴生生物用標準組織培養技術進行培養(Staments P，GrowingGourmetMedicinal Mushrooms，Ten Speed Press，1995)，由紐西蘭，Canterbury大學動物部提供。
製劑盤狀螺旋藻(Spirulina platensis)，(Earthrise Farms，Mass Culture Facilitico，California)。
混合物製備乾燥的盤狀螺旋藻在0.84w/v碳酸氫鈉溶液(pH8.5)中再次水化約12小時，最好在光照下進行(8～80Watts/m2)。
任選地，再次水化的溶液可含有0.04～0.25w/v的硫化鈉以便抑制細菌生長。
可以用減少營養供應或部分乾燥的應激刺激使培養菌種進入靜止期。
該混合物經冷凍乾燥可製備出不含其它存活生物的粉末。或者使用商品化供應的乾燥的盤狀螺旋藻(Earthrise Farms)實驗實例1-伴生生物感染肺形側耳的組織標本在25℃環境下的PDA皿中進行培養。當生成的菌苔佔據培養基表面2/3左右時，用2.5％的綠色木黴浸溼的菌絲和孢子懸液對每個培養基進行劃線接種，在25℃環境下孵育5～7天以便建立產生孢子的真菌汙染物。真菌汙染是否產生孢子可依據分生孢子的特徵性綠顏色來判斷。被綠色木黴感染的培養基分成對照組和實驗組。
用製劑處理實驗組培養皿分別用(0.1％、1％、5％w/v)的盤狀螺旋藻混合物噴灑在表面。
整個培養皿進行比較實驗組和對照組中微生物群體的組成每天都進行質量監控。2～5天內綠色木黴完全覆蓋了對照組培養基的表面，而實驗組培養基表面大量的綠色木黴感染卻在減少，實驗組培養基含有各種濃度(0.1％、1％、5％w/v)的盤狀螺旋藻。
在噴灑螺旋藻混合物後約24小時，汙染的分生孢子由綠色變為褐綠色。4天內，汙染的分生孢子表現為綠色球形團塊，而肺形側耳的白色菌絲快速侵入這些綠色物質。進一步孵育48小時，培養基表面看不到汙染的跡象，並且擔子菌，肺形側耳完全恢復而在實驗組各培養皿上形成連續的菌苔。
光學和掃描電鏡綠色木黴汙染的肺形側耳培養物經螺旋藻處理前後進行形態學比較，處理前，綠色木黴分生孢子梗的分支形態明顯地是瓶梗樣分支結構，這種結構終止於分支孢子的分支。經過製劑處理後一天，分生孢子出現球形結構，其表面基本沒有或只有一點裝飾結構(ornamentation)。處理後五天，菌絲和分生孢子結構觸合成一團不規則形的原生質樣的物質，這些物質並無細胞壁包被，還可觀察到肺形側耳菌絲侵入這些物質。由此可得出結論，即真菌汙染是通過伴生生物來進行腐生性代謝的。
使用擔子菌香菇重複上述實驗步驟，仍然得出上述相同的結果。
實例2-真菌汙染的處理25℃環境下，將2.5％綠色木黴浸潤的菌絲和孢子懸液劃線接種於PDA培養皿中並孵育5～7天。當孢子形成時，用1％w/v的螺旋藻粉末噴灑到每一個培養皿上，噴灑面積為培養基表面的100％或50％。
接受製劑100％面積噴灑的培養基在製劑噴灑三天內就變成黑色。綠色木黴的分生孢子梗和分生孢子乾燥化，未見到孢子形成和真菌汙染的再生長。
接受製劑50％面積噴灑的培養基；在噴灑區和未噴灑區之間出現間斷的界限差別。噴灑區的培養基變成深褐色或黑色，這和接受100％面積噴灑的培養基一樣，然而大約五天之後，界限漸漸消失，螺旋藻製劑可移行到未噴灑區而攻擊先前未受損的汙染菌絲。以上的觀察顯示，本製劑和其它藍細菌一樣，具有遊走能力。藍細菌的遊走速度估計約有每天2.5毫米。
實例3-共同培養實驗A.用製劑預處理將5克盤狀螺旋藻粉末與商品化的蘑菇菌種體(肺形側耳和香菇(L.edodes))混合。這種螺旋藻製劑/伴生生物的混合物，使用已知的方法(袋裝培養)，在含有Pinus radiata培養基的3公斤塑膠袋中培養。培養菌種首次大批成熟(產生成熟菌體或蘑菇)的時間，成熟菌體的形態和口味都與對照組相比進行了評價。
