蛭弧菌遊泳體和蛭質體混合體菌液在海參育苗中的應用的製作方法

2023-09-20 16:25:35 1

專利名稱：蛭弧菌遊泳體和蛭質體混合體菌液在海參育苗中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種細菌的應用，特別涉及蛭弧菌遊泳體和蛭 質體混合體菌液在海參育苗中的應用。
背景技術：
海參(Apostichopusjaponicus)，屬海參綱(Holothurioidea)，以海底藻類和浮遊
生物為食。海參全身長滿肉刺，廣布於世界各海洋中。海參同人參、燕窩、魚翅齊名， 是世界八大珍品之一。海參不僅是珍貴的食品，也是名貴的藥材。現代研究表明，海參 具有提高記憶力、延緩性腺衰老，防止動脈硬化、糖尿病以及抗腫瘤等作用。近年來，隨著城鄉居民生活水平的不斷提高以及醫療保健意識的增強，海參的 消費需求不斷上升，價格不斷上漲，由此帶動了海參養殖的興起，海參養殖已成為繼對 蝦養殖之後又一新的海水養殖熱點。現在我國每年生產的海參商品苗已突破億枚，居世 界榜首。由於種苗數量的逐漸提高，規模的不斷擴大也出現許多問題急待加以解決追 求利潤最大化導致近親繁殖、親體小型化、病害猖獗；無序大量使用抗生素造成海參體 內藥物殘留，品質下降；近親育苗，降低了苗種的生存力；按目前的生產工藝，多數育 苗場用水量大，水不經處理直接入海，嚴重汙染環境。蛭弧菌是寄生於其他細菌，並能導致宿主細菌裂解的一類細菌。比一般細菌 小，能通過細菌濾器，有類似噬菌體的作用。蛭弧菌的生活史可分為脫離宿主細菌、具 有鞭毛、自由遊泳的遊泳體狀態和在宿主細菌內生長發育的蛭質體狀態。用蛭弧菌遊泳體和蛭質體的混合製劑作為用於海參育苗的微生物製劑，對育苗 水體和餌料進行處理，可有效裂解消除水體中可能產生海參參苗病害的細菌，兼具遊泳 體起效快，活力強和蛭質體製備、保存容易，殺菌作用時間更久和環境耐受力更強的優 點。從而克服了抗生素濫用帶來的副作用和常規消毒劑殘留等問題。同時在蛭質體發育 期間，所入侵的宿主雖已無活性，但蛭弧菌並不改變宿主細胞的表面結構，使原宿主仍 具有抗原作用，因此不影響宿主的免疫原性，可刺激生物體，產生免疫應答反應。故蛭 質體形式是潛在的疫苗在育苗過程中有提高苗種的免疫力的功能。蛭弧菌遊泳體和蛭質體混合製劑一方面能夠裂解水體中的(潛在)致病菌，淨 化水體，減少換水頻率和換水量，另一方面蛭弧菌能改善養殖生物腸道環境，提高免疫 力，促進幼苗發育和生長，提高苗種成活率。到目前為止，尚無對海參育苗過程中使用蛭弧菌遊泳體和蛭質體混合製劑的研 究報導。

發明內容
本發明的目的在於克服已有方法的不足，提供蛭弧菌遊泳體和蛭質體混合體菌 液在海參育苗中的應用方法，能有效控制病害發生，提高苗種質量和育苗成功率，減少 育苗過程中汙水的排放。
本發明的目的可以通過以下方案實現蛭弧菌混合體菌液在海參養殖中的應用，所述蛭弧菌混合體菌液為蛭弧菌蛭質 體菌液和遊泳體菌液混合。 所述蛭弧菌蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.) BDMOl於2008年4月28日保藏於 中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO M208066。所述蛭弧菌混合體菌液為蛭質體菌液與遊泳體菌液按細菌數1 1混合。所述蛭弧菌混合體菌液在海參養殖中的應用是將飼料在蛭弧菌混合體菌液中浸 泡 15-45min。