miRNAs作為調節胰島素敏感性的靶標的新用途的製作方法

2023-08-22 09:08:46 2

專利名稱：miRNAs作為調節胰島素敏感性的靶標的新用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術和藥學領域；更具體地，本發明涉及若干個microRNAs,特別是miR-181a作為 調節胰島素敏感性的靶標的新用途。
背景技術：
糖尿病是一種常見的危害人類健康的慢性代謝疾病。根據糖尿病的發病機制，可將糖尿病分為I型糖尿病和2型糖尿病。I型糖尿病主要由於自身免疫性失常而導致胰腺中胰島β細胞受損,進而引起胰島分泌不足。2型糖尿病是糖尿病的主要形式，發病率佔糖尿病的90%以上，其特點是胰島素刺激的靶組織出現胰島素抵抗症狀。胰島素的主要功能為降低血糖水平，促進骨骼肌和脂肪對葡萄糖的吸收，同時抑制肝臟中的糖異生。當機體不能夠對正常濃度的胰島素產生適當的響應時即產生所謂的胰島素抵抗。胰島素抵抗會導致胰島素分泌代償性增加，長此以往會逐漸導致胰島β細胞功能的衰竭。肝臟作為胰島素作用的主要靶器官，在維持空腹狀態下內源性葡萄糖的生成、輸出以及進食後葡萄糖的吸收、利用和儲存等方面發揮著重要作用。肝臟胰島素抵抗主要指胰島素抑制肝細胞葡萄糖生成、肝糖異生和糖原降解的能力下降，這在很大程度上可導致空腹血糖的升高並持續刺激胰島細胞分泌胰島素。肝臟特異性敲除胰島素受體底物Irsl或lrs2的小鼠分別在進食後或在禁食階段表現出顯著的胰島素抵抗，證明肝臟胰島素抵抗在高血糖、糖耐量異常和糖尿病中發揮著重要作用。胰島素抵抗的發生成因複雜，受環境、遺傳等多種因素影響，目前改善胰島素抵抗依然是當前治療2型糖尿病的主要方法之
OSIRTl是一種保守的NAD+依賴性去乙醯化酶，屬於哺乳動物Sirtuin家族成員之一，可使多種底物去乙醯化，行使廣泛的生物學作用。目前對SIRTl的功能研究發現，它具有延長酵母、線蟲和果蠅等多種生物壽命的功能。SIRTl在哺乳動物的肝臟、脂肪、肌肉、腎臟等多種器官和組織中廣泛表達，並參與調節血糖平衡和胰島素分泌等重要的生理過程。目前越來越多研究表明SIRTl對胰島素敏感性和2型糖尿病的具有改善作用，很可能成為治療2型糖尿病的潛在分子靶標。在骨骼肌細胞、脂肪細胞和肝臟細胞中，SIRTl均顯示出對胰島素信號通路的正向調節作用。轉基因過表達SIRTl的2型糖尿病模型db/db小鼠和高脂誘導的肥胖小鼠均表現出糖耐量和胰島素敏感性的改善。口服給予高脂飲食誘導的老年小鼠，劑量為22. 4mg/kg/天的SIRTl激動劑白藜蘆醇，能夠改善其胰島素敏感性，並使其體重發生略微的下降。白藜蘆醇和其他的一些SIRTl的小分子激動劑，例如SRT1720等，同樣顯示出可預防飲食誘導的肥胖和減輕胰島素抵抗的特性。因此，SIRTI在胰島素抵抗相關疾病如2型糖尿病、肥胖症等代謝疾病的發生、發展過程中有重要的作用，日後對於SIRTl調控因子的研究將為改善胰島素抵抗和治療2型糖尿病提供新的思路。在肝臟中，SIRTl被認為參與調控葡萄糖體內平衡。SIRTl可以去乙醯化過氧化物酶增殖體受體Y輔活化因子I α (peroxisome proliferator-activatedreceptor y coactivator-lalpha, PGC-1 a )。PGC-1 a是核受體過氧化物酶增殖體受體Y (peroxisome proliferator-activated receptor y , PPAR γ )的一種轉錄輔活化因子，可在基因轉錄水平上調控肝臟中葡萄糖代謝。SIRTl通過去乙醯化PGC-Ia使糖異生基因表達增加，同時抑制糖酵解基因的表達，從而誘導肝糖輸出，調控肝臟的葡萄糖代謝。在胰島素抵抗的肝細胞H 印G2中，SIRTl蛋白水平降低，並且下調或抑制SIRTl可降低HepG2細胞中胰島素受體磷酸化水平及糖原合成能力對胰島素的響應，誘導產生胰島素抵抗。在發生胰島素抵抗的小鼠肝臟中用腺病毒過表達SIRTl可以緩解脂肪肝和胰島素抵抗(Li，Y.，et al. ,Hepatic overexpression of SIRT Iin mice attenuates endoplasmic reticulumstress and insulin resistance in the liver. FASEB J,2011)o目前，一類參與基因轉錄後調控的非編碼小RNA-microRNAs引起了越來越多生物學家的興趣，成為現今生命科學領域的研究熱點。從microRNAs的表達和生物學產生兩個方面可以從如下幾個標準對其進行定義①成熟的miRNA是約有22個核苷酸長度，通過RNA印跡(Northern blot)可檢測到的內源非編碼RNA 成熟的microRNAs來源於具有特定二級莖環結構的前體(pre-miRNA) 成熟的microRNAs由Dicer酶不對稱加工形成,在Dicer酶缺陷型個體中，會檢測到pre-miRNA的累積；④成熟microRNAs的序列和pre-miRNA的莖環結構在不同物種間存在保守性。已經被鑑定的microRNAs可以通過一些網站進行檢索，例如 Sanger 研究所的 microRNA 網站http://microrna. sanger. ac.uk/。MicroRNAs廣泛存在於真核生物中，在轉錄後水平調控基因的表達，參與細胞增殖、分化、代謝和凋亡等一系列生理進程，調節生物體的生長、發育和代謝，並與多種疾病相關。MicroRNAs進入RISC形成miRNP，在動物細胞中microRNAs通常與靶基因3』 UTR以完全或不完全配對的形式相結合，從而引導miRNP到達目標mRNA。MiRNP與目標mRNA的相互作用可以直接抑制靶基因翻譯的起始，也可以加速目標mRNA的去腺苷化，從而抑制翻譯的起始或導致目標mRNA穩定性降低發生降解，從而調節基因表達。目前的研究表明microRNAs在代謝相關組織，如腦，肝臟，肌肉，脂肪和胰島等組織中具有重要的生物學功能。但是，現有已經發現的microRNAs種類繁多，可能發揮著各種各樣不同的功能，正面的或者負面的功能都有。因此，很有必要深入研究這些microRNAs，對其功能進行深入了解，以期找到新的、有用的藥物靶點，為疾病的臨床治療尋找新的突破□。

發明內容
本發明的目的在於提供若干個microRNAs，特別是miR_181a作為調節胰島素敏感性的靶標的新用途。在本發明的第一方面，提供一種miR-181a抑制劑的用途，用於製備提高胰島素敏感性的組合物。在一個優選例中，所述的組合物還用於抑制胰島素抵抗，改善糖代謝，預防或治療糖代謝失調相關疾病(如2型糖尿病)。在另一優選例中，所述的組合物還用於上調SIRTl蛋白的表達；上調胰島素刺激的InsR，Akt或Gsk3 β磷酸化水平；和/或
