在膜上提取和純化核酸的方法

2023-09-18 12:44:00 1

專利名稱：在膜上提取和純化核酸的方法
在膜上提取和純化核酸的方法本發明涉及使用包含胍鹽和N-十二烷基-肌氨酸(NLS)的組合的裂解組合物提 取核酸的方法，其可適用於過濾在膜上的極少量的微生物。這種方法使得可以收集適於以特定方式通過雜交或者擴增而檢測形式的所述微 生物的核酸。在工業和醫藥領域，水和空氣以及使用或者廢棄的工具和材料的微生物質量控制 需要符合越來越嚴格的標準。因此，業內人士和衛生官員需要具有其可自行支配的工具以能儘可能快地檢測微 生物汙染，由此可以迅速地且低成本採取補救措施。按照慣例，微生物監測是在瓊脂培養基上進行。這種類型的培養便於實施，可以用 肉眼計數微生物。其還可以保存活微生物，並且如果需要，可以贏得鑑定時間以定義所存在 的不同微生物的屬或種。這些鑑定檢測通常包括提取微生物中包含的核酸，並且以特定方式擴增所述核 酸，所述擴增方式如本領域技術人員已知的許多種鏈反應技術之一(PCR 聚合酶鏈反應， 或者LCR:連接鏈反應)。然而，儘管通過核酸擴增的鑑定檢驗具有高水平可靠性，但是需要很長時間進行 包括微生物培養、提取其核酸以及進行PCR的步驟。為了可以肉眼觀測，微生物必須培養至少24小時及有時更長時間以延緩微生物 如甲基桿菌(methylobacterium sp.)的生長，或者微生物被環境條件刺激。此外，核酸的提取不能在瓊脂糖上直接進行，這意味著在提取核酸之前必須取出 微生物。在這種情況中，檢測成為定性檢測且不再是定量檢測。近年來，基於使用固定在固體支持物上的核酸探針的雜交技術的lab-on-a-chip 裝置的進展，使得可以贏得時間進行微生物鑑定步驟。然而，這些技術仍是高成本的，且未 提供完全免除核酸提取和轉移步驟。在這些條件下，仍必須培養24小時以上以計數和鑑定微生物，這在需要持續監測 產品質量的工業背景中是太長的時間。為了加速檢測液體或者氣體介質中或者其表面上存在的微生物，本申請人 (Millipore Corporation)幾年來開發了一種檢測微生物的通用方法，以Milliflex Rapid 之名銷售。這種方法在專利申請WO 92-00145中描述。其包括通過使液體或者氣體經過膜而 將該溶液或者氣體中包含的微生物保留在所述膜的表面。將所述膜表面的微生物與瓊脂培 養基接觸培養一段使得用肉眼無法觀測的小菌落形成必需的時間。然後將形成該小菌落的 細胞裂解以釋放其包含的三磷酸腺苷(ATP)。釋放的ATP用作標記以通過ATP-生物發光技 術鑑別和定量活細胞。ATP作為產生化學發光反應的酶底物，由此獲得光信號，然後使用合 適的視頻接口裝置(video interface)(例如IXD相機)檢測。獲得信號形成圖像，使得可 以原位觀測所述膜上的發生微生物的位置，與在瓊脂培養基中皮氏培養皿上進行的標準計 數方法相似。這種接口裝置使得也可以量化分析的液體或者氣體樣品中最初存在的微生物的數目。在Milliflex 系統中微生物的檢測被稱作是「通用的」，因為其使用ATP (三磷酸腺 苷)，這是包含於所有活細胞中的底物。這種技術使得可以迅速檢測例如在工業生產線上或 者在無塵室中汙染物的存在，無論微生物如何甚至以極低濃度存在，由此可以在短時間內 採取必要的去汙染措施。然而，使用Milliflex 系統目前不能同時獲得關於檢測的微生物特性的可靠信
