微藻利用無機碳途徑的定量方法
2023-09-20 17:37:40 1
專利名稱：微藻利用無機碳途徑的定量方法
技術領域：
本發明涉及一種微藻利用無機碳途徑的定量方法，屬於生態環境治理和海洋生物工程領域。
背景技術：
微藻(microalgae)包括所有生活在水中營浮遊生活方式的微小植物，通常就指浮遊藻類。微藻結構簡單，其生理過程也相對簡單，有些種類是科學研究的模式植物，如萊茵衣藻、小球藻，很多種類還可以人工培養，這為我們的研究提供了便利。微藻對水體無機碳的利用有兩種方式，(I)利用大氣中的ニ氧化碳。CO2作為線性非極性分子，呈電中性，它可以自由擴散進入細胞雙層脂膜，進入細胞中的CO2為微藻細胞的光合作用所利用；(2)利用溶液中碳酸氫根離子。碳酸氫根離子既可以直接轉運也可間接轉運到細胞中為微藻細胞 所利用。碳酸氫根離子的直接轉運指的是經過細胞質膜表面載體蛋白或陰離子交換蛋白， 直接把碳酸氫根離子轉運到細胞內，在胞內經碳酸酐酶轉化為CO2或直接以碳酸氫根離子的形式由葉綠體膜蛋白主動運輸到葉綠體內，經碳酸酐酶轉化成CO2供核酮糖-1，5 ニ磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)固定；碳酸氫根離子的間接轉運是指依賴於胞外碳酸酐酶的碳酸氫根離子的間接轉運。碳酸酐酶(EC 4. 2. I. I)是ー種含鋅的金屬酶，催化CO2與HCO3-的可逆轉化C02+H20 H++HCCV。碳酸酐酶分為質膜內和質膜外兩種。質膜外碳酸酐酶(又稱胞外碳酸酐酶)通過金屬離子與細胞壁內表面相連接，催化細胞擴散層中碳酸氫根離子迅速水解成游離CO2,從而保證了細胞的CO2快速供應。有些藻類只利用CO2 ;有些藻類不僅能利用CO2,還能或直接利用碳酸氫根離子，或通過胞外碳酸酐酶間接利用碳酸氫根離子，或者兩者兼而有之。但是現有技術無法定量微藻利用無機碳途徑。了解微藻利用方式和份額將有助於微藻生物技術的發展，同吋，為水華赤潮的治理提供科學依據。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，提供一種微藻利用無機碳途徑的識別方法，以克服現有技術無法定量微藻利用無機碳途徑的不足。本發明採取以下技術方案它包括以下步驟第一，選擇兩種S13C值差值大於8%。的碳酸氫鈉作為同位素標記I和同位素標記2分別添加到培養液中來培養待測微藻；同位素標記I的碳酸氫鈉的δ 13C值為δ C1,同位素標記2的碳酸氫鈉的δ 13C值為δ。2 ;同時測定未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養液中無機碳δ 13C值為δ C(l ；
第二，待測微藻同時在被考察的培養條件下和在16 mM碳酸氫鈉和IOmM AZ的培養條件下培養4天後，分別測定兩種同位素標記的培養液培養的相對應的各培養條件下的、被考察微藻的穩定碳同位素組成S 13C的值δη、δΤ2、δτ1_ΑΖ和δΤ2_ΑΖ;
第三，通過方程& =計算出微藻各培養條件下利用添加的無機碳源的份額
OCl-OQfB;
第四，依據在16 mM碳酸氫鈉和IOmM AZ的培養條件下的待測微藻的穩定碳同位素值ST1-AZ或δΤ2_ΑΖ，依據方程Sa=STi- fBDi，計算微藻完全利用大氣中的ニ氧化碳途徑時藻體的δ 13C值為δ a ；
第五，依據在各培養條件下的待測微藻的穩定碳同位素值δτ1和δΤ2;微藻完全利用大氣中的ニ氧化碳途徑時藻體的S13C值Sa;微藻各培養條件下利用添加的無機碳源的份額も以及相應的同位素標記的碳酸氫鈉的W3C值δα與未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養液中無機碳δ 13Cft 的差Di的信息，代入方程fb= 1000 ( δ Ti- δ a- fBDi)/9中，計算微藻利用碳酸氫根離子途徑的份額fb，i-fb為微藻利用ニ氧化碳途徑的份額；
本發明的優點如下
