一種從骨實質中分離間充質幹/祖細胞的方法
2023-08-22 08:53:36 1
專利名稱：一種從骨實質中分離間充質幹/祖細胞的方法
技術領域：
本發明涉及分離幹細胞的方法，特別是涉及一種從骨實質中分離間充質幹/祖細胞的方法。
背景技術：
間充質幹細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中的非造血幹細胞，具備向成骨、成軟骨和成脂肪細胞分化的能力，具有免疫調節和造血支持作用。因此，MSC不但是組織工程化骨和軟骨構建中重要的種子細胞，而且由於MSC促進造血重建和抑制移植物抗宿主反應功能，在造血細胞移植中也具有廣泛的應用前景。MSC具有體外貼壁生長特性，利用細胞的貼壁性能，人們已經從人、犬、兔、大鼠、雞、綿羊、山羊、豬和牛骨髓中，成功分離出MSC。
將人或牛等其他動物骨髓細胞體外培養時，貼壁的細胞群體中含有間充質幹/祖細胞(mesenchymal stem/progenitor cells，MSPC)、內皮細胞和血細胞。由於培養體系中血清濃度較低，且經過嚴格篩選，體系中未添加內皮細胞生長因子或其他細胞因子，不利於內皮細胞和血細胞增殖。因此，隨著培養傳代進行，MSPC成為貼壁層中的主要成分，所佔比例在90％以上。小鼠是開展有關MSPC細胞生物學研究的理想模型，然而，利用文獻方法進行小鼠骨髓體外培養時，由於血細胞不易從貼壁層中去除，建立MSPC培養體系十分困難。最近的研究表明，人和小鼠骨實質中存在MSPC，為分離培養小鼠MSPC提出了新的途徑。本發明發明人曾利用小鼠骨碎片和骨髓細胞共同培養的方法，以純化骨髓中的間充質幹/祖細胞，獲得了比較滿意的結果(Sun S，Guo Z，Xiao X，et al.Isolation of mouse marrow mesenchymal progenitors by a novel and reliablemethod.Stem Cells 2003；21527-35)。但是所獲得細胞中仍然含有相當數量的CD45+細胞，而且，相當數量為鹼性磷酸酶陽性的成骨細胞。因此可以認為，採用上述方法所得到的貼壁細胞群中不但有血細胞的殘存，而且，部分細胞可能不是真正的幹細胞。
發明內容
本發明的目的是提供一種實用簡單的從骨實質中分離間充質幹/祖細胞的方法。
本發明所提供的從骨實質中分離間充質幹/祖細胞的方法，包括如下步驟1)用膠原蛋白酶溶液消化骨片；2)將消化後的骨片在培養基中培養，去除非貼壁細胞，得到貼壁細胞，即為所述的間充質幹/祖細胞。
其中，步驟1)所述骨片大小為1-2mm，在消化前經過含5-15％體積胎牛血清的PBS緩衝液衝洗。常用骨片為小鼠股骨片，此時得到的細胞為小鼠MSPC細胞。步驟1)常用的膠原蛋白酶為膠原蛋白酶II，其重量百分濃度為0.1-0.15％，溶劑為含有15-20％體積胎牛血清的α-MEM培養基。
步驟2)所述培養基為含有1-2mmol/L穀氨醯胺，10％體積胎牛血清的α-MEM培養基；培養條件為35-38℃、5％CO2，培養時間為2-3天。
將所得到的MSPC細胞利用低血清體系進行傳代培養，細胞體外增殖旺盛，最終從每根股骨可獲得6×107以上細胞，可完全滿足一般細胞生物學實驗所需數量。
本發明方法操作簡單，方便實用，所得到間充質幹/祖細胞純度高，沒有血細胞和內皮細胞殘存；分化性能好，具有向成骨細胞、成軟骨細胞和成脂肪細胞等細胞分化的能力。本發明建立了穩定實用的MSPC細胞純化培養技術體系，為開展MSPC細胞的研究奠定了基礎。
圖1為MSPC培養照片；圖2A-圖2I為消化骨片培養獲得的MSPC細胞的流式細胞分析結果；圖3A-圖3I為消化細胞培養獲得的細胞的流式細胞分析結果；圖4A-圖4F為誘導MSPC細胞組織化學染色照片；圖5A-圖5C為誘導MSPC細胞RT-PCR的電泳照片。
具體實施例方式