肩、O但是這種鑑別可用於更詳細地確定汙染來源以及界定解決方案。這種鑑定的主要障礙在於在Milliflex 系統中實施的ATP-生物發光檢測破壞包 含的微生物。事實上，在通過生物發光檢測期間，首先使用基於乙醇的溶液處理微生物，以提取 ATP分子，然後通過生物發光試劑處理。此外，在這兩個步驟之間使所述膜乾燥，以進行生物 發光反應。這些處理的結果是微生物被殺死，由此阻止其隨後被培養以進行標準鑑定檢測 (抗生素抗性、代謝標記、革蘭氏反應等)。因此，根據本發明，本發明人著手鑑定通過拯救生物發光處理的微生物的核酸而 檢測的微生物，以通過雜交或者通過擴增、特別是通過PCR繼續進行其特異性檢測。然而，核酸的擴增或者雜交技術需要純化的DNA或者RNA樣品，這些樣品被充分濃 縮以可以可靠地進行希望的檢測反應。在濾膜上檢測的特定情況中，回收這些核酸存在許多困難，特別是由於如下事實 所致-微生物以一或多個小菌落的形式被分散在膜的表面，每個菌落包含少量微生物， 通常少於IO3個細胞；以及_乾燥含有待提取的核酸的細胞，以及另外用能抑制或者降低雜交或者PCR反應 產量的製劑和鹽預先處理。這些限制意味著核酸必須在膜上回收在溶液中、純化以及濃縮。現有技術領域中有許多提取、純化和濃縮細胞中包含的核酸的技術，這些技術因 核酸的性質即RNA或DNA而不同。大多數這些技術需要最初用裂解緩衝液處理，然後在溶液中沉澱核酸的步驟。裂 解緩衝液的目的是破壞細胞膜及溶解蛋白質，而沉澱使得可以在溶液中分離核酸與其它細 胞成分。最常用的提取RNA(比DNA更易損壞)的方法是例如已知的「苯酚_氯仿」方法。根據這種技術，將細胞首先置於與包含去汙劑_蛋白酶K混合物的裂解緩衝液接 觸，目的是解離細胞成分以及釋放核酸。通常使用的裂解緩衝液包含作為去汙劑的十二烷基硫酸鈉(SDS)，其是細胞裂解 齊U，以及包含作為蛋白酶K激活劑的Sark0Syl、Tween 20或者Nonidet P40。獲得的細胞裂解物中包含的核酸然後通過應用苯酚(其是強力脫蛋白質劑)和氯 仿(其是有機溶劑)的混合物而與蛋白質分離。在離心後，核酸在有機相中溶解，同時在水 相與有機相之間的界面收集蛋白質。在將水相移至另一試管中之後，用氯仿-異戊醇混合物處理核酸。這種處理的結果是消除微量的苯酚，苯酚是一種有機化合物，具有不僅是毒性產物而且還是某些酶包括 聚合酶的抑制劑的缺點。然後通過加入沉澱劑沉澱核酸，所述沉澱劑典型為-20°C的純乙醇，體積是裂解緩 衝液的2. 5倍，或者所述沉澱劑是異丙醇，體積是0. 7倍。隨後在70%乙醇中洗滌沉澱的核酸是除去鹽的不可或缺的步驟。然後將沉澱物置於較低離子濃度的緩衝液中，通常是Tris-EDTA緩衝液 (10/lmM)。儘管在核酸提取中提及苯酚/氯仿方法，但是其具有包括許多步驟且使用苯酚和 氯仿的缺點，苯酚和氯仿是易揮發且毒性產物，必須小心處理。當試圖提取比RNA分子更 易損壞的基因組DNA時，因此傾向於使用裂解緩衝液，所述裂解緩衝液典型包含4-6M硫氰 酸胍、IOmM EDTA,2-6% NLS 和 50mM Tris-HCI (中性 pH)(所謂的經修改的 Crude Susan 方 法)[Chirgwin，J. et al. (1979) Isolation of biologically active ribonucleic acid fromsources enriched in ribonuclease, Biochem. 18 :5294_5299]。這禾中類型的裂角軍 緩衝液使得可以不用苯酚-氯仿而直接在細胞裂解物中進行核酸的沉澱[Jeanpierre， Μ. (1987)A rapid method for the purification of DNA from blood, Nucleic Acids Research 15(22) :9611]。然而，在這些條件下獲得的核酸的質量以及反應的產量不恆定，特別是當較大體 積水相和細胞成分荷載時，根據微生物的性質是可變的。然後可能需要進行核酸的二次沉 澱，以獲得良好質量的 DNA[De Nedjma, A. (2005) Principe de Biologie Moleculaire in Biologie Clinique, Elsevier &Masson]。