經過處理的蘑菇菌種，其生長速度提高了17％(即首次大批成熟為15天，而對照組為18天)，產量也比對照組高出10％。經過處理的成熟菌體，其形態或口味與對照組的菌體相比沒有變化。
從經過處理的蘑菇菌種產量提高的百分率和首次大批成熟期縮短三天的分析來推斷，藍細菌與伴生的擔子菌具有協同作用。發明者認為藍細菌可降解非擔子菌細胞壁殼多糖的組分，然而這一推測的機理還有待於證實。進一步實驗表明，藍細菌的滲出物顯示了促進成熟菌體產量的作用。
B.不用可見光對實驗的影響用於食用擔子菌培養的商品化培養袋是在適宜的環境下按以下步驟進行的擔子菌菌絲生長成為菌體支持系統，其中菌絲與培養基的接合構成了持續穩固的生長團塊，以至於聚乙烯塑料生產袋可以被移走。生長團塊表面的菌絲外被層逐漸老化而呈現出深褐色可觀察到的墊狀物，這一墊狀物被稱作「樹皮」(barking)，成熟菌體是由活躍的菌絲在老化的菌絲外被層下大量成熟起來的。
按先前描述的方法，20個3公斤的肺形側耳生長團塊2.5％w/v綠色木黴浸溼的菌絲和孢子懸液進行噴灑接種，並在25℃有光照的培養室內孵育至出現有孢子形成的真菌汙染物。將真菌汙染的生長團塊分為實驗組和對照組，每組各五個。實驗組用1％w/v的製劑進行表面噴灑。
對照組和實驗組都進一步孵育大約3天，直到肉眼看不到孢子形成和汙染物綠色木黴外周菌絲的生長。然後，第一對實驗組和對照組被移至漆黑的25℃培養室中，其餘四對繼續在光照環境中孵育。每天監測各組微生物的相對數量。
對照組中無論是有光照組還是無光照組的生長團塊在培養基周邊都無特徵性「樹皮」樣老化的菌絲外被層形成。綠色木黴孢子中綠色的分布和深淺程度顯示，第一個對照組被移到漆黑的培養室後2～3天內綠色木黴汙染已經佔據主導地位或超過擔子菌的生長。對培養基的檢查沒有發現活躍代謝的肺形側耳菌絲。對照組的培養基因擔子菌菌絲腐敗而失去了生長團塊的穩固性。
實驗組中無論是有光照組還是無光照組的生長團塊都顯示綠色木黴汙染明顯減少。在被處理後4～5天內，綠色木黴停止形成孢子。然而，無光照環境下孵育的實驗組從培養基中清除綠色木黴汙染的速度較慢(與有光照實驗組相比，時間大約滯後2～4天)。生長團塊可見特徵性的葉綠素樣綠顏色，並生長出成熟菌體。
無光照的優勢在於，當螺旋藻的生長因為光合作用的中止而被抑制時，螺旋藻降解綠色木黴細胞壁的能力提高了。伴生生物擔子菌從中有兩方面益處，因為對於擔子菌的營養來源來說，來自綠色木黴和藍細菌的競爭受到限制，另外可能是受損的綠色木黴菌絲和藍細菌在光合作用及固氮作用中產生的滲出物為擔子菌提供了氮素來源。
發明者進一步發現調節培養室的光照強度可以影響螺旋藻和同伴擔子菌的活力。完全無光照則完全失掉了螺旋藻的光合作用。螺旋藻是具有光合作用和固氮作用的自營性生物，來自活性細胞的滲出物可給伴生生物提供有機氮和其它豐富的有機營養物。
實例4-綠色木黴汙染的原位處理擔子菌成熟菌體和木質纖維素的綠色木黴感染商品化培養的擔子菌易於形成點狀真菌感染，這些真菌可以感染含木質纖維素的培養基和蘑菇。對於諸如綠色木黴類的真菌感染，培養室為真菌感染的播散和生長各自提供了良好的含氧和潮溼環境。
發明者向真菌感染的成熟菌體噴灑1％w/v的螺旋藻懸液而有效地控制了真菌的點狀感染。向真菌感染的同伴擔子菌噴灑相同的懸液，當擔子菌處於活躍狀態時，產生快速的反應。在以上處理之前2～3天給擔子菌澆水即可使其活躍。進一步發現，撒到培養基上的螺旋藻粉末可以限制和治療輕微的真菌感染。
實例5-控制蚊子的原位處理在含有蚊子幼蟲的一個10平方米左右的池塘中進行了三次實驗，每次都是將15克的螺旋藻粉末(或者是上述實例中的乾燥乳膏)撒到水面上。1～5天內所有的蚊子幼蟲都死亡。