上調胰島素刺激的糖原合成酶活性或糖原合成。在另一優選例中，所述的mi R-181 a抑制劑是抑制或阻止mi R-181 a (更特別地，為miR-181a的序列(SEQ ID NO 1)中第1-8位)與其靶向基因位點(較佳地，為SIRTl的3』 UTR的UGAAUGUU序列位點)結合的物質。在另一優選例中，所述的miR_181a抑制劑包括(但不限於)miR_181a的反義核酸，miR-181a的鎖核酸反義核酸；肽核酸；siRNA (沉默miR_181a前體)；或攜帶或表達miR-181a的反義核酸，miR-181a的鎖核酸反義核酸，肽核酸；siRNA的構建物。在另一優選例中，所述的miR_181a抑制劑是SEQ ID NO :5所示的反義核苷酸，或2' -O-甲基化修飾的SEQ ID NO :5所示的反義核苷酸。在本發明的另一方面，提供一種miR_181a抑制劑，其是SEQ ID NO :5所示的反義 核苷酸，或2' -O-甲基化修飾的SEQ ID NO :5所示的反義核苷酸。在本發明的另一方面，提供miR-181a的用途，用於作為篩選提高胰島素敏感性的潛在物質的靶標。在一個優選例中，所述的miR_181a用於篩選提高胰島素敏感性的潛在物質。在本發明的另一方面，提供一種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質的方法，所述方法包括(I)用候選物質處理表達miR_181a的體系；和(2)檢測所述體系中miR_181a的表達情況；其中，若所述候選物質可降低miR-181a的表達，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質。在一個優選例中，步驟(I)包括在測試組中，將候選物質加入到表達miR_181a的體系中；和/或步驟⑵包括檢測測試組的體系中miR-181a的表達，並與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的表達miR-181a的體系；如果測試組中miR-181a的表達在統計學上低於(優選顯著低於，如低20%以上，較佳的低50%以上；更佳的低80%以上)對照組，就表明該候選物是提高胰島素敏感性的潛在物質。在另一優選例中，所述的候選物質包括(但不限於)針對miR-181a設計的幹擾分子、核酸抑制物、結合分子(如抗體或配體)、小分子化合物。在另一優選例中，步驟(I)中，所述的體系還表達SIRTl蛋白；步驟(2)中，還包括檢測所述體系中SIRTl基因的轉錄或蛋白的表達(優選蛋白表達)情況，若轉錄或表達發生上調，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質；或者，檢測所述體系中miR-181a與SIRTl基因的相互作用(結合或互補)，若相互作用減弱(優選顯著減弱，如弱20%以上，較佳的弱50%以上；更佳的弱80%以上)，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質。在另一優選例中，步驟(I)中，所述的體系還表達胰島素通路中的InsR，Akt或Gsk3 β ；步驟(2)中，還包括檢測所述體系中InsR，Akt或Gsk3 β的磷酸化情況，若磷酸化發生上調(優選顯著上調，如上調20%以上，較佳的上調50%以上；更佳的上調80%以上)，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質。在另一優 選例中，步驟(I)中，所述的體系還表達糖原合成酶；步驟⑵中，還包括檢測所述體系中糖原合成酶的表達或活性，若表達或活性發生上調(優選顯著上調，如上調20%以上，較佳的上調50%以上；更佳的上調80%以上)，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質。在另一優選例中，所述的體系選自細胞體系(如表達miR_181a的細胞)(或細胞培養物體系)、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系(如線蟲)。在另一優選例中，所述的方法還包括對獲得的潛在物質進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以從候選物質中進一步選擇和確定對於提聞膜島素敏感性有用的物質。在本發明的另一方面，提供一種測定miR-181a表達量的試劑的用途，用於製備診斷或檢測動物胰島素敏感性情況或胰島素抵抗的試劑或試劑盒。在本發明的另一方面，提供一種提高胰島素敏感性的方法，包括下調動物中miR-181a的表達。在另一優選例中，所述的方法包括給予動物有效量的miR_181a抑制劑。由於MicroRNA的一個家族(如miR-181家族)中各個成員間序列相似，因此具有相似的靶基因，可能發揮相似的生物功能，比如miR-181a，miR-181b都具有調節肌肉細胞分化的功能(Naguibneva,I. et al.,The microRNA miR-181 targets the homeobox protein Hox-Allduring mammalian myoblast differentiation),而miR—181a,miR—181c 都能夠下調 SIRTl的表達(Saunders et al. ,miRNAs regulate SIRTl expression during mouse embryonicstem cell differentiation and in adult mouse tissues),提不除了 miR-181a 夕卜，miR-181家族的其他成員miR-181b，c，d也可能與胰島素敏感性有關，抑制miR-181家族的表達可能提高胰島素敏感性。在本發明的另一方面，提供一種miR_27a和miR-146或其促進劑，以及miR_181b，miR-181c和miR-181d的抑制劑的用途，用於製備提高胰島素敏感性的組合物。在本發明的另一方面，提供一種miRNA的用途，用於作為篩選提高胰島素敏感性的潛在物質的靶標(或用於篩選提高提高胰島素敏感性的物質)，所述的miRNA選自miR-27a、miR_146b、miR_181b，miR_181c 或 miR_181d。在本發明的另一方面，一種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質的方法，所述方法包括(al)用候選物質處理表達miRNA的體系；和(a2)檢測所述體系中miRNA的表達情況；其中，若所述候選物質可提高miRNA的表達，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質；其中，所述的miRNA 選自miR_27a 或 miR_146b。在一個優選例中，上述步驟(al)包括在測試組中，將候選物質加入到表達所述miRNA的體系中；和/或步驟(a2)包括檢測測試組的體系中miRNA的表達，並與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的表達miRNA的體系；如果測試組中miRNA的表達在統計學上高於(優選顯著高於，如低20%以上，較佳的高50%以上；更佳的高80%以上)對照組，就表明該候選物是提高胰島素敏感性的潛在物質。
