抗HCMVUL122基因的siRNA序列及應用的製作方法

2023-09-20 13:35:05

專利名稱：抗HCMV UL122基因的siRNA序列及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術，涉及分子生物學和基因工程技術領域，具體涉及針 對人巨細胞病毒(HCMV) UL122基因的siRNA序列的設計、篩選及其在體 內外抑制HCMV的應用。
背景技術：
1. HCMV的治療現狀HCMV屬(3皰疹病毒亞科，在人群中感染廣泛，但大多為無症狀的亞臨床 感染。HCMV感染在免疫功能低下的人群(如AIDS、器官移植患者等)中則 可引起多系統的嚴重疾病，且可能與多種惡性腫瘤的發生有關。同時，HCMV 也是導致先天畸形和新生兒出生缺陷的最主要的感染性因素。因此，防治 HCMV感染一直是國內外醫學關注的熱點之一。目前，HCMV的治療藥物主 要包括更昔洛韋(ganciclovir, GCV)、膦甲酸鈉(fascamet， FOS)和西多福韋 (ddofovir，CDV)，但是由於藥物毒副作用和HCMV耐藥株的出現，急需探索 新的治療途徑控制HCMV感染。2. UL122基因及其表達蛋白的研究現狀HCMV的基因組表達具有一定時序性，可分為即刻早期(正)、早期(E) 和晚期(L)三種時相蛋白。主要正基因UL122經過選擇性剪接產生長度分 別為2.25kb (外顯子1，2,3,5)和1.70kb (外顯子1, 2, 3， 5')的mRNA，分別 編碼正286 (86kDa，580個aa)和IE255 (55kDa, 425個aa)兩種核磷蛋白。研 究表明，UL122基因是HCMV的增殖必需基因，缺失UL122的HCMV突變 株不能產生增殖性感染。UL122基因編碼的IE286蛋白在病毒複製和調節宿主 細胞周期等方面發揮關鍵作用。IE286不僅能夠反式激活多種病毒和細胞的啟 動子，而且也能作為抑制子下調主要IE蛋白的表達。另外，正286通過多種途 徑抑制被感染宿主細胞的凋亡，包括與凋亡誘導因子p53結合使其失活；通 過幹擾p53的修飾抑制其激活；阻止不依賴p53的凋亡通路如TNF調節的死 亡受體信號途徑；誘導NF《B轉錄，在適當條件下NF-kB通過誘導cIAPs阻 止細胞凋亡。3. RNA幹擾的研究現狀RNA幹擾(RNA interference, RNAi)是序列特異的雙鏈RNA (dsRNA) 使細胞內同源mRNA降解，從而產生特異性基因表達沉默的過程。它是機體 的一種小分子RNA介導的序列特異性免疫保護機制，可以對抗侵入性遺傳因 子的作用。自1998年首次被報導以來，RNAi技術以其特有的優越性而被迅速 應用於抗病毒及其相關方面的研究中，目前已在fflV、 HBV、 HCV、流感病毒 等的抗病毒研究中取得重要進展。RNAi的作用主要由長約21~23nt的dsRNA介導，其中一類稱為小幹擾 RNA (small interfering RNA，siRNA)，它和目的mRNA序列具有嚴格的配對， 能引起相應mRNA降解。由於RNAi是siRNA耙向作用mRNA引起的特異性 降解，因此要產生有效RNAi的關鍵是選擇合適的siRNA作用靶點。目前RNAi 靶點的選擇原則可以概括為以下幾點①選擇GC含量在50%左右的mRNA 區域；②避免選擇啟動子起始部位下遊50 100nt以內或終止子上遊50 100nt 內的區域；(D避免超過三個G或三個C的重疊，因為多聚G或多聚C能形成 類聚物而幹擾RNAi的沉默機制；④選擇以兩個AA開始的序列，這將使合成 siRNA更加容易；⑤保證耙序列與其他基因沒有同源性。目前，製備siRNA 的方法主要包括化學合成法、體外轉錄法、長片段dsRNA經RNaseIII降解法、 siRNA表達載體轉錄法及PCR製備的siRNA表達框法等5種。發明內容本發明的目的是提供一種抗人巨細胞病毒(HCMV) UL122基因的siRNA 的cDNA序列，其核苷酸序列是5'-GCGTGGAGCCTCAAAGAATTG-3'。本發明的另一個目的是提供該cDNA序列在製備治療人巨細胞病毒感染 的藥物中的應用。本發明根據siRNA設計原則，構建針對HCMV UL122基因的siRNA真核 表達載體，選擇的siRNA其cDNA序列的GC含量為52.4°/。，對應UL122 mRNA 中1414-1434核苷酸位點；通過轉化大腸桿菌後提取質粒，轉染AD293細胞， 可有效抑制UL122基因mRNA和蛋白表達水平，因此可應用於HCMV治療藥 物的製備。本發明的有益之處是提供的siRNA序列針對HCMV的增殖必需基因 UL122,目前國內外尚無以此基因作為RNAi靶點的報導。以此序列為基礎的 真核表達載體在細胞中能有效抑制UL122基因mRNA水平和蛋白表達水平， 因此可作為HCMV治療藥物開發的一個新耙點。
具體實施方式