所述蛭弧菌混合體菌液在海參養殖中的應用是在水體中添加蛭弧菌混合體菌 液，使水體中蛭弧菌混合體濃度為IO1 107pfo/mL。本發明相對於現有技術，具有如下的優點及效果1、本發明所述蛭弧菌混合製劑兼具遊泳體起效快，活力強和蛭質體製備、保存 容易，殺菌作用時間更久和環境耐受力更強，且可作為潛在疫苗的優點，效果更好。2、本發明所述蛭弧菌混合製劑在海參的應用中安全性好。蛭弧菌通過裂解而消除致病菌的方法是生物方法，綠色、安全、無汙染。蛭弧 菌可侵染、裂解宿主細菌的特性使之適合作為抑制或清除生物體及其環境中致病菌的生 物淨化因子，且其在裂解完宿主細菌後，會因飢餓而自動消亡，從而克服了抗生素濫用 帶來的副作用。現有的研究表明蛭弧菌對海參無毒性作用，對人類無致病性。3、所述蛭弧菌混合製劑可有效提高種苗免疫力蛭弧菌混合製劑可調節參苗自身的菌系，維護腸道系統環境，促進免疫系統的 發育，增強苗種的體質，方案於實際實施中各項免疫指標的測定均高於使用傳統的方 法，且遊泳體和蛭質體混合製劑中的蛭質體所攜帶的宿主氣單胞菌雖已無活性，但免疫 原性並未被破壞，故可發揮疫苗的作用。4、本發明方案可有效減少換水、倒池的次數，經實驗證實在幼體培育期無需換 水，在稚參的培育期最長可達20天不換水倒池，減少了汙水的排放，降低對環境的影 響，是一種綠色、環保、低碳的節水型新育苗技術。


圖1為實施例育苗試驗後免疫因素一酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)結果圖2為實施例育苗試驗後免疫因素一鹼性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)
結果
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於 此。實施例1蛭弧菌混合製劑的製備蛭弧菌蛭質體菌液優選通過以下方法製備接種0.5mL 106CfU/mL嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila,購於廣東省微生物所菌種保藏中心，編號GIM1.172)於IOOmL營 養肉湯(蛋白腖10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，蒸餾水lOOOmL，pH 7.4)液體培養基中，28°C培養 20h，培養液經 6000rpm 離心 20min 後，沉澱用 5mL DNB (dilute nutrient broth) 液體培養基(營養肉湯0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母精提物O.lg，溶於IOOOmL蒸 餾水中，pH值為7.4)懸浮，後加入至IOOmL DNB中，接入ImL 1 X 103pfu/mL蛭弧菌 BDFM05, 28°C培養48h，培養液經7000rpm離心20min後，去除含蛭弧菌遊泳體的上 清液，沉澱用ImL DNB液體培養基懸浮，得到ImL蛭弧菌蛭質體菌液，濃度為108pfo/mL。蛭弧菌遊泳體菌液的製備方法為將蛭弧菌蛭質體製備方法中的含蛭 弧菌遊泳體的上清液經16000rpm離心20min後，沉澱用ImL DNB液體培養基 懸浮，得到ImL蛭弧菌遊泳體菌液，經OD600nm測定(LYSIS OF VIBRIOS BY BDELLOVIBRIO-AND-LIKE ORGANISMS (BALOs) ISOLATED FROM MARINE ENVIRONMENT[J],Journal of FoodSafety, 2008，28(2) 220-235.)