實施例1、小鼠間充質幹/祖細胞的分離和鑑定一、小鼠間充質幹/祖細胞(MSPC)的分離1、實驗材料實驗動物2-4周齡雌性C57BL/6小鼠，購於軍事醫學科學院動物中心，實驗動物使用符合軍事醫學科學院實驗動物指南；實驗試劑膠原蛋白酶II和α-MEM購自GIBCO公司，胎牛血清(FCS)為加拿大Hyclone公司產品，經篩選後使用；各種單克隆抗體購於PharMingen公司；膠原蛋白酶II溶於含20％FCS(體積百分比)的α-MEM中，使用濃度為0.1％(重量百分比)。
2、實驗方法
1)骨片消化及接種無菌條件下取小鼠股骨，剔除肌肉及肌腱組織，用含10％體積FCS的PBS緩衝液衝洗骨髓腔至骨轉為白色，然後將骨剪為大小2毫米的碎片，置入含0.1％膠原蛋白酶II中，37℃振蕩消化2小時，振蕩頻率為200rpm。去除消化下來的細胞懸液，洗滌骨碎片，將骨片置37℃、5％CO2條件下進行培養，所用培養基為含2mM穀氨醯胺，10％FCS(體積百分比)的α-MEM，骨片密度為每75cm2(細胞培養瓶內表面積)接種2根股骨碎片。3天後換液，去除非貼壁細胞，貼壁細胞即為小鼠MSPC細胞。
作為對比，將消化下來的細胞懸液也在相同條件下進行培養，其接種密度為5×105/cm2(細胞培養瓶內表面積)。
2)細胞培養及傳代貼壁層形成後，用0.05％胰蛋白酶/2mM EDTA消化，細胞計數，然後按3000細胞/cm2進行傳代培養；之後，細胞密度達50％左右時進行消化傳代。
其他如人、犬、兔、大鼠、雞、綿羊、山羊、豬和牛等動物的MSPC細胞可以採用以上相同的過程從其骨實質中分離培養得到。
二、小鼠間充質幹/祖細胞(MSPC)的鑑定除特殊說明的外，鑑定對象為本發明方法得到的細胞。
1、細胞生長情況將骨碎片培養24小時後，即可在骨片周圍發現少許成纖維細胞樣貼壁細胞，48小時出現由數個細胞組成的小集落，72小時時集落由十數個細胞組成。培養約5天時細胞形成70-80％融合的貼壁層，結果如圖1。
2、流式細胞學分析將所得小鼠MSPC細胞和消化細胞培養獲得的細胞分別傳代培養3代後收集細胞，按0.5μg/1×106細胞分別加入PE或FITC標記抗CD29、CD31、CD34、CD45、CD105、Sal-1等單克隆抗體，室溫反應30分鐘，PBS洗滌兩次後，用流式細胞儀檢測，每個反應至少收集10000個點數據，以相應同型抗體管為陰性對照。
圖2A-圖2I分別為用本發明方法消化骨片培養獲得的MSPC細胞與CTL-FITC(陰性對照)，CD45-FITC，Scal-1-FITC，H2b-FITC，CD31-FITC，CTL-PE(陰性對照)，CD34-PE，CD44-PE，CD29-PE的分析結果(縱坐標細胞數；橫坐標相對螢光強度)。由圖可見，通過消化骨片培養獲得的MSPC細胞均一表達CD29、CD44和Scal-1(圖2C、圖2H、圖2I)，提示為一群幹/祖細胞；不表達CD31、CD34和CD45(圖2F、圖2D、圖2B)，表明細胞群體中沒有血細胞和內皮細胞殘存。
圖3A-圖3I分別為消化細胞培養獲得的細胞與CTL-FITC(陰性對照)，CD45-FITC，Scal-1-FITC，H2b-FITC，CD31-FITC，CTL-PE(陰性對照)，CD34-PE，CD44-PE，CD29-PE的分析結果，由圖3組可見，採用消化細胞懸液培養得到的細胞表面抗原譜與本發明方法通過消化骨片培養獲得的MSPC細胞類似，但是，與MSPC細胞不同的是，該細胞群體中有相當比例細胞表達CD45(圖3B)，即使傳代5次後仍有部分細胞為CD45陽性，說明其中還含有部分血細胞。
3、MSPC細胞的誘導分化及組織化學鑑定按文獻方法(Sun S，Guo Z，Xiao X，et al.Isolation of mouse marrow mesenchymalprogenitors by a novel and reliable method.Stem Cells 2003；21527-35)進行所得小鼠MSPC細胞的誘導分化成骨分化體系包括抗壞血酸磷酸鹽、地塞米松和β磷酸甘油；應用含轉化因子-β(TGF-β1)的無血清體系、微球培養法誘導向成軟骨細胞分化；脂肪分化體系包括地塞米松和胰島素。