某些技術使用含有矽珠的微型柱，以便於核酸的洗滌和回收步驟。然而，原理是相 同的，因為也需要在吸附相的核酸沉澱步驟。上述技術不適於製備和檢測少量的核酸。事實上，如上所述，當核酸太稀釋時，其 沉澱變得更隨機，且存在核酸在純化期間喪失的危險增加。因此，本發明的目的是提供一種簡便的、快速且有效的方法從少量微生物中製備 核酸(DNA和RNA)，用以隨後對其進行鑑定。因此，本申請揭示了一種提取和純化基因組DNA的方法，其可用於例如過濾在膜 上的細胞，由此在溶液中使用鹽酸胍和限量的NLS處理所述細胞。根據這種方法，在膜上純 化核酸而不用繼續純化步驟，將由所述膜保留的DNA以適於通過雜交或者PCR檢測的形式 回收在純水或者緩衝的水中。令人驚奇地，本發明人在組合物中使用比在裂解組合物中通常所見更低濃度的 NLS獲得最佳檢測結果。特別注意到，在這個更低濃度，NLS使得可以避免在純化步驟期間 與膜堵塞相關的問題，而且還便於在該方法的後期拯救核酸。本發明目的更特別在於通過PCR鑑定過濾在膜上的極少量微生物，直至 Milliflex 快速檢測系統的ICFU檢測閾值。然而，本發明可用於超出膜微生物學的特定範 圍製備核酸，無論細胞類型如何，特別是用於進行雜交或者擴增反應。獲得的核酸製備物可 用於例如進行PCR反應或者LAMP型等溫擴增反應，或者包含RNA分子的反應如NASBA或者 TMA型擴增，應理解通過逆轉錄步驟可以將RNA序列轉錄為DNA。下圖舉例說明了在本申請書中描述的實施例的結果。


圖1 用於通過PCR檢測微生物的裂解組合物1-7的效力對比。在所有情況中，在 通過相應的裂解組合物處理細胞之後，DNA在包含於(Microcon )離心管中的纖維素膜上 純化。在培養取樣的新鮮細胞(懸浮培養的細胞)、在PVDF濾膜上取樣的新鮮細胞或者在 用ATP-生物發光處理(根據Milliflex 快速檢測方法)之後的PVDF膜上取樣的細胞上進 行實驗。對於PCR抑制對照組，將純DNA導入裂解組合物中，然後在膜上純化，如在其它制 備物的情況中一樣。每個實驗至少檢測所述組合物兩次。檢測的細胞是大腸桿菌。PCR結 果以照片形式提供，示出擴增的再現性和強度。+ 陽性擴增；-陰性擴增；1/2 無再現性； ND 未進行；NA 在膜上陰性結果。圖2 本發明的核酸提取和檢測方法的結果，涉及白色念珠菌和釀酒酵母。瓊脂糖 凝膠示出通過PCR擴增的良好再現性。孔是從左向右編號。1 陽性PCR對照(純白色念 珠菌DNA) ；2-6 (凝膠上部)或者2-5 (凝膠下部)檢測的不同樣品；7 (第一個凝膠)或者 6(第二個凝膠)1000bp plus梯。使用通用的引物進行PCR反應，使得可以檢測單細胞真 菌。在所述膜的合成圖像的中心，示出對每個PCR檢測樣品進行的通過ATP-生物發光通用 檢測的結果。圖3 本發明的核酸提取和檢測方法的檢測結果，其涉及革蘭氏陽性菌(A)金黃色 葡萄球菌(S. aureus)、表皮葡萄球菌(S.印idermidis)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和革 蘭氏陰性菌(B)銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、大腸桿菌、腸道沙門氏菌(S. enterica)的 基因組DNA。瓊脂糖凝膠的孔從左至右編號。1:陽性PCR對照；2-4:使用革蘭氏陽性菌或 者革蘭氏陰性菌通用的引物對3個獨立樣品進行PCR ;5:100pb plus梯。在所述膜的合成 圖像的中心，示出對每個PCR檢測樣品進行的通過ATP-生物發光技術的通用檢測結果。圖4 本發明的核酸提取和檢測方法的檢測結果，其涉及包含大腸桿菌與表皮葡 萄球菌的混合物的細胞群的基因組DNA。A 在Milliflex 方法之後通過ATP-生物發光技 術在三個細胞群中計數細胞混合物。