，濃度為 108pfo/mL。所述蛭弧菌遊泳體和蛭質體混合製劑按蛭弧菌遊泳體和蛭質體菌數1 1比例混合。實施例2蛭弧菌混合製劑在海參育苗中的應用實驗實施地點山東某海參養殖場，育苗種類仿刺參又名灰參1.親參採捕自然海區採捕。採捕時間海水底層水溫達到15 16°C時，親參 產卵前5天集中採捕。選擇體長20cm以上，體重250g以上、性腺指數10%以上、無損 傷的個體作親參。2.親參蓄養蓄養密度15隻/m3，蓄養的水溫16 18°C，蓄養時間5天，在蓄養池中進行。 蓄養池中的水經過精細過濾。在水中加入蛭弧菌遊泳體和蛭質體混合菌液，使培育池中 的蛭弧菌濃度達到IO1NlO7PfoAnI^短期蓄養過程不投餌，不換水，每天早晚利用虹吸 作用清理池中的糞便等汙物。暫養期間，每日清晨吸底檢查是否有卵，以免漏掉，如僅見少量產卵可棄掉。3.產卵孵化與幼體培育受精採用混合受精方式。為保證受精質量，防止精液過多，需及時將過多的雄 參(已見排精的個體)挑出並移入另外的水池中。親參產卵受精後及時將親參移出，並 用過濾海水洗卵，直到池水變清為止，再向池中加入濃度為IO1 IO7PiVmL的蛭弧菌混 合製劑，受精卵直接在蓄養池中孵化。受精卵的孵化密度為5個/mL，孵化水溫為20°C。孵化期間每隔0.5h用攪水 耙將池水上、下翻動一次，翻水時應不留死角且不能向一個方向旋轉，以避免將胚體旋 向池中心聚集。胚體孵出後，必要時可給予充氣。4.幼體培育當胚胎發育到小耳幼體時，要進行選育。將上浮的幼體移入培育池內繼續培 養。培育池中的海水為經砂濾的海水，池中添加蛭弧菌混合製劑使池中的蛭弧菌濃度為 IO1 107pfu/mL，幼體布池密度約為0.5個/mL。孵化36小時後，即投餌。餌料主要為天然的牟氏角毛藻。藻類的日投餌量在 初耳幼體期為1.5萬細胞/mL，中耳幼體期為2萬 3萬細胞/mL，大耳幼體期為4萬 5萬細胞/mL。每日分3次投喂，每次投餌量的標準以投餌1小時後大多數幼體滿胃即 可，下次投餌要接近半胃為準。所有投餵的餌料需事先用濃度為IO1 107pfu/mL的蛭 弧菌混合製劑泡30min。幼體培育期間全部使用二級砂濾水。本階段不換水、倒池，但要及時利用虹吸 作用或吸底器清除池底汙物5.稚參的採集和培育當幼體25%發育至蹲形幼蟲時，即可投放稚波紋板做附著基，附著基投放前用 20mg/L的高錳酸鉀溶液浸泡2天，再用過濾海水衝洗乾淨。洗刷乾淨後放入餌料池中供 自然海水中存在的底棲硅藻附著。經過20天，在附著基上面附著一層天然的底棲硅藻， 即投放使用。使用前用水衝去附著基上的汙物，再放入濃度為IO1 107pfu/mL的蛭弧 菌混合製劑中浸泡30min。每平方米投放60片波紋板，呈60°斜放，以便投餌時承接餌 料。體長2mm以前的稚參，以附著基上的底棲硅藻為主食。隨著稚參的增長，及時 補充新的底棲硅藻及鼠尾藻磨碎液。當稚參體長達2mm時，以鼠尾藻磨碎液為餌料，每 日投餵4次，每次20 30萬個細胞單位。投放的所有餌料均需要放入濃度為IO1 IO7PiVmL的蛭弧菌遊混合製劑中泡 3 Omin ο育苗期間隨時觀察溫度，及時清除池底部的沉澱物及水表面的雜物。參照水體 情況可設不同的換水周期，試驗結果表明最長可達20天不換水，每次換水時注入二級 砂濾水，換水完畢後需施加蛭弧菌混合製劑，使水體中的蛭弧菌濃度達到IO1 107pfo/