蚊子幼蟲死亡的機制還不清楚，蚊子幼蟲食用了螺旋藻是明確的。據推測是外殼多糖酶消化了襯附在幼蟲中、後腸腔的外周營養膜，這樣就使得蚊子幼蟲易被感染而死亡。
實例6-蒼蠅和黃蜂的實驗處理將25％w/v的螺旋藻乾燥乳膏放在商品化的油膩基座上(作為誘餌)並暴露於有蒼蠅和黃蜂存在的自然環境中而進行了十次實驗。在誘餌的附近可發現死亡的蒼蠅和黃蜂。
雖然機理還不清楚，但蒼蠅和黃蜂的死亡原因和實例5中推測的原理是相似的。
儘管在本實驗中未使用其它誘餌，可以認為其它誘餌也可以加到螺旋藻乳膏中而不降低其作用。
雖然本發明以有關蘑菇培養的生物學控制作為優選的實施方案進行了敘述，但還可以認為本發明可用於防止和治療其它果品和蔬菜類農產品的感染。
權利要求
1.一種與伴生生物(伴生生物是與抗真菌製劑有共生關係的夥伴)協同作用來控制和抑制真菌汙染的生長和影響的生物學控制方法，其中抗真菌製劑是經過處理的螺旋藻混合物，該方法包括以下步驟經過處理的螺旋藻混合物的製備；把該混合物應用到以下被選擇的作用部位上或其附近園藝產品、蘑菇菌種、農業產品及其組合，其中製備方法包括以下步驟乾燥的螺旋藻再次水化，給予培養物以應激刺激，並通過冷凍乾燥將螺旋藻製成粉末。
2.權利要求1所述的生物學控制方法，其中所述製備方法進一步包括含有0.84w/v碳酸氫鈉，pH為8.5的螺旋藻再次水化溶液，水化時間為12小時左右。
3.權利要求1或2所述的生物學控制方法，其中該混合物經冷凍乾燥製備出不含其它存活生物的粉末。
4.權利要求l至3任一項所述的生物學控制方法，其中該混合物製備過程中的再次水化是在8～80Watts/m2的光照下進行的。
5.權利要求1到4任一項所述的生物學控制方法，其中再次水化的溶液中含有0.04～0.25w/v的硫化鈉。
6.權利要求1至5任一項所述的控制和抑制真菌汙染的生長和影響的生物學控制方法，其中該方法進一步包括使用一種方法調控螺旋藻的活力。
7.權利要求6所述的控制和抑制真菌汙染的生長和影響的生物學控制方法，其中所說的方法是使用可見光。
8.上述權利要求中任一項所述的控制和抑制真菌汙染的生長和影響的生物學控制方法，其中的伴生生物是擔子菌。
9.權利要求8所述的控制和抑制真菌汙染的生長和影響的生物學控制方法，其中的伴生生物是肺形側耳和香菇中的一種。
10.控制、抑制或驅除害蟲的生物學控制方法，其中使用了殺蟲劑，所述殺蟲劑是經過處理的螺旋藻混合物，該方法包括以下步驟經過處理的螺旋藻混合物的製備；把所述混合物應用到以下被選擇的作用部位或其附近含有欲被抑制、驅除或控制的害蟲的液體；有害蟲出沒地的誘餌存放處及其附近或者是這些害蟲已知的飛行路徑；其中所述製備方法包括以下步驟將乾燥的螺旋藻再次水化，給予培養物以應激刺激，並通過冷凍乾燥將螺旋藻製成粉末。
11.權利要求10所述的控制、抑制或驅除害蟲的生物學控制方法，其中的害蟲是甲殼蟲和昆蟲。
12.權利要求11所述的控制、抑制或驅除害蟲的生物學控制方法，其中的昆蟲是那些在農業、園藝和醫藥行業中被認為是害蟲的昆蟲。
13.一種用作抗真菌劑的製備物，該製備物包括權利要求1到9任一項的方法中使用的經處理的螺旋藻混合物。
14.一種用作殺蟲劑的製備物，該製備物包括權利要求10到12任一項的方法中使用的經處理的螺旋藻混合物。
全文摘要
將乾燥的螺旋藻(Spirulina)再次水化,給予培養物以應激刺激,並通過冷凍乾燥將螺旋藻製成粉末,然後把該粉末應用於真菌汙染部位來控制和抑制真菌汙染的生長和影響。
文檔編號A61F13/00GK1245399SQ97181673
公開日2000年2月23日 申請日期1997年12月9日 優先權日1996年12月9日
發明者凱爾文·溫斯頓·鄧肯, A·I·麥雷 申請人:凱爾文·溫斯頓·鄧肯