在本發明的另一方面，一種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質的方法，所述方法包括(bl)用候選物質處理表達miRNA的體系；和(b2)檢測所述體系中miRNA的表達情況；其中，若所述候選物質可抑制miRNA的表達，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質；其中，所述的miRNA 選自miR_181b、miR_181c, miR_181d。在一個優選例中，上述步驟(bl)包括在測 試組中，將候選物質加入到表達所述miRNA的體系中；和/或步驟(b2)包括檢測測試組的體系中miRNA的表達，並與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的表達miRNA的體系；如果測試組中miRNA的表達在統計學上低於(優選顯著低於，如低20%以上,較佳的低50%以上；更佳的低80%以上)對照組，就表明該候選物是提高胰島素敏感性的潛在物質。在另一優選例中，所述的體系選自細胞體系(如表達所述miRNA(選自miR-27a、miR_146b、miR_181b、miR_181c，或 miR_181d)的細胞)(或細胞培養物體系)、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系(如線蟲)。在另一優選例中，所述的方法還包括對獲得的潛在物質進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以從候選物質中進一步選擇和確定對於提聞膜島素敏感性有用的物質。在另一優選例中，所述的候選物質包括(但不限於)針對所述miRNA(選自miR-27a、miR-146b、miR-181b、miR-181c，或 miR-181d)設計的幹擾分子、核酸抑制物、結合分子(如抗體或配體)、小分子化合物。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖l、MiR_181a 作用於 SIRTl 3，UTR。A :在18個潛在的microRNAs中，miR_181a可顯著抑制SIRTl 3』UTR的轉錄活性。在轉染pRL-SIRTl-3』 UTR及含相應microRNA前體的質粒72小時後，收集HEK293T細胞做螢光素酶基因檢測。與pSIF-GFP(pSIF)相比*p < O. 05，**p < O. 01。除非另行說明，本圖及其它圖中誤差值的坐標採用標準差。B :人miR_181a序列與人、大鼠及小鼠中SIRTl 3』UTRs的序列比對。miR_181a的核心區域為加黑體5』 ACAUUCA 3』。C =SIRTl 3』 UTR突變體不具有抑制SIRTl 3』 UTR的轉錄活性的作用。與其它各組相比廣P <0.01。D:miR-181a核心區域突變體不具有抑制SIRTl 3』 UTR的轉錄活性的作用。與其它各組相比**p < O. 01。圖2、MiR_181a在轉錄水平抑制SIRTl蛋白表達。A :miR_181a可顯著抑制SIRTl蛋白表達，而miR_181a突變體對SIRTl蛋白表達沒有影響。與 pSIF-GFP (pSIF)或 pSIF-181a_m 相比，**p < O. 01。B :過表達miR_181a劑量依賴性抑制SIRTl蛋白表達。轉染不同劑量的miR_181a類似物(圖中簡寫為「miR-181a類」)72小時後，收集HEK293T細胞做免疫印跡試驗檢測。與未轉染miR-181a類似物的細胞相比、< O. 01。C :用反義核酸(anti_181a)抑制miR_181a可劑量依賴性上調SIRTl蛋白水平。轉染不同劑量 的anti-181a 72小時後，收集HEK293T細胞做免疫印跡試驗檢測。與未轉染反義核酸的細胞相比、< O. 01。D :過表達miR-181a不影響SIRTl mRNA水平。在轉染相應質粒(表達miR_181a質粒)72小時後，收集HEK293T細胞做實時定量PCR檢測。E :上調或下調miR-181a不影響SIRTl mRNA水平。在轉染相應核苷酸(miR_181a類似物)72小時後，收集HEK293T細胞做實時定量PCR檢測。圖3、MiR_181a在產生胰島素抵抗的!fepG2細胞和db/db小鼠肝臟中上調。A :葡萄糖胺成功誘導HepG2細胞產生胰島素抵抗。用葡萄糖胺處理HepG2細胞18小時，IOOnM胰島素刺激細胞15分鐘後收集細胞做免疫印跡試驗檢測，未用胰島素刺激細胞作為對照。磷酸化InsR(p-InsR)與不用葡萄糖胺但僅用胰島素處理的相比減少，表示胰島素抵抗發生。B MiR-181a在產生胰島素抵抗的IfepG2細胞中上調。葡萄糖胺處理IfepG2細胞18小時後收集細胞做實時定量PCR檢測。、< O. 01。C =SIRTl蛋白水平在db/db小鼠肝臟中下調。蛋白水平通過免疫印跡試驗檢測。D MiR-181a在db/db小鼠肝臟中上調。肝臟樣品取自經基因型檢測的10周齡小鼠，MiR-181a表達水平用實時定量PCR檢測。不同基因型小鼠各14隻。圖4、過表達miR_181a抑制SIRTl表達並誘導肝臟胰島素抵抗。A :在H印G2細胞中miR_181a下調SIRTl蛋白水平及胰島素誘導的InsR，Akt和Gsk30的磷酸化。轉染不同劑量的miR-181a類似物72小時後，用IOOnM胰島素刺激細胞15分鐘收集細胞做免疫印跡試驗檢測。B :對(A)圖中SIRTl蛋白水平及胰島素誘導的InsR，Akt和Gsk3 β的磷酸化水平的量化統計。與同組中未轉染miR-181a類似物的細胞相比，*p < O. 05，**p < O. 01。C和D :在!fepG2細胞中miR_181a抑制胰島素誘導的糖原合成酶活性(C)及糖原合成(D)的上調。與未轉染miR-181a類似物胰島素刺激的細胞相比，#P < 0.01。E和F :在原代培養的肝臟(E)和C2C12肌肉細胞(F)中miR_181a類似物抑制SIRTl蛋白水平及胰島素誘導的InsR，Akt和Gsk3 β的磷酸化。