mLo根據稚參生長狀況，可提前移出已達出苗規格2cm的稚參，分期出池，以利個 體小的迅速生長。實驗分組實驗分A.B.C.D四大組，其中A組(對照)按現有的工廠化生產方法實施。
B組(蛭弧菌混合製劑浸泡飼料)B1.1 B1.4 全程用IO1PfuAnL蛭弧菌混合製劑浸泡所有餌料， 別每隔5天、10天、15天、20天換水一次。B2.1 B2.4 全程用103pfu/mL蛭弧菌混合製劑浸泡所有餌料， 別每隔5天、10天、15天、20天換水一次。B3.1 B3.4 全程用105pfu/mL蛭弧菌混合製劑浸泡所有餌料， 別每隔5天、10天、15天、20天換水一次。B4.1 B4.4 全程用107pfu/mL蛭弧菌混合製劑浸泡所有餌料， 別每隔5天、10天、15天、20天換水一次。C組(蛭弧菌混合製劑潑灑於水體)用蛭弧菌混合製劑均勻潑灑於水體中，使 水體中的蛭弧菌濃度達到設定要求。濃度和換水間隔設置同B組。D組(蛭弧菌混合製劑潑灑於水體中和浸泡餌料)用蛭弧菌混合製劑均勻潑灑 於水體中和浸泡所有餌料，濃度和換水間隔設置同B組。
稚參培育期分 稚參培育期分 稚參培育期分 稚參培育期分
免疫指標測定1.酸性磷酸酶(ACP)與鹼性磷酸酶(AKP)活力的測定製備粗酶提取液。育苗實驗結束，每組隨機取仿刺參幼苗6隻用冰凍雙蒸水 (4pH 7.0)衝洗乾淨，用吸水紙吸乾水分後，準確稱取組織質量，按質量體積比1 9 加入0.86%的冷生理鹽水，在液氮中研磨成勻漿狀，分裝於1.5mL的離心管中，4°C， 12000r/min離心lOmin，取上清液，加入9倍體積冷生理鹽水，製成粗酶提取液。4°C保 存，並於24h內分析完畢。鹼性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性均採用Krazel(1982)磷酸苯二鈉 法，以每克組織蛋白在37°C與磷酸苯二鈉分別作用15min和30min，產生Img酚為一個 酶活力單位。2.感染實驗試驗結束後，感染試驗於預先消毒的盛有50L砂濾海水(鹽度29 30%。)的透明 水族箱中進行，以工廠化生產的A組作為對照組，其他(B-D)組為實驗組。對照和實驗 各組，每組隨機取海參苗40頭，平均分成兩個平行系列。按實施例1中的方法製備嗜水 氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，購於廣東省微生物所菌種保藏中心，編號GIM1.172)菌 液，之後投入到對照和實驗組的養殖水體中，使水體中的嗜水氣單胞菌濃度達到IO7Cfu/ mL。試驗水溫保持在18 20°C，充氣培養。人工感染後，記錄刺參的體表變化、運 動、攝食及死亡情況連續觀察7d，最終計算成活率，採用相對存活率(RelativePercentage Survival, RPS)計算式RPS(% ) = (1-免疫組死亡率/對照組死亡率)X 100%水質檢測水質檢測項目包括色臭味，酸鹼度，氨態氮，亞硝酸鹽氮，硫化物。其 中pH用數字式pH計測定(解析度O.OlpH)，氨態氮用次溴酸納氧化法法測定 (GB12763.4-91)；亞硝酸鹽氮用重氮-偶氮光度法測定(GB12763.4-91)；硫化物用對氨 基二甲基苯胺光度法(亞甲藍法)(GB16489-96)。四、實驗結果成活率、RPS結果如表1所示，ACP、AKP結果見圖1，圖2。從表1和圖1、