自然界中碳元素有兩種穩定同位素=12C和13C,它們的天然平均豐度分別為98. 89%和 I.11%。穩定碳同位素組成通常用δ 13C (%。)表示，自然界中δ 13C的變化為-90%。、20%0。穩定碳同位素的強烈分餾特徵是識別微藻無機碳來源的基礎。質量平衡原理以及同位素混合模型和化學計量學方法，是定量識別微藻無機碳來源的基礎。微藻兩種無機碳利用途徑造成的同位素分餾差異有明顯不同。利用大氣中的ニ氧化碳途徑可造成最大的同位素分餾(S a)。碳酸氫根離子的直接轉運和依賴於胞外碳酸酐酶的碳酸氫根離子的間接轉運途徑造成的同位素分餾比利用大氣中的ニ氧化碳途徑造成同位素分懼小9%。(PDB)0こ醯唑胺(acetazolamide,AZ)是含1，3, 4_噻ニ唑環的雜環磺醯胺類碳酸酐酶胞外酶抑制劑。利用碳酸酐酶胞外酶抑制劑能夠專一地抑制碳酸酐酶胞外酶的特點，研究碳酸酐酶胞外酶活性被抑制下的微藻同位素變化，可以反向識別依賴於胞外碳酸酐酶的碳酸氫根離子的間接轉運途徑對無機碳利用的貢獻和份額。在依賴於胞外碳酸酐酶的碳酸氫根離子間接轉運途徑被抑制同時，碳酸氫根離子的直接轉運途徑也同時被抑制。高濃度碳酸氫鈉也對碳酸酐酶胞外酶有抑制作用，在高濃度碳酸氫鈉和IOmM AZ的作用下，依賴於胞外碳酸酐酶的碳酸氫根離子的間接轉運途徑和碳酸氫根離子的直接轉運途徑將同時被完全抑制。本發明採取如下的思路分別添加兩種δ 13C值差異懸殊的碳酸氫鈉同時培養待測微藻，測定藻體δ 13C值，利用兩端元的同位素混合模型獲取微藻利用來自於空氣的無機碳源和利用添加的無機碳源的份額，隨後分別添加兩種δ 13C值差異懸殊的、高濃度的碳酸氫鈉，在IOmM AZ的條件下培養待測微藻,測定藻體δ 13C值,獲取微藻完全利用大氣中的ニ氧化碳途徑造成的同位素分餾值(牝)，最後，根據上述信息，利用ニ端元的同位素混合模型，分別求出兩種途徑的份額。獲取無機碳源份額的原理
水體中總溶解的無機碳(DIC)存在四種形式co2、hco3_、h2co3和CO廣，並且它們存在著如下的化學平衡C02+H20 — H2CO3 — HC03_+H+ — C032_+2H+。無論是來源於空氣的無機碳還是添加的無機碳都有兩種無機碳——CO2和HCO3-供微藻利用。因此，可以利用兩端元的同位素混合模型獲取微藻利用來自於空氣的無機碳源和利用添加的無機碳源的份額。兩端元的同位素混合模型可以表示為
5 Ti= 5 Ai- fBi 5 Ai +fBi δ Bi (i=l，2,3，------) (I)這裡δπ為微藻的S13C值，δΜ為假定為微藻完全利用空氣的無機碳源時藻體的S13C值，S Bi為假定為微藻完全利用添加的無機碳源時藻體的S13C值，fBi為該考察微藻利用添加的無機碳源所佔的份額。很顯然，只知道δπ很難求出fBi，因此，本發明採用具有較大差異的S13C值碳酸氫鈉分別同時培養微藻，以穩定碳同位素雙標記來識別微藻利用添加的無機碳源的份額。對於同位素標記I (i=l)來說，方程(I)表示如下式
3 τι- δ A1_ fB1 δ A1 +fB1 δ B1 (2)
這裡Sn為用第一種已知S13C值的碳酸氫鈉培養的微藻藻體的S13C值，δΑ1為假定為微藻完全利用空氣的無機碳源時藻體的S 13C值，δΒ1為假定為微藻完全利用添加的無機碳源時藻體的δ 13C值，fB1為該考察微藻利用添加的無機為碳源所佔的份額。
3 T2- 3 A2 _ fB2 δ A2 +fB2 δ B2( 3 )
這裡St2為用第一種已知S13C值的碳酸氫鈉培養的微藻藻體的S13C值，δΑ2為假定為微藻完全利用空氣的無機碳源時藻體的S 13C值，δΒ2為假定為微藻完全利用添加的無機碳源時藻體的δ 13C值，fB2為該考察微藻利用添加的無機碳源所佔的份額。(2)和(3)兩個方程中 δ Α1= δ A2，fB=fBi= fB1= fB2，聯立求解
c δτ -δχ2,、
fB = -———(4)
OEl- OE2