蛋白水平通過免疫印跡試驗檢測。圖5、抑制miR_181a能夠增加SIRTl的蛋白表達並提高胰島素敏感性。(A，B)在正常(A)和誘導胰島素抵抗⑶狀態下，用反義核酸抑制IfepG2細胞中的miR-181a能夠顯著增加SIRTl的蛋白表達並提高胰島素誘導的InsR，Akt和Gsk3 β的磷酸化。指定濃度的反義核酸轉染HepG2細胞72小時後，用IOOnM的胰島素刺激細胞15分鐘，提蛋白進行免疫印跡檢測。(C，D)對於(A和B)中正常(C)及誘導胰島素抵抗狀態⑶時SIRTl蛋白和InsR(IR)，Akt和Gsk3 β磷酸化水平的灰度分析定量。*ρ < O. 05，**ρ < O. 01與每組中未轉染anti-181a的作差異分析。(E，F)在正常(E)和誘導胰島素抵抗(F)狀態下，用反義核酸抑制小鼠肝臟原代細胞中的miR-181a能夠顯著增加SIRTl的蛋白表達並提高胰島素誘導的InsR，Akt和Gsk3 β的磷酸化。(G, H)抑制miR_181a能夠增加胰島素誘導的糖原合成酶活性(G)以及糖原合成(H)的上調。*p < O. 05，**p < O. 01，與每組中未轉染anti-181a的作差異分析。圖6、miR_181a對於胰島素信號通路的調控依賴於SIRTl。(A)正常狀態下，在H印G2細胞中用腺病毒過表達SIRTl (Ad-SIRTl)能夠回復miR-181a對於胰島素刺激的InsR，Akt的磷酸化的抑制作用，腺病毒過表達的GFP (Ad-GFP)作為負對照，免疫印跡法用來檢測蛋白及其磷酸化水平。(B,C)對於(A)中感染了 Ad-GFP(B)和 Ad-SIRTl (C)的 H印G2 細胞中 SIRTl 蛋白和胰島素刺激的InsR，Akt的磷酸化的灰度分析定量。< O. 05，**p < O. 01，與每組中未轉染miR-181a類似物的作差異分析。(D)在HepG2細胞中，誘導胰島素抵抗的情況下，利用尼克醯胺(NAM)來抑制SIRTl的活性後，反義核酸anti-181a對於胰島素刺激的InsR和Akt的磷酸化的上調作用消失。免疫印跡法用來檢測蛋白及其磷酸化水平。(E)對於(D)中尼克醯胺處理的HepG2細胞中SIRTl蛋白和胰島素刺激的InsR，Akt的磷酸化的灰度分析定量。< O. 05，**p < O. 01與每組中未轉染anti-181a的作差異分析。(F)在SIRTl敲除小鼠(KO)的肝臟原代細胞中，反義核酸anti_181a對於胰島素敏感性的改善作用消失。(G-H)對於(F)中野生型小鼠(WT) (G)以及SIRTl敲除小鼠⑶的肝臟原代細胞中SIRTl蛋白和胰島素刺激的InsR，Akt的磷酸化的灰度分析定量。< O. 05，、< O. 01與每組中未轉染anti-181a的作差異分析。*p < O. 05,**p < O. 01與每組中未轉染anti_181a的作差異分析。圖7、小鼠體內實驗證明miR_181a能夠調節SIRTl的蛋白水平以及肝臟胰島素敏感性。(A和B)在小鼠肝臟中利用腺病毒載體過表達miR-181a(Ad-miR_181a)導致胰島素刺激的InsR，Akt和Gsk3 β的磷酸化的減弱。對八周齡的雄性C57BL/6小鼠尾靜脈注射表達miR-181a和GFP (Ad-GFP)的腺病毒載體，注射12天後殺小鼠檢測肝臟中miR_181a的表達(A)和胰島素信號通路一些蛋白的磷酸化(B)。< O. 05，每組9隻小鼠。 (C)對於⑶中SIRTl蛋白以及胰島素刺激的InsR，Akt和Gsk3 β磷酸化水平的灰度分析統計。與Ad-GFP組相比，*ρ < O. 05,**ρ < O. Ol0(D)高脂飲食誘導肥胖(DIO)的小鼠腹腔注射LNA-anti_181a增加了肝臟SIRTl蛋白的表達以及胰島素刺激的InsR，Akt和Gsk3 β磷酸化水平。(E)對於⑶中SIRTl蛋白以及胰島素刺激的InsR，Akt和Gsk3 β磷酸化水平的灰度分析統計。與LNA-control組相比，*p < O. 05, **p < O. 01。(F)注射 LNA-anti_181a 的 DIO 小鼠肝臟中 miR_181a 以及 G6Pase，PEPCK 的 mRNA水平下降。與LNA-control組相比，*p < O. 05，**p < O. 01，每組11隻小鼠。(G)注射LNA-anti_181a的DIO小鼠飢餓血糖低於注射LNA-control對照組。與LNA-control組相比，*p < 0. 05,每組11隻小鼠。
(H) Pearson correlation coefficient test 顯不注射 LNA-anti_181a 的 DIO 小鼠個體miR-181a的表達與飢餓血糖相關(η = 11)。(I)最後一次注射LNA9天後，葡萄糖耐受性實驗顯示LNA_anti_181a改善了 DIO小鼠的葡萄糖耐受性。與LNA-control組相比，*p < 0. 05，每組11隻小鼠。(J)LNA-anti_181a減少了(I)圖中葡萄糖耐受性實驗所作圖的曲線下面積。與LNA-control組相比，*p < 0. 05,每組11隻小鼠。(K) Pearson correlation coefficient test 顯不注射 LNA-anti_181a 的 DIO 小鼠個體miR-181a的表達與葡萄糖耐受性實驗所作圖的曲線下面積相關(η = 11)。圖8、Western檢測miR_27a和miR_146b對於細胞的胰島素敏感性的影響情況。
具體實施方式
本發明人經過長期的研究，意外地發現了一些microRNA (miRNA)在調節胰島素敏感性中發揮作用，這些miRNA包括miR-181a、miR-27a、miR-146b。其中，miR_181a通過抑制SIRTl表達而影響胰島素敏感性。基於本發明的揭示，所述的miR-181a的抑制劑以及所述的miR-27a、miR-146b本身可用於提高胰島素敏感性，從而預防、緩解或治療胰島素敏感性下降、胰島素抵抗、糖代謝失調相關的疾病，如2型糖尿病。miR_181a 及其用途本發明中，所述的miR_181a是具有SEQ ID NO 1所示核酸序列的小核糖核酸AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU(SEQ ID NO 1)miR-181a是為一種本領域已知的microRNA (miRNA)小分子，其對於調控RNA是有用的。其在哺乳動物中非常保守，在動物的眼睛，胸腺，免疫細胞表達量較高。然而，對於miR-181a結合的靶點和其與胰島素敏感性或糖代謝之間的關係目前並不清楚。miR_181a可以被分離自細胞，或者可通過人工合成的方式獲得。在得知了miR-181a或其前體的序列後，本領域人員可以方便地製備獲得miR-181a或其前體。