1)組織化學染色鑑定以未加誘導體系的細胞為對照，利用鹼性磷酸酶和von Kossa染色鑑定成骨細胞，阿爾辛藍染色顯示細胞外蛋白聚糖鑑定成軟骨細胞，油紅O染色鑑定脂肪細胞類型。圖4A-圖4F依次為成骨誘導前、成骨誘導後、軟骨誘導前、軟骨誘導後、脂肪誘導前、脂肪誘導後細胞的染色照片，結果表明，培養細胞具有體外成骨、成軟骨和成脂肪能力。
2)RT-PCR鑑定收集誘導細胞，應用Trizol試劑(GIBICO/BRL)提取細胞總RNA，以之為模板進行RT-PCR，反轉錄及cDNA擴增按mRNA選擇性RT-PCR試劑盒(購於Takarashuzo)說明書進行，引物序列如表1所示。
表1.RT-PCR引物序列及其特異性
圖5A-圖5C分別為小鼠MSPC細胞誘導為成脂肪細胞、誘導為成骨細胞、誘導為成軟骨細胞的PR-PCT電泳照片，其中，泳道1為誘導前細胞，泳道2為誘導後細胞；結果表明，體外誘導後細胞能表達系列特異性mRNA成脂肪誘導後細胞表達PPAR-γ，成骨誘導後細胞表達骨鈣素，成軟骨誘導後細胞表達II型膠原蛋白，說明所得到的MSPC細胞具有成骨、成軟骨和成脂肪能力，符合公認的MSC標準。
應用常規誘導體系培養本發明方法所獲得的MSPC細胞，經組織化學染色和RT-PCR鑑定細胞類型，結果顯示，MSPC具有向成骨細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞分化的能力，證實本發明方法所得的MSPC具有幹細胞特點。
權利要求
1.一種從骨實質中分離間充質幹/祖細胞的方法，包括如下步驟1)用膠原蛋白酶溶液消化骨片；2)將消化後的骨片在培養基中培養，去除非貼壁細胞，得到貼壁細胞即為所述的間充質幹/祖細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟1)所述骨片大小為1-2mm；所述骨片為小鼠股骨片。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟1)所述骨片在消化前還經過含5-15％體積胎牛血清的PBS緩衝液衝洗。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟1)所述膠原蛋白酶為膠原蛋白酶II。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於步驟1)所述膠原蛋白酶II溶液的重量百分濃度為0.1-0.15％，溶劑為含有15-20％體積胎牛血清的α-MEM培養基。
6.根據權利要求1-5任一所述的方法，其特徵在於步驟2)所述培養基為含有1-2mmol/L穀氨醯胺，10％體積胎牛血清的α-MEM培養基。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於步驟2)所述培養的培養條件為35-38℃、5％CO2，培養時間為2-3天。
8.根據權利要求6述的方法，其特徵在於步驟2)所述貼壁細胞還經過傳代培養。
9.根據權利要求7的方法，其特徵在於步驟2)所述貼壁細胞還經過傳代培養。
10.根據權利要求1-5任一所述的方法，其特徵在於步驟2)所述貼壁細胞還經過傳代培養。
全文摘要
本發明公開了一種從骨實質中分離間充質幹/祖細胞的方法。本發明所提供的從骨實質中分離間充質幹/祖細胞的方法，包括如下步驟1)用膠原蛋白酶溶液消化骨片；2)將消化後的骨片在培養基中培養，去除非貼壁細胞，得到貼壁細胞，即為所述的間充質幹/祖細胞。本發明方法操作簡單，方便實用，所得到間充質幹/祖細胞純度高，沒有血細胞和內皮細胞殘存；分化性能好，具有向成骨細胞、成軟骨細胞和成脂肪細胞等細胞分化的能力。本發明建立了穩定實用的小鼠MSPC細胞純化培養技術體系，為開展MSPC細胞的研究奠定了基礎。
文檔編號C12N5/06GK1673358SQ20051005526
公開日2005年9月28日 申請日期2005年3月17日 優先權日2005年3月17日
發明者李秀森, 李紅, 郭子寬, 於曉妉, 毛寧 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所