純化萊鮑迪甙C的方法與流程
2023-09-20 17:45:30 1
純化萊鮑迪甙C的方法
背景技術：
南美多年生甜菊(SteviarebaudianaBertoni)由於其作為自然甜味劑而為人所知。甜菊植物的甜味是由於存在高甜度的甜糖苷。來源於甜菊的糖苷(甜菊糖苷)包括甜菊甙(4-13％乾重)，萊鮑迪甙(Rebaudioside)A(2-4％)，萊鮑迪甙C(1-2％)，杜爾可苷(dulcoside)A(0.4-0.7％)和痕量的甜菊雙糖甙、甜茶甙(rubusoside)和萊鮑迪甙B、D、E及F(Kinghorn(2002)Kinghorn(ed.)Stevia，甜菊屬藥用和芳香植物-工業簡介(theGenusStevia.MedicinalandAromaticPlants-IndustrialProfiles)，第19卷TaylorandFrancis，LondonandNY)。在這些苷類之中，現在僅有甜菊甙和萊鮑迪甙A商業上可大量提供。製造甜菊甙和萊鮑迪甙A的原料為多年生灌木的碎葉。獲得包含甜菊糖苷(steviolglycoside)的萃取物的常規萃取方法公開於按照如下類似方法的文獻中：甜菊葉用熱水或醇類萃取，萃取物通過用鹽或鹼溶液沉澱和濃縮來純化，且萃取物再溶解於低級醇(甲醇或乙醇)中以結晶該苷類。已開發出用於萃取萊鮑迪甙C的方法。WO2011/037959公開了純化萊鮑迪甙C的方法，通過在混合溶劑(95％EtOH/MeOH/H2O＝12.5/6/2)，或(95％丙醇/MeOH＝12.5/7.5)中回流甜菊粗萃取物固體或粗萊鮑迪甙C固體。溶液接下來冷卻至22℃並用93-98％純的萊鮑迪甙C晶體作為晶種。所得的混合物在22℃下放置16小時，並且過濾白色的晶體產品，用EtOH/MeOH(4/1)混合物洗滌兩次並乾燥得到純的萊鮑迪甙C產品。該方法主要的缺點在於需要高純度的萊鮑迪甙C以誘導純化。另外，該方法的產率以及所得物質的純度未公開。中國專利No.102127130公開了純化萊鮑迪甙C的方法，通過將包含大約17％的萊鮑迪甙C的粗溶液通過超濾膜以生成具有26％萊鮑迪甙C含量的餾分。該餾分在55℃下濃縮直至固體含量達到40％。然後，液體和固體進行分離，使得固體中包含大約33％的萊鮑迪甙C。該粗品萊鮑迪甙C通過在混合溶劑(87％EtOH/68％MeOH/87％丙酮＝3/2/1)中重結晶而進一步純化，所得萊鮑迪甙C的純度為85.4％。用來生產和純化萊鮑迪甙C的常規方法需要多個反應步驟或反覆純化步驟。需要一種用於製備高純度萊鮑迪甙C的簡單、有效和經濟的方法，所述萊鮑迪甙C可用於食品、飲料、藥品、化妝品和其他工業。發明概述本發明涉及一種純化萊鮑迪甙C的方法。本發明的方法包括以下步驟：(a)用乙酸乙酯和1-丁醇的溶液萃取包含萊鮑迪甙C和減少的萊鮑迪甙A的物質；(b)保留乙酸乙酯和1-丁醇的可溶部分；(c)將乙酸乙酯和1-丁醇可溶部分與丙酮和水的溶液接觸以重結晶萊鮑迪甙C；以及(d)收集重結晶的萊鮑迪甙C從而純化萊鮑迪甙C。在一些實施方式中，乙酸乙酯∶1-丁醇的比例為60-70∶30-40，以及丙酮∶水的比例為80-90∶10-20。在其它實施方式中，包含萊鮑迪甙C和減少的萊鮑迪甙A的物質為四氫呋喃和水的溶液，其中四氫呋喃∶水的比例為20-30∶70-80。在進一步的實施方式中，該方法包括用乙酸乙酯∶1-丁醇(80-90∶10-20)的第一溶液萃取包含萊鮑迪甙C和減少的萊鮑迪甙A的物質的預步驟，並丟棄掉乙酸乙酯∶1-丁醇可溶部分。在更進一步的實施方式中，該方法包括將重結晶萊鮑迪甙C進行第二次重結晶的額外步驟，其中第二次重結晶使用1-丁醇∶水(97∶3)的溶液。在另一個實施方式中，重結晶的萊鮑迪甙C使用丙酮∶水(85∶15)的溶液洗滌。發明詳述如表1所示，對萊鮑迪甙A生產過程中產生的廢料進行HPLC分析，其包含大約17％的萊鮑迪甙A和20％的萊鮑迪甙C以及其他苷類。