本發明人發現，miR-181a是一個新的、與胰島素敏感性密切相關的藥物靶點，其藉由抑制SIRTl蛋白表達，抑制胰島素信號通路，進一步下調胰島素敏感性。針對miR-181a的各種治療手段可以作為提高動物胰島素敏感性的新穎和有效的手段。miR_181a為靶點的藥物篩選在得知了 miR-lSla與胰島素敏感性的密切相關性後，可以基於該特徵來篩選抑制miR-181a的物質。之後，可從所述的物質中找到對於提高胰島素敏感性真正有用的藥物。因此，本發明提供一種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質的方法，所述的方法包括用候選物質處理表達miR-181a的體系；和檢測所述體系中miR_181a的表達或活性；若所述候選物質可抑制miR-181a的表達或活性，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質。所述的表達miR-181a的體系例如可以是細胞(或細胞培養物)體系，所述的細胞可以是內源性表達miR-lSla的細胞；或可以是重組表達miR_181a的細胞。所述的表達miR-181a的體系還可以是亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系(如動物模型，優選非人哺乳動物的動物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。在本發明的優選方式中，在進行篩選時，為了更易於觀察到miR-181a的表達或活性的改變，還可設置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質的表達miR-181a的體系。作為本發明的優選方式，所述的方法還包括對獲得的潛在物質進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以進一步選擇和確定對於提高胰島素敏感性真正有用的物質。基於miR-lSla的作用機理為通過抑制SIRTl蛋白表達，進而發揮提高胰島素敏感性的作用。因此還可以在篩選體系中表達SIRTl蛋白(較佳地包括其編碼基因以及3』UTR區作為表達盒)。從而，可通過進一步觀察所述體系中SIRTl蛋白·的表達情況來分析候選藥物的有效性。若SIRTl蛋白表達發生上調，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質；或者，檢測所述體系中miR-181a與SIRTl基因的相互作用(結合或互補)，若相互作用減弱，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質。此外，還可以在篩選體系中表達胰島素通路中的關鍵因子，如InsR，Akt或Gsk3i3，從而通過觀察所述體系中這些因子的磷酸化情況來分析候選物質的有效性。若磷酸化水平發生上調，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質。此外，還可以在篩選體系中表達糖原合成酶，從而通過觀察所述體系中糖原合成酶的表達或活性來分析候選物質的有效性。若磷酸化水平發生上調，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質。本發明對於SIRT1、InsR, Akt, Gsk3 β或糖原合成酶的基因轉錄、蛋白表達、蛋白活性、蛋白存在量、分泌情況或磷酸化情況的檢測方法沒有特別的限制。可以採用常規的PCR技術，或蛋白定量或半定量檢測技術進行，例如(但不限於)=RT-PCR法，SDS-PAGE法，Western-Blot 法等。另一方面，本發明還提供了採用所述篩選方法獲得的提高胰島素敏感性的潛在物質。這些初步篩選出的物質可構成一個篩選庫，以便於人們最終可以從中篩選出能夠對於抑制miR_181a的表達和活性，進而提聞膜島素敏感性有用的物質。miR-27a、miR_146b 及其用途本發明人還找到了若干miRNA，它們對於提高胰島素敏感性是有用的，所述的miRNA 選自 miR-27a 或 miR_146b。因此，所述的miR_27a或miR_146b或它們的促進劑可用於製備提高胰島素敏感性的組合物，並且也可以用於作為藥物篩選的靶點，篩選通過提高miR-27a或miR-146b的表達或活性而提高胰島素敏感性的組合物。所述的miRNA (選自miR_27a或miR_146b)的促進劑是指任何可提高miRNA或其前體的活性、提高miRNA或其前體的穩定性、上調miRNA或其前體的表達、增加miRNA或其前體有效作用時間的物質，這些物質均可用於本發明，作為對於上調miRNA有用的物質，從而可用於提高胰島素的敏感性。此外，一些miRNA的模擬物(mimic)或其它修飾形式也可以作為miRNA的促進劑，只要它們具有與所述miRNA相同的效果，或者能夠提高miRNA的表達或活性。因此，本發明提供一種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質的方法，所述的方法包括用候選物質處理表達miR-27a或miR-146b的體系；和檢測所述體系中miR_27a或miR-146b的表達或活性；若所述候選物質可提聞(顯者提聞，如提聞20% ;更佳地提聞40% ;更佳地提高60% )miR-27a或miR-146b的表達或活性，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質。所述的表達miR-27a或miR-146b的體系例如可以是細胞(或細胞培養物)體系，所述的細胞可以是內源性表達miR-27a或miR-146b的細胞；或可以是重組表達miR_27a或miR_146b的細胞。所述的表達miR_27a或miR_146b的體系還可以是亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系(如動物模型，優選非人哺乳動物的動物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。在本發明的優選方式中，在進行篩選時，為了更易於觀察到miR_27a或miR_146b的表達或活性的改變，還可設置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質的表達miR-27a 或 miR_146b 的體系。作為本發明的優選方式，所述的方法還包括對獲得的潛在物質進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以進一步選擇和確定對於提高胰島素敏感性真正有用的物質。