本發明結合實施例作進一步說明。實施例一 siRNA真核表達載體體外抑制UL122-EGFP融合蛋白的表達1. siRNA的設計根據siRNA設計原則，從UL122 mRNA起始密碼子AUG下遊lOOnt處搜索AA序列，其3'端相鄰21nt序列作為候選耙點，從中選擇GC含量在40~55%的siRNA序列，並通過GenBank資料庫的Blast功能與人類基因組序列進行比對，確保無同源性。最終選擇的siRNA其cDNA序列為5，-GCGTGGAGCCTCAAAGAATTG-3，， GC含量為52.4%，對應UL122mRNA 中1414—1434核苷酸位點。2. 表達siRNA所需shDNA的合成與製備表達siRNA所需shDNA的正義 鏈 序 列 為CGCTTTTTA-3， ， 反義鏈序列 為GCTCCACGCG畫3,，委託生物公司合成後，將正、反義鏈退火形成雙鏈。3. siRNA真核表達載體的構建具有U6啟動子的真核表達質粒pSilencer 2.0-U6 (美國Ambion公司)用BamH I和Hind III雙酶切，與退火後的shDNA 雙鏈連接，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a， 37'C培養過夜，挑取克隆抽提質 粒送上海英駿公司進行DNA測序鑑定，選取測序結果正確的質粒擴增、保存。4. siRNA表達質粒體外抑制UL122-EGFP融合蛋白表達的實驗(1) 報告質粒pUL122-EGFP:為表達綠色螢光蛋白(EGFP)和UL122融 合蛋白的質粒，由UL122基因cDNA插入pEGFP-Nl (美國Clontech公司)的 HindIII和EcoRI位點構建而成，由於EGFP位於UL122的下遊，且共用一個 啟動子，故EGFP的表達情況可間接反映UL122的表達。(2) siRNA表達質粒與報告質粒共轉染AD293細胞人胚腎細胞AD293接 種12孔細胞培養板後，待細胞達到80n/。 90y。融合率，用Invitrogen公司 Lipofectamine 2000試劑將siRNA表達質粒與報告質粒pUL122-EGFP共轉染細 胞，操作方法參照試劑說明書，同時設轉染空質粒pSilencer 2.0-U6的陰性對 照組和不轉染質粒的空白對照組，5小時後換培養液(含10%新生牛血清的 DMEM)繼續培養。(3) 螢光定量RT-PCR檢測AD293細胞中UL122 mRNA的表達質粒轉染 後48h，收集AD293細胞，Trizol法抽提細胞總RNA，採用TAKARA公司的SYBR PrimeScript RT-RCP Kit檢測病毒UL122的mRNA，實驗方法參照試劑 盒說明書。UL122 基因 PCR 引物序列為上遊 5'國CGGCTGTATCGTGATCTCTG誦3， ， 下 遊5'-CAGGAGGAGGAAGACGAAGA-3，。內參照採用GAPDH， PCR引物序列 為 上 遊 5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，， 下 遊 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，。結果顯示，與陰性對照組相比，siRNA 表達質粒對UL122 mRNA表達的抑制率為48.2°/0。(4)流式細胞儀檢測AD293細胞中UL122蛋白表達情況:質粒轉染後72h， 收集每孔內細胞，用PBS緩衝液洗滌2次後重懸於PBS中。用流式細胞儀在 488nm激發波長下檢測每孔細胞平均螢光強度(mean fluorescence intensity, MFI)及螢光陽性細胞比率a，計算每孔細胞的總螢光強度(total fluorescence intensity, TFI) = MFIx a 。結果顯示，與陰性對照組相比，siRNA表達質粒對 UL122蛋白表達的抑制率為53.5%。本發明繫結合最佳實施例進行描述，在閱讀了本發明的上述內容後，本領 域技術人員可以對本發明作各種修改，這些等價形式同樣落於本發明所附權利 要求書所限定的範圍內。本發明涉及的序列 1 21 DNA 人工序列 根據HCMVUL122基因設計的siRNA的cDNA序列 1GCGTGGAGCC TCAAAGAATT G 212 57 DNA 人工序列 製備UL122基因siRNA所需shDNA正義鏈的序列 2 3 57 DNA 人工序列 製備UL122基因siRNA所需shDNA反義鏈的序列 34 20 DNA 人工序列 UL122基因PCR上遊引物序列 4CGGCTGTATC GTGATCTCTG 205 20 DNA 人工序列 UL122基因PCR下遊引物序列 5CAGGAGGAGG AAGACGAAGA 20 6 19 DNA 人工序列 GAPDH基因PCR上遊引物序列 6GAAGGTGAAG GTCGGAGTC 19 7 20 DNA 人工序列 GAPDH基因PCR下遊引物序列 7GAAGATGGTG ATGGGATTTC 20
權利要求
1.一種抗人巨細胞病毒UL122基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是5』-GCGTGGAGCCTCAAAGAATTG-3』。
2. 權利要求1所述的cDNA序列在製備治療人巨細胞病毒感染的藥物中 的應用。
全文摘要
本發明提供一種抗人巨細胞病毒UL122基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是5』-GCGTGGAGCCTCAAAGAATTG-3』。本發明根據siRNA設計原則，選擇的siRNA其cDNA序列的GC含量為52.4％，對應UL122 mRNA中1414-1434核苷酸位點；通過轉化大腸桿菌後提取質粒，轉染AD293細胞，可有效抑制UL122基因mRNA和蛋白表達水平，可在製備治療人巨細胞病毒感染的藥物中的應用。
文檔編號A61P31/20GK101333529SQ20081006331
公開日2008年12月31日 申請日期2008年8月1日 優先權日2008年8月1日
發明者尚世強, 段群軍, 胡妙鳳, 趙正言, 然 陶 申請人:浙江大學