B 在瓊脂糖凝膠上觀測的根據本發明通過PCR擴增 檢測。1 陽性對照；2-4 對於三個細胞群的每一群進行的PCR ；5 陰性對照；6 IOOpb plus 梯。第一列使用通用引物對大腸桿菌和表皮葡萄球菌進行的PCR;第二列使用特異性引 物對大腸桿菌進行的PCR ；第三列使用特異性引物對表皮葡萄球菌進行的PCR ；第四列 使用特異性引物對枯草芽孢桿菌進行的PCR。圖5 通過ATP-生物發光技術(Mi 11 if lex Rapid )及隨後通過PCR和本發明的 微測序進行檢測。A:13CFU的表皮葡萄球菌和9CFU的枯草芽孢桿菌的計數。B 在對純化 自與在A中的膜上檢測的那些細胞相同的表皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌細胞的基因組DNA 的提取物進行PCR擴增的產物的凝膠上進行觀測。C 在B中觀測的擴增產物上進行的微測
序結果。圖6 關於本發明的PCR檢測單細胞真菌和細菌的靈敏性檢測結果。提取相應於 ICFU的基因組DNA，首先通過生物發光檢測，然後根據本發明的方法通過PCR檢測。A 使用 特異於細菌的通用引物對細菌樣品(大腸桿菌)進行PCR的獲得的陽性結果。B:對3個不 同的單細胞真菌樣品(釀酒酵母)進行PCR獲得的陽性結果。圖7 通過ATP生物發光技術和PCR檢測革蘭氏陽性菌痤瘡丙酸桿菌(P. acnes)。 Α:在三個樣品中通過ATP生物發光技術的檢測結果，使得可以評定在5和6CFU檢測的細菌 數目。B 使用通過本發明的提取方法分別提取自這三個樣品的核酸製備物獲得的PCR陽性
7結果。 圖8 得自通過TMA擴增提取自銅綠假單胞菌的兩個核製備物中包含的RNA的RNA 擴增片段的實時累積圖。所述製備物分別相應於大約30和300CFU的細菌。本發明的目的因此是提供一種在膜上提取和檢測核酸的方法，使得可以鑑別在液 體或者氣體介質中或者甚至在表面上低濃度存在的微生物。本發明的方法更特別涉及檢測移至膜上的微生物，通過將液體或者氣體樣品通過 所述膜過濾或者通過將所述膜與能含有或者包含微生物的介質或者表面接觸。所述方法更 特別針對解決鑑別分散在膜表面上的微生物的問題。本發明的方法特別適於鑑別預先在膜 上檢測的微生物，例如使用非特異性方法如在Milliflex快速檢測方法中使用的ATP生物 發光技術。本發明的方法包括提取和純化較少量的細胞(活的或者死的細胞)的核酸。除 了在膜上檢測微生物的特定情況之外，其可用於從中以快速和有效方式提取核酸的任何細 胞。這種方法可特別用於獲得適於進行為鑑定其必需的雜交或者擴增反應形式的RNA和/ 或DNA核酸。這種方法包括如下步驟，其中a)將細胞用鹽酸胍和N-十二烷基-肌氨酸(NLS)在溶液中處理，以使細胞裂解以 及釋放其中包含的核酸；b)從通過將所述裂解物經過膜過濾獲得的細胞裂解物中分離核酸；c)將由所述膜保留的核酸回收在水溶液或者弱離子化水溶液中。如本文所述，「細胞」是指小的生物實體，其包含由膜劃界的細胞質以及含有核酸 形式的遺傳物質。在本發明中，「微生物」是指具有顯微粒徑的細胞，即大小在0. 5-5微米之間，具有 代謝和繁殖潛力，如藻類、單細胞真菌、原生動物、黴菌、細菌以及配子。所述微生物更特別是如下菌屬的革蘭氏陽性或者革蘭氏陰性致病菌假單胞菌 屬，埃希氏菌屬，軍團菌屬，沙門氏菌屬，利斯特氏桿菌屬，桿菌屬，鏈球菌屬，弧菌屬，耶爾 森氏菌屬，葡萄球菌屬，分支桿菌屬，志賀氏菌屬，梭菌屬，彎曲桿菌屬，或者氣單胞菌屬；賈 第蟲屬、內阿米巴屬、隱孢子蟲屬、圓孢子蟲病屬原生動物；支原體(Mycoplasma)和解脲支 原體屬支原體，酵母屬、麴黴屬、念珠菌屬或者青黴屬真菌。在步驟a)中通過鹽酸胍和N-十二烷基_肌氨酸處理細胞可以用一種化合物及然 後再用另一化合物進行，或者甚至同時處理。