miR-181b，c，d 及其用途 本發明人還推測若干個miRNA，它們對於提高胰島素敏感性是有用的，所述的miRNA 選自 miR_181b, c, d。因此，所述的miR-181b，c, d的抑制劑可用於製備提高胰島素敏感性(通過下調這些miRNA的表達或活性)的組合物，並且也可以用於作為藥物篩選的靶點，篩選通過提高miR-181b, c，d的表達或活性而提高胰島素敏感性的組合物。因此，本發明提供一種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質的方法，所述的方法包括用候選物質處理表達miR-181b, c, d的體系；和檢測所述體系中miR_181b, c, d的表達或活性；若所述候選物質可降低(顯著降低，如降低20% ;更佳地降低40% ;更佳地降低60% )miR-181b, c, d的表達或活性，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質。所述的表達miR-181b，c，d的體系例如可以是細胞(或細胞培養物)體系，所述的細胞可以是內源性表達miR-181b, c, d的細胞；或可以是重組表達miR_181b, c, d的細胞。所述的表達miR-181b，c，d的體系還可以是亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系(如動物模型，優選非人哺乳動物的動物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。在本發明的優選方式中，在進行篩選時，為了更易於觀察到miR-181b，c, d的表達或活性的改變，還可設置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質的表達miR-181b, c, d 的體系。作為本發明的優選方式，所述的方法還包括對獲得的潛在物質進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以進一步選擇和確定對於提高胰島素敏感性真正有用的物質。miRNA調節劑及其用途基於本發明人的上述新發現，本發明提供了一種miRNA抑制劑的用途，用於製備提高胰島素敏感性的組合物，所述的miRNA選自miR-181a, b, c, d。進一步地,所述的miR-181a抑制劑還可用於促進SIRTl基因的轉錄或蛋白的表達；抑制血管內皮生長因子的轉錄或表達；或抑制軟骨細胞的凋亡。如本文所用，所述的「miRNA抑制劑」包括了核酸抑制物、拮抗劑、下調劑、阻滯劑、阻斷劑等，只要它們能夠下調miRNA或其前體的表達水平。它們可以是化合物、化學小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。所述的miRNA抑制劑是指任何可阻止miRNA (特別是其中的結合關鍵位點)或其前體與其靶向序列結合、降低miRNA或其前體的活性、降低miRNA或其前體的穩定性、下調miRNA或其前體的表達、減少miRNA或其前體有效作用時間的物質，這些物質均可用於本發明，作為對於下調miRNA有用的物質，從而可用於提高胰島素的敏感性。例如，所述的抑制劑是核酸抑制物，蛋白抑制劑，抗體，配體，核酸酶，核酸結合分子，只要其能夠下調miRNA的表達。作為本發明的一種優選方式，所述的抑制劑是核酸抑制物。較佳地，所述的核酸抑制物通過阻止miRNA與其祀向序列結合,從而發揮作用。所述的核酸抑制物例如選自(但不限於)miRNA的反義核酸，miRNA的鎖核酸反義核酸；肽核酸；siRNA (沉默miRNA前體)。作為本發明的優選方式，所述的miRNA的抑制劑是miRNA的反義核酸。如本文所用，「反義核酸」又稱為「反義核酸」或「反義寡核苷酸(AS-ONs，antisense-oligonucleotides) 」或「反義藥物」,是指長度約為15-30個鹼基的DNA分子、RNA分子它們的經修飾的形式或它們的類似物，可與mRNA互補。本領域人員均了解，根據本發明提供的反義核酸，可以進行適當的變化並保留其活性，這些變化形式均可用於本發明。任何可起到抑制或沉默miRNA的作用的反義核酸都 是可用於本發明的，其類型不限於DNA或是RNA。例如，所述的miRNA的反義核酸是與miRNA的序列基本上(較佳地為完全)互補的序列。例如，當所述的miRNA為miR-181a時，所述的miR-181a的反義核酸與SEQ ID NO :5所示的序列具有80%以上的相同性，較佳地具有85%以上的相同性，更佳地具有90%以上的相同性，最佳地具有95%以上的相同性，如具有96%、97%、98%或99%以上的相同性；或者所述的miR-181a的反義核酸是SEQ ID NO:5所示序列的片段；它們均具有SEQ ID NO :5所示序列的反義核酸相同的功能。現有技術中已經指出了一些反義核酸的變化形式是可取的，它們也可以針對相應的祀序列發揮抑制作用。如Improved targeting of miRNA with antisenseoligonucleotides (2294-2304 Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 8)文獻中提至Li，在反義核酸的兩個末端截短I個鹼基是可以保留其活性的。又如Design and deliveryof antisense oligonucleotides to block microRNA function in cultured Drosophilaand human cells (NATURE PROTOCOLS ；V0L. 3N0. 10 ；2008 ； 1537-1549)文獻綜述了多個研究，認為一般而言，在反義核酸的兩邊延長一些鹼基是可以的。而在反義核酸和miRNA間親和性很高(如鎖核酸修飾)時，反義核酸可以被截短到約2/3長度。如本文所用，所述的「嚴格條件」是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0. 2XSSC，0. 1% SDS,60°C ;或(2)雜交時加有變性劑，如50% (v/v)甲醯胺，0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發生雜交。在本發明中，所述的「反義核酸」還包括經修飾的反義核酸，所述的修飾基本不改變反義核酸的活性，更佳地，所述修飾可提高反義核酸的活性、穩定性或治療效果。對反義核酸的修飾包括但不限於鎖核酸修飾、甲氧基化修飾、肽核酸修飾、硫代修飾、磷酸骨架由磷脂連接骨架代替，這些修飾均是本領域技術人員易於實現的。優選地，所述的修飾為鎖核酸修飾。組合物本發明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.000001-50wt% ;較佳的