表1保留時間(分鐘)組分總百分比15.974未知16.1321.631未知1.9522.194未知0.1924.425萊鮑迪甙A17.1824.840甜菊甙20.7925.801未知0.2726.187萊鮑迪甙F2.8826.800萊鮑迪甙C20.9827.444杜爾可甙A2.7427.854未知0.2728.451甜菊甙異構體2.9030.420甜茶甙1.6832.133未知5.9033.221甜菊雙糖甙6.14已知在″廢料″中的萊鮑迪甙C百分比高，而且萊鮑迪甙C可用作甜味劑，本發明特徵在於一種獲得高純度萊鮑迪甙C的方法，起始自在萊鮑迪甙A生產過程中所產生的″廢料″。根據本發明的方法，包含萊鮑迪甙C和減少的萊鮑迪甙A的物質使用乙酸乙酯/1-丁醇的溶液進行萃取，以及保留乙酸乙酯/1-丁醇的可溶部分。然後，萊鮑迪甙C從乙酸乙酯/1-丁醇可溶部分用丙酮/水溶液重結晶，以及收集重結晶的萊鮑迪甙C。有利地，本發明的方法在不存在純的萊鮑迪甙C晶體作晶種下進行。在本方法的上下文中使用的，″一種包含萊鮑迪甙C和減少的萊鮑迪甙A的物質″為起始原料，尤其是甜菊萃取物或甜菊萃取物餾分，其中已除去全部或部分的萊鮑迪甙A。在一個實施方式中，本發明方法的起始原料中40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的原始量的萊鮑迪甙A已除去。為了說明，其中甜菊葉具有為萊鮑迪甙C(1-2％)至少兩倍量的萊鮑迪甙A(2-4％)，包含萊鮑迪甙C和減少的萊鮑迪甙A的原料可包含等量的萊鮑迪甙C和萊鮑迪甙A，或萊鮑迪甙A少於萊鮑迪甙C。在一些實施方式中，本發明的方法的起始原料為″來自甜菊的物質″，其包含萊鮑迪甙C和減少的萊鮑迪甙A。在其它的實施方式中，起始原料為甜菊萃取物或通過常規方法製備的甜菊萃取物的餾分。起始原料可以固體、半固體或液體形式獲得。當為固體或半固體形式時，理想的是將起始原料溶於合適的溶劑中以便於液相-液相萃取。在該方面，特定的實施方式包含起始原料，所述起始原料為包含萊鮑迪甙C和減少的萊鮑迪甙A的溶液。如本文所述，固體起始原料易於溶於四氫呋喃(THF)和水的溶液。因此，預期具有與THF類似極性的溶劑，如乙酸正丁酯、異丁醇、甲基異戊基酮或正丙醇，也可用於本發明的方法作為溶解起始原料的溶劑。然而，在特定實施方式中，起始原料溶於四氫呋喃(THF)和水的溶液。按照該實施方式，THF與水的比例為20-30∶70-80(體積/體積(v/v))的範圍。在優選實施方式中，THF與水的比例為25∶75(v/v)。為了富集萊鮑迪甙C，對起始原料進行液相-液相萃取。按照本發明的方法的該步驟，起始原料用一種或多種乙酸乙酯和1-丁醇的溶液萃取一遍或多遍。在一些實施方式中，起始原料用包含乙酸乙酯/1-丁醇的溶液萃取一遍或多遍，其中乙酸乙酯和1-丁醇的比例為60-70∶30-40(v/v)。特別的，該實施方式包含乙酸乙酯和1-丁醇的比例為75∶35(v/v)。在其它實施方式中，低極性化合物首先通過用包含乙酸乙酯/1-丁醇的溶液萃取起始原料一遍或多遍而除去，其中乙酸乙酯和1-丁醇的比例為80-90∶10-20(v/v)。按照該實施方式，拋棄乙酸乙酯/1-丁醇可溶部分且保留物用乙酸乙酯和1-丁醇的第二溶液進一步萃取。因此，在一個實施方式中，用乙酸乙酯/1-丁醇的溶液萃取起始原料包括以下步驟：(i)用包含60-70∶30-40比例的乙酸乙酯和1-丁醇的溶液萃取起始原料；以及(ii)保留(i)中的乙酸乙酯/1-丁醇餾分。在可選擇的實施方式中，用乙酸乙酯/1-丁醇的溶液萃取起始原料包括以下步驟：(i)用包含80-90∶10-20比例的乙酸乙酯和1-丁醇的第一溶液萃取起始原料，(ii)拋棄乙酸乙酯/1-丁醇餾分；(iii)用包含60-70∶30-40比例的乙酸乙酯和1-丁醇的第二溶液萃取(ii)中的保留物；以及(iv)保留(iv)的乙酸乙酯/1-丁醇餾分。當起始原料能用乙酸乙酯/1-丁醇溶液萃取時，可使用其它的合適溶劑，包括例如2-丁酮、正丙醇、乙酸正丁酯和異丙醇，單獨使用或彼此聯合或與乙酸乙酯或1-丁醇聯合使用。