(4)式中δΒ1-δΒ2_可以換算成同位素標記I的碳酸氫鈉的S13C值與同位素標記2的碳酸氫鈉的δ 13C值δ C2的差，則
P δτι-δτ2.ΓΛ
tB =--( 5 )
Oci - OC2
因此，可以通過測定同位素標記I的碳酸氫鈉的S13C值Sci與同位素標記2的碳酸氫鈉的S13C值，同時測定用對應的標記的碳酸氫鈉培養的微藻的S13C值，即測定出δτ1和δ Τ2值，依(5)式計算出該考察微藻利用添加的無機碳源所佔的份額。獲取微藻無機碳利用途徑份額的原理
無論是來源於空氣的無機碳還是添加的無機碳都有兩種無機碳一CO2和hco3_供微藻利用。因此，可以利用兩端元的同位素混合模型來獲取微藻兩種利用無機碳途徑的份額信
O兩端元的同位素混合模型可以表示為
5Ti=(l-fB) [(l-fb) 5a+fb(5a +9%0)]+fB [(l-fb) 5bi+fb(5bi +9%。)] (i=l，2) (6)這裡δ 為微藻的S13C值，Sa為微藻完全利用大氣中的ニ氧化碳途徑時藻體的S13C值，Sbi假定為微藻利用添加的無機碳源、完全進行ニ氧化碳途徑時藻體的S13C值，fb為該考察微藻利用碳酸氫根離子途徑所佔的份額。在這裡，Sbi-Sa可以換算成同位素標記的碳酸氫鈉的S13C值δα(或同位素標記I的碳酸氫鈉的S 13C值δ C1或同位素標記2的碳酸氫鈉的δ 13C值δ C2)與未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養液中無機碳S 13C值δω的差Di。因此，(6)式可簡化成
fb= 1000 (δΤ -δ3- ^)/9 (i=l,2) (7)微藻完全利用大氣中的ニ氧化碳途徑時藻體的S13C值，也即Sa賦值原理
在高濃度碳酸氫鈉和IOmM AZ的作用下，(7)式fb=0 也即 δ Ti- δ a- fBDj =0，
5 a=5 Ti- fBDi (i=l，2)(8)
綜合利用上述原理，可以快速定量微藻利用無機碳途徑；在完全相同的實驗條件下開展培養實驗，獲取微藻利用無機碳途徑份額的數據可靠，這是現有技術都無法做到的。
具體實施例方式
具體實施例方式第一步驟，測定不同廠家生產的碳酸氫鈉，選擇兩種S13C值差值大於8 %。的碳酸氫鈉作為同位素標記I和同位素標記2分別加到培養液中。同位素標記的碳酸氫鈉的δ 13C值記為δ α,其中同位素標記I的碳酸氫鈉的δ 13C值為δ C1,同位素標 記2的碳酸氫鈉的δ 13C值為δ。2。同位素標記的碳酸氫鈉的δ 13C值δ c與未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養液中無機碳S 13C值δ co的差為Di,其中D1為同位素標記I的碳酸氫鈉的δ 13C值δ C1與未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養液中無機碳δ 13C值δ co的差，D2為同位素標記2的碳酸氫鈉的δ 13C值δ C2與未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養液中無機碳s 13C值δω的差。第二步驟，同時用兩種同位素標記碳酸氫鈉的培養液分別同時在被考察的培養條件下和在16 mM碳酸氫鈉和IOmM AZ的培養條件下，培養被考察的微藻，4天後，同時分別測定兩種同位素標記的培養液培養的相對應的各培養條件下的、被考察微藻的穩定碳同位素
組成 S 13C 的值 δ Τ1、δ Τ2、δ Τ1_ΑΖ 和 δ Τ2_ΑΖ ；。第三步驟，將同位素標記I的碳酸氫鈉的S13C值作為δα，由同位素標記I培養的、各培養條件下的、被考察微藻的S13C值作為δτ1，同位素標記2的碳酸氫鈉的S13C值作為δ ca，由同位素標記2培養的、相對應的培養條件下的、被考察微藻的S13C值作為δ Τ2，
帶入& =，計算出各個培養條件下被考察微藻利用添加的無機碳源的份額fB，微藻
OCl- OC2