0.00001-2(^七％;更佳的，0. 0001-10wt% )的所述的 miRNA(選自 miR_27a 或 miR_146b)或其促進劑；或含有有效量的miRNA(選自miR-181a，b，c，d)抑制劑，以及藥學上可接受的載體。所述的組合物可用於提高胰島素敏感性。任何前述的miRNA或其促進劑或抑制劑均可用於組合物的製備。如本文所用，所述「有效量」是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。所述「藥學上可接受的載體」指用於治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身並不是必要的活性成分，且施用後沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩衝液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充齊U、潤滑劑、助流劑、潤溼劑或乳化劑、PH緩衝物質等。所述的載體中還可以含有細胞轉染試劑。在得知了所述miRNA或其促進劑或抑制劑的用途後，可以採用本領域熟知的多種方法來將所述的miRNA或其促進劑或抑制劑或它們的藥物組合物給藥於哺乳動物。包括但不限於皮下注射、肌肉注射、經皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等。 本發明所述的miRNA或其促進劑或抑制劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限於所述的miRNA或其促進劑或抑制劑的藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當本發明的miRNA或其促進劑或抑制劑每天以約O. 00001mg-50mg/kg動物體重(較佳的O. 0001mg-10mg/kg動物體重)的劑量給予，能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或將劑量按比例地減少。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社，2002中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。I.材料與方法哺乳動物細胞株及細菌株HEK293T :人胚胎腎細胞系，由HEK293細胞衍生而來，同時表達SV40病毒的大T抗原。HepG2 :人肝癌細胞系。C2C12 :小鼠骨骼肌成肌細胞系。以上細胞株均購自中科院上海生命科學院細胞庫。DH5ci細菌用於質粒克隆的大腸桿菌。主要試劑及試劑盒miR_181a， miR-543， miR_30a， miR_199b， miR_200a， miR_7， miR_9， miR-22，miR_29a， miR_29b， miR_34a， miR-128， miR-132， miR-138， miR-154， miR-204， miR-212，miR-217 WmiRBase 資料庫(http://microrna. sanger. ac. uk/sequences/)得到。它們相應的Pre-miRNA序列相應的DNA序列化學合成經配對後連入pSIF-GFP的BamH I/EcoR I位點，獲得可表達microRNA的質粒。miR-181a AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU (SEQ ID NO 1)miR-181a 的前體(Pre-Hsa_miR-181a)TGAGTTTTGAGGTTGCTTCAGTGAACATTCAACGCTGTCGGTGAGTTTGGAATTAAAATCAAAACCATCGACCGTTGATTGTACCCTATGGCTAACCATCATCTACTCCA(SEQ ID NO 2)MiRNA_181a 核苷酸類似物(即 miR_181a mimics);反義核酸(anti_181a)及miR-181a鎖核酸反義核酸(LNA-anti_181a)均合成於上海吉瑪製藥技術有限公司(GenePharma, Shanghai, China)。它們的序列或結構是MiRNA_181a核苷酸類似物序列或結構正義5』-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU TT-3』 (SEQ ID NO 3)；反義5』-ACUCACCGACAGCGUUGAAUGUU TT-3』 (SEQ ID NO :4)。反義核酸為2' -O-甲基化修飾的ACTCACCGACAGCGTTGAATGTT(SEQ ID NO: 5)，每個鹼基均有2' -O-甲基化修飾。miR_181a 鎖核酸反義核酸(LNA-anti_181a):購於 Exiqon 公司。Taq酶、限制性內切酶及T4DNA連接酶為TaKaRa公司產品；細菌培養用胰蛋白腖、酵母粉購自Oxoid公司；瓊脂粉購自捷倍思公司；核酸分析電泳用瓊脂糖購自Biowest公司；質粒大抽試劑盒購自Qiagen公司。細胞總RNA抽提試劑TRIzol購自Invitrogen公司；M-MLV反轉錄試劑盒購自Promega公司；miR_181a反轉錄試劑盒購自Applied Biosystems公司。煙醯胺(nicotinamide),棕櫚酸(palmitate),葡萄糖胺(D- (+) -Glucosaminehydrochloride)均購自Sigma公司；注射用胰島素購自Novo Nordisk公司；PVDF膜購自 Millipore 公司；蛋白印跡化學發光試劑SuperSignal West Pico ChemiluminescentSubstrate 購自 Thermo Scientific 公司，Tmmobi I on TM Western Chemi luminescent HRPSubstrate 購自 Millipore 公司；X-Omat 光片購自 Kodak 公司。·抗體
權利要求
1.一種HiiR-ISla抑制劑的用途，用於製備提高胰島素敏感性的組合物。
2.如權利要求I所述的用途，其特徵在於，所述的組合物還用於抑制胰島素抵抗，改善糖代謝，預防或治療糖代謝失調相關疾病。
3.如權利要求I所述的用途，其特徵在於，所述的組合物還用於 上調SIRTl蛋白的表達； 上調胰島素刺激的InsR，Akt或Gsk3 β磷酸化水平；和/或 上調胰島素刺激的糖原合成酶活性或糖原合成。