根據本發明方法的下一個步驟，液相-液相萃取的物質或乙酸乙酯和1-丁醇可溶部分與丙酮和水的溶液接觸以重結晶萊鮑迪甙C。在一些實施方式中，丙酮與水的比例為80-90∶10-20(重量/重量(w/w))。在某些實施方式中，丙酮與水的比例為85∶15(w/w)。除了丙酮，預期其它的溶劑例如乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、2-丁醇、叔丁醇或其混合物可用於重結晶萊鮑迪甙C。為了便於重結晶，混合物可加熱至40℃至60℃的升高的溫度，或更優選在45℃至50℃之間，以及然後冷卻至接近室溫(例如19-22℃)。形成晶體時，例如，通過過濾收集重結晶的萊鮑迪甙C，且可乾燥用於儲存。在另一個實施方式中，重結晶的萊鮑迪甙C可洗滌以進一步富集萊鮑迪甙C。按照該實施方式，重結晶的萊鮑迪甙C用比例為85∶15的丙酮∶水溶液洗滌。混合物可加熱至40℃至60℃的升高的溫度，或更優選在45℃至50℃之間持續約1至3小時，更優選2小時，然後冷卻至接近室溫(例如19-22℃)。然後過濾混合物以收集固體萊鮑迪甙C。通過包括該步驟，萊鮑迪甙C的量可富集至大於90％。在進一步的實施方式中，本發明的方法可包括將重結晶的萊鮑迪甙C進行第二次重結晶的步驟，其中第二次重結晶為1-丁醇∶水(97∶3)的溶液。按照本發明的方法純化的萊鮑迪甙C為70-100％勻質萊鮑迪甙C，且發現可在多種食品、膳食補充劑、營養食品、藥物組合物、口腔衛生組合物、餐桌甜品和化妝品中用作甜味劑。另外本發明的萊鮑迪甙C可用於製備消耗品，例如食物和藥品，其保留了合意的甜度但含有較少量的碳水化合物甜味劑，例如蔗糖，且在某些情況下更少的卡路裡。本發明通過以下非限制實施例更詳細的描述。實施例1；從粗萃取物中初始純化萊鮑迪甙C用多種不同的溶劑體系，觀察到丙酮和水的混合物為從粗起始原料(即，產生於萊鮑迪甙A生產工藝中的″廢料″)中重結晶萊鮑迪甙C的適宜溶劑。因此，測定從起始原料中重結晶萊鮑迪甙C的收率。對於這些實驗，粗起始原料與丙酮/水(85/15，w/w)混合。典型地，對於1g的固體，使用4-6g的溶劑。混合物加熱至48℃並且使得所有固體溶解。混合物冷卻至室溫並攪拌3-4天。過濾溶液收集白色沉澱，其然後用丙酮洗滌並在真空下50℃乾燥8小時。表2粗起始原料的量粗品中RebC含量獲得固體的量固體中RebC含量RebC回收收率5g24.5％0.9g77.0％56.6％5g32.5％1.4g69.6％60.0％5g32.5％1.3g76％60.8％20g32.5％5.2g75.6％60.5％6.0g36.4％1.84g76.8％64.7％6.84g40.7％2.37g74.3％63.2％16g44.0％6.34g80.0％72.0％14g44.0％6.08g81.7％80.6％RebC，萊鮑迪甙C.該分析顯示″廢料″用於直接重結晶萊鮑迪甙C時不是最適宜的，且包含更高含量的萊鮑迪甙C的起始原料，所得固體具有更高的純度及收率。因此，為了增加純度和收率，起始原料用不同溶劑進行液相-液相萃取。20克的萊鮑迪甙C起始原料溶解於含有70-80的水(v/v)的500ml丙酮中。溶液用500ml含有15％的1-丁醇(v/v)的乙酸乙酯萃取兩遍。1-丁醇/乙酸乙酯層主要含有極性較小的化合物並因此而拋棄。然後，丙酮/水相用500ml含有30-40％的1-丁醇(v/v)的乙酸乙酯進一步萃取兩遍。乙酸乙酯/1-丁醇層合併，且在真空下濃縮以提供富集的萊鮑迪甙C物質。所得產率和用丙酮/水和乙酸乙酯/1-丁醇進行液相-液相萃取的含量列於表3中。表3在其它一系列實驗中，20克的起始原料溶解於500ml的THF中，其含有65-80的水(v/v)。溶液用500ml的含有15％的1-丁醇(v/v)的乙酸乙酯萃取兩遍。乙酸乙酯/1-丁醇層主要含有極性較小的化合物並因此而拋棄。