利用空氣的無機碳源份額為i-fB。第四步驟，依據在16 mM碳酸氫鈉和IOmM AZ的培養條件下培養的被考察微藻的穩定碳同位素值S Ti ( S X1-AZ或S T2-AZ ) ^依據方程:K= &計算微藻完全利用大氣中的ニ氧化碳途徑時藻體的S13C值sa。第五步驟，依據在各培養條件下的待測微藻的穩定碳同位素值δ ，其中在同位素標記I碳酸氫鈉培養下的待測微藻的穩定碳同位素值S T1，在同位素標記2碳酸氫鈉培養下的待測微藻的穩定碳同位素值S T2;微藻完全利用大氣中的ニ氧化碳途徑時藻體的W3C值δ a、微藻各培養條件下利用添加的無機碳源的份額fB以及相應的同位素標記的碳酸氫鈉的δ 13C值δ α (同位素標記I的碳酸氫鈉的δ 13C值δ C1或同位素標記2的碳酸氫鈉的S13C值δ。2)與未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養液中無機碳S13C值Scxi的差Di的信息，代入方程fb= 1000 ( δ Ti- δ a- fBDi)/9中，計算微藻利用碳酸氫根離子途徑的份額fb，i-fb為微藻利用ニ氧化碳途徑的份額。本發明的實施效果如下
培養材料為衣藻和小球藻。基本培養液採用SE培養基，基本培養條件為光周期L/D 12h/12h ，溫度25°C;光照強度為IOOMm0InT2s-SpH值8. O或8. 2 (用鹽酸和氫氧化鈉調節)。其它培養條件如表1，其中添加的碳酸氫鈉的S 13C分別為-26. 3%o (PDB) ( δ C1)和-16. 5%0(PDB) ( 5C2),16 mM碳酸氫鈉和IOmM AZ的培養條件是必需的。未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養液中無機碳S 13C值為-11.8%。(PDB)。待培養4天後，分別測定各培養條件和各實驗的微藻S 13C值。用本發明方法，得出衣藻和小球藻各個培養條件下利用添加的無機碳源的份額fB以及利用空氣的無機碳源份額l_fB，如表2。隨後，利用本發明，得出衣藻和小球藻各個培養條件下利用碳酸氫根離子途徑和利用ニ氧化碳途徑的份額，如表3。
表I衣藻和小球藻各培養實驗的培養條件
權利要求
1.一種微藻利用無機碳途徑的定量方法，其特徵包含以下步驟 第一，選擇兩種S13C值差值大於8 %。的碳酸氫鈉作為同位素標記I和同位素標記2分別添加到培養液中來培養待測微藻；同位素標記I的碳酸氫鈉的S 13C值為δα，同位素標記2的碳酸氫鈉的δ 13C值為δ。2 ;同時測定未添加碳酸氫鈉、完全來自空氣的原始培養液中無機碳S 13C值為Sai; 第二，待測微藻同時在被考察的培養條件下和在16 mM碳酸氫鈉和IOmM AZ的培養條件下培養4天後，分別測定兩種同位素標記的培養液培養的相對應的各培養條件下的、被考察微藻的穩定碳同位素組成S 13C的值δτ1、δΤ2、δτ1_ΑΖ和δΤ2_ΑΖ; 第三，通過方程
全文摘要
本發明公開一種微藻利用無機碳途徑的定量方法。現有技術無法定量微藻利用無機碳途徑。解決方法為分別添加兩種δ13C值差值大於8‰的碳酸氫鈉作為同位素標記1和同位素標記2到培養液中來培養待測微藻；待測微藻同時在上述條件下和在16mM碳酸氫鈉和10mMAZ的培養條件下培養4天後，測得δ13C值，計算出微藻各培養條件下利用添加的無機碳源的份額fB和完全利用大氣中的二氧化碳途徑時藻體的δ13C值δa，然後根據所得數據計算得到微藻利用無機碳的兩種途徑的份額。本發明可以快速定量微藻利用無機碳途徑；在完全相同的實驗條件下開展培養實驗，獲取微藻利用無機碳途徑份額的數據可靠，這是現有技術都無法做到的。
文檔編號C12Q1/06GK102827916SQ20121034844
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年8月9日
發明者吳沿友, 李海濤, 劉叢強, 王寶利, 梁小兵, 徐瑩, 謝騰祥 申請人:中國科學院地球化學研究所