4.如權利要求I所述的用途，其特徵在於，所述的miR-181a抑制劑是抑制或阻止miR-181a與其靶向基因位點結合的物質。
5.如權利要求4所述的用途，其特徵在於，所述的miR-181a抑制劑是抑制或阻止miR-181a與SIRTl的3』 UTR的UGAAUGUU序列位點結合的物質。
6.如權利要求4所述的用途，其特徵在於，所述的miR-181a抑制劑包括miR_181a的反義核酸，miR-181a的鎖核酸反義核酸；肽核酸；siRNA ;或攜帶或表達miR_181a的反義核酸，miR-181a的鎖核酸反義核酸，肽核酸；siRNA的構建物。
7.如權利要求4所述的用途，其特徵在於，所述的miR-181a抑制劑是SEQID N0:5所示的反義核苷酸，或2' -O-甲基化修飾的SEQ ID NO 5所示的反義核苷酸。
8.—種miR-181a抑制劑，其特徵在於，其是SEQ ID NO :5所示的反義核苷酸，或2' -O-甲基化修飾的SEQ ID NO :5所示的反義核苷酸。
9.一種miR-181a的用途，用於作為篩選提高胰島素敏感性的潛在物質的靶標。
10.一種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質的方法，所述方法包括 (1)用候選物質處理表達miR-181a的體系；和 (2)檢測所述體系中miR-181a的表達情況； 其中，若所述候選物質可降低miR-181a的表達，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，步驟(I)包括在測試組中，將候選物質加入到表達miR-181a的體系中；和/或 步驟⑵包括檢測測試組的體系中miR-181a的表達，並與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的表達miR-181a的體系； 如果測試組中miR-181a的表達在統計學上低於對照組，就表明該候選物是提高胰島素敏感性的潛在物質。
12.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，步驟(I)中，所述的體系還表達SIRTl蛋白； 步驟(2)中，還包括檢測所述體系中SIRTl基因的轉錄或蛋白的表達情況，若轉錄或表達發生上調，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質；或者，檢測所述體系中miR-181a與SIRTl基因的相互作用，若相互作用減弱，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質。
13.如權利要求12所述的方法，其特徵在於，步驟(I)中，所述的體系還表達胰島素通路中的 InsR, Akt 或 Gsk3 β ； 步驟(2)中，還包括檢測所述體系中InsR，Akt或Gsk3i3的磷酸化情況，若磷酸化發生上調，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質。
14.如權利要求12所述的方法，其特徵在於，步驟(I)中，所述的體系還表達糖原合成酶； 步驟(2)中，還包括檢測所述體系中糖原合成酶的表達或活性，若表達或活性發生上調，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質。
15.一種測定miR-181a表達量的試劑的用途，用於製備診斷或檢測動物胰島素敏感性情況或胰島素抵抗的試劑或試劑盒。
16.一種miRNA或其促進劑的用途，用於製備提高胰島素敏感性的組合物；所述的miRNA 選自miR-27a 或 miR-146b。
17.—種miRNA的抑制劑的用途，用於製備提高胰島素敏感性的組合物；所述的miRNA選自miR-181b、miR-181c，miR-181d。
18.—種miRNA的用途，用於作為篩選提高胰島素敏感性的潛在物質的靶標，所述的miRNA 選自miR-27a、miR_146b、181b、miR_181c 或 miR_181d。
19.一種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質的方法，所述方法包括 (al)用候選物質處理表達miRNA的體系；和 (a2)檢測所述體系中miRNA的表達情況； 其中，若所述候選物質可提聞miRNA的表達，則表明該候選物質是提聞膜島素敏感性的潛在物質； 其中，所述的miRNA選自miR-27a或miR_146b。
20.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，步驟(al)包括在測試組中，將候選物質加入到表達所述miRNA的體系中；和/或 步驟(a2)包括檢測測試組的體系中miRNA的表達，並與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的表達miRNA的體系； 如果測試組中miRNA的表達在統計學上高於對照組，就表明該候選物是提高胰島素敏感性的潛在物質。
21.—種篩選提高胰島素敏感性的潛在物質的方法，所述方法包括 (bl)用候選物質處理表達miRNA的體系；和 (b2)檢測所述體系中miRNA的表達情況； 其中，若所述候選物質可抑制miRNA的表達，則表明該候選物質是提高胰島素敏感性的潛在物質； 其中，所述的 miRNA 選自:miR-181b、miR-181c，miR_181d。
22.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，步驟(bl)包括在測試組中，將候選物質加入到表達所述miRNA的體系中；和/或 步驟(b2)包括檢測測試組的體系中miRNA的表達，並與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的表達miRNA的體系； 如果測試組中miRNA的表達在統計學上低於對照組，就表明該候選物是提高胰島素敏感性的潛在物質。
全文摘要
本發明涉及若干個microRNAs，特別是miR-181a作為調節胰島素敏感性的靶標的新用途。本發明揭示了miR-181a在調節胰島素敏感性中發揮作用，其通過抑制SIRT1表達而影響胰島素敏感性。因此，miR-181a抑制劑可用於提高胰島素敏感性，從而預防、緩解或治療胰島素敏感性下降、胰島素抵抗、糖代謝失調相關的疾病。
文檔編號A61P3/10GK102908621SQ20111022014
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月2日 優先權日2011年8月2日
發明者翟琦巍, 周犇, 李程 申請人:中國科學院上海生命科學研究院