2可以看出，實驗組B，C，D無論是育苗成功率還是各項免疫指標均好於對照A組，由 此表明本方案用蛭弧菌遊泳體和蛭質體混合製劑進行海參育苗可提高稚參的成活率和免 疫力，優於現有生產模式培育出的育苗質量。比較實驗組B/C/D，可知B組成活率最高可達54.1%，感染實驗的PRS最高 可達51%，但包括ACP、AKP在內均要略低於C組。D組成活率最高可達68.8%，RPS 可達62%，均高於B，C兩組，ACP，AKP的數據同樣如此，表明用蛭弧菌同時處理餌 料和水體可更有效地提高稚參的成活率和免疫力。從各組組內的對比可知，各項指標的數據隨著蛭弧菌遊泳體和蛭質體混合製劑 濃度的升高而升高，但換水周期對其的影響不顯著。因此，在實際生產中，換水周期可 設為20天一次。如此，既可降低能耗和勞動力，又可減少排汙，保護環境。水質檢測結果各組均符合《漁業水質標準》(GB 11607-1989)和《無公害食品 海水養殖用水水質》(NY5052-2001)標準。但Al組的氨態氮，亞硝態氮，硫化物測定值均高於試驗組B、C、D的。其中，A組氨態氮的檢測結果為0.322mg/L，B/C/D組 均《0.231mg/L ；亞硝態氮A組檢測結果為0.018mg/L，B/C/D組均《0.015mg/L ；硫 化物A組檢測結果為0.108mg/L，B/C/D組均《0.10lmg/L。由此可見，無論在水中還是在飼料中添加濃度為IO1 107pfu/mL的蛭弧菌遊 泳體和蛭質體混合製劑，5 20天換水一次，均能提高海參的免疫力和成活率，淨化水 質，促進參苗生長。在水中和飼料中同時添加蛭弧菌遊泳體和蛭質體混合菌液，效果更佳。表1稚參各項指標測定結果
權利要求
1.蛭弧菌混合體菌液在海參養殖中的應用，其特徵在於所述蛭弧菌混合體菌液為 蛭弧菌蛭質體菌液和遊泳體菌液混合。
2.根據權利要求1所述蛭弧菌蛭質體菌液在海參養殖中的應用，其特徵在於所述 蛭弧菌蛭弧菌為蛭弧菌(Bdellovibrio sp.) BDMOl於2008年4月28日保藏於中國典型培養 物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO M 208066。
3.根據權利要求1所述蛭弧菌混合體菌液在海參養殖中的應用，其特徵在於所述 蛭弧菌混合體菌液為蛭質體菌液與遊泳體菌液按細菌數11混合。
4.根據權利要求1所述蛭弧菌混合體菌液在海參養殖中的應用，其特徵在於所述 蛭弧菌混合體菌液在海參養殖中的應用是將飼料在蛭弧菌混合體菌液中浸泡15-45min。
5.根據權利要求1所述蛭弧菌混合體菌液在海參養殖中的應用，其特徵在於所述 蛭弧菌混合體菌液在海參養殖中的應用是在水體中添加蛭弧菌混合體菌液，使水體中蛭 弧菌混合體濃度為IO1 107pfo/mL。
全文摘要
本發明公開了蛭弧菌遊泳體和蛭質體混合製劑在海參育苗中的應用，通過在水體和飼料中添加蛭弧菌遊泳體和蛭質體混合菌液實現，具體包括育苗設施與水質條件，親參採捕，親參蓄養，產卵孵化與幼體培育，採苗和稚參培育，關鍵技術是在水體中添加濃度為10～107pfu/mL的蛭弧菌混合製劑，和/或同時飼料也用濃度為10～107pfu/mL的混合製劑浸泡30min，應用本發明平均育苗成活率達到50％以上，並且能有效改善水質，實驗表明最長可長達20天不換水，節約成本，人力，大大提高了經濟效益，且育苗成活率高、苗種質量好、節水節能、綠色低碳。
文檔編號A23K1/16GK102017904SQ20101026841
公開日2011年4月20日 申請日期2010年8月31日 優先權日2010年8月31日
發明者孫麗瀅, 蔡俊鵬 申請人:華南理工大學