然後，THF/水相用500ml含有30-40％的1-丁醇的乙酸乙酯(v/v)進一步萃取兩遍。1-丁醇/乙酸乙酯層合併，且在真空下濃縮以提供富集的萊鮑迪甙C物質。所得產率和用THF/水和乙酸乙酯/1-丁醇進行液相-液相萃取的含量列於表4中。表4該分析顯示當使用THF/水作為起始原料的溶劑時，萊鮑迪甙C的含量和回收最高，其中THF∶水的比例在20-30∶70-80範圍內。另外，該分析顯示合適的乙酸乙酯∶1-丁醇比例在60-70∶30-40的範圍內。實施例2：純化萊鮑迪甙C20克的起始原料溶解於500ml含有70-80％(優選75％(v/v))的水的THF/水混合物中。所得溶液用500ml的乙酸乙酯/1-丁醇混合物(85/15，v/v)萃取兩遍。除去1-丁醇/乙酸乙酯層。然後，THF-水相進一步用500ml的乙酸乙酯/丁醇混合物萃取兩遍，該混合物含有30-40％的1-丁醇，優選35％(v/v)。合併兩遍萃取的乙酸乙酯/丁醇層並在真空下濃縮以得到8.70g的物質。通過HPLC分析確定該物質中萊鮑迪甙C的含量達到24.5％(表5)。表5保留時間(分鐘)組分總百分比12.702未知1.1015.722未知4.6218.547未知4.2022.811未知1.0624.473萊鮑迪甙A16.7324.931甜菊甙25.2625.780未知0.1526.197萊鮑迪甙F2.8126.968萊鮑迪甙C24.5027.562杜爾可甙A3.4427.951未知0.2228.579甜菊甙異構體3.7130.543甜茶甙9.2032.216未知2.7233.485甜菊雙糖甙0.26使用丙酮/水混合物，其含有10％至20％的水(重量)，優選15％，觀察到液相-液相的萃取物質適宜用於重結晶。5克的液相-液相萃取物質(萊鮑迪甙C含量24.5％)與27.5g的丙酮/水(15/85，w/w)混合，混合物加熱至48℃。得到的澄清溶液冷卻至室溫(即，19-22℃)並攪拌4天。過濾溶液收集白色沉澱，其然後用丙酮洗滌並在真空下50℃乾燥8小時。通過HPLC分析確定，觀察到重結晶物質(0.9g)具有萊鮑迪甙C的含量為76.98％(表6)。並且，萊鮑迪甙C的回收率為56.6％。表6保留時間(分鐘)組分總百分比18.712未知2.3424.363萊鮑迪甙A6.8224.781甜菊甙6.5926.193萊鮑迪甙F0.8527.015萊鮑迪甙C76.9827.557杜爾可甙0.7527.995未知0.3928.578甜菊甙異構體0.9230.566甜茶甙0.7631.325萊鮑迪甙B2.08萊鮑迪甙C的純度可進一步通過第二次重結晶來提高。第二次重結晶包括將2克的來自第一次重結晶的物質與27.5g的1-丁醇/水(97/3，w/w)混合，並加熱混合物至78℃。得到的澄清溶液冷卻至室溫(即，19-22℃)並靜置2天。過濾溶液收集白色沉澱，其然後用丙酮洗滌並在真空下50℃乾燥8小時。通過HPLC分析確定，第二次重結晶得到1.1克的萊鮑迪甙C含量為93.0％的物質(表7)，並且回收率為78.7％。表7保留時間(分鐘)組分總百分比24.082萊鮑迪甙A5.30％26.530萊鮑迪甙C93.0％27.599杜爾可甙A0.37％32.201未知1.38％而且，萊鮑迪甙C的純度可通過包括一個洗滌步驟來進一步提高。洗滌步驟包括將5克的來自第一次重結晶的物質與100g的丙酮/水(85/15，w/w)混合，並加熱混合物至58℃。混合物回流2小時並冷卻至室溫(即，19-22℃)並靜置16小時。過濾溶液收集白色沉澱，其然後用丙酮洗滌並在真空下50℃乾燥8小時。通過HPLC分析確定，洗滌步驟得到3.6克的萊鮑迪甙C含量為91.1％的物質(表8)，並且回收率為84.3％。表8保留時間(分鐘)組分總百分比25.362萊鮑迪甙A3.6325.641甜菊甙0.6826.264萊鮑迪甙F0.8326.658萊鮑迪甙C91.1227.048杜爾可甙1.7527.419甜菊甙異構體0.6529.825未知1.35