根據本發明一優選方面，所述處理是使用裂解 組合物進行，所述裂解組合物包含的NLS濃度是所述組合物總重量的0. 1-1 %。所述鹽酸胍是用作裂解劑的一種離液劑。其具有使蛋白質特別是膜蛋白質變性以 及產生滲透壓休克(osmotic shock)的雙重功效。其通常使用的濃度是每升裂解組合物 3_8mo 1 e,優選 4_6mo 1 e。N-十二烷基-肌氨酸(Sarkosyl NL-97或者NLS)是N-甲基_N_ (1_氧代十二烷 基(oxododecyl))甘氨酸的鈉鹽(C15H28NO3Na)15這個分子是與蛋白酶K組合在裂解緩衝液 中常用的去汙劑以溶解蛋白質、特別是膜蛋白質，其濃度為每升幾摩爾。根據本發明，NLS不用作或者至少不主要用作裂解劑。事實上，根據本發明，優選 NLS以裂解組合物最終重量的0. 1-1%的濃度使用，更優選0. 1-0.5%，即在其中細胞裂解 被限制的濃度。
如在本發明申請書的實施例中所示(特別見圖1的結果)，加入在這個濃度的NLS 似的可以改善提取和純化產量，特別是在上述方法的步驟b)和c)中，因此隨後可以使用獲 得核酸製備物進行微生物的鑑定。NLS是一種陰離子去汙劑，其使得蛋白質中幾乎所有非共 價相互作用變性，且趨於使該蛋白質溶解。不受理論所限，本發明人認為NLS在細胞裂解物 通過膜過濾期間以及在隨後的DNA漂洗時促進DNA和蛋白質的分離。如本文所用，「細胞裂解物」是指使用裂解組合物完成步驟a)的處理後在溶液中裂 解的細胞。優選地，本發明的裂解組合物還包含0. 1-lmmol/l的乙二胺四乙酸(EDTA)。盡 管認為EDTA是能抑制許多酶、特別是PCR反應中的聚合酶活性的物質，但是在本發明人進 行的實驗中發現存在EDTA使得不僅可以改善革蘭氏陰性微生物的裂解，也可以改善革蘭 氏陽性微生物的裂解。原則上，EDTA通過螯合二價離子而可以使細菌細胞膜不穩定。在本申請書中，「膜」是指具有兩個表面的一種合成的支持物，其，其孔徑具有已知 的平均直徑。這種膜具有高表面/體積比率。所述膜的厚度通常是恆定的，在90-200微米 之間。這種膜可以是單層或者多層的。其通常由選自如下的一或多種材料組成聚四氟 乙烯，聚偏二氟乙烯(PVDF)，聚碳酸酯，聚醯胺，聚酯，聚醚碸，醋酸纖維素和硝化纖維。在本發明的DNA提取方法的步驟b)中指定的膜通常是稱作的超濾膜的由纖維 素製成的膜，即膜的分子量標稱限制(nominal limit)是3，000-100，000道爾頓，優選 50，000-100，000道爾頓。舉例的這種類型的膜是與microcon 離心管(Millipore公司) 一起提供的膜。根據本發明，在負壓或者正壓的作用下通過所述膜從細胞裂解物中分離核酸。例 如，可以通過使用真空泵使所述膜的一面處於低壓而使所述裂解物通過該膜。這可以在離 心的作用下進行，即對在膜表面的細胞裂解物應用離心力。所述離心作用通常通過將所述 膜置於離心機中放置的支持物如離心管上而獲得。本發明另外提供了在所述方法的步驟b)與C)之間，可以進行洗滌由所述膜保留 的核酸的步驟，使用洗滌溶液如水或者弱離子化水溶液洗滌。所述洗滌溶液在經過所述膜 後被除去。在步驟C)中，可以與在步驟b)中所用或者甚至上述另外的洗滌步驟相反方向，使 所述水或者弱離子化水溶液通過該膜。當通過應用負壓或者正壓或者甚至通過離心而便於 步驟C)進行時，需要將其上固定了所述膜的支持物以與其最初表面相反方向放置，並且在 所述膜的表面上滴一滴弱離子化溶液。通過壓力或者離心發揮的壓力使得水通過所述膜孔，並且從膜中釋放核酸。然後 將所述核酸以水滴滴入收集在離心管底部。在這種情況中，弱離子化溶液是指這樣的溶液，其每升鹽濃度低於10_2mOle/L，更 優選低於 5. l(T3mole/L。更具體地，本發明涉及一種在液體或者氣體介質中檢測一或多種細胞的方法，特 徵在於其包括如下步驟a)將所述液體或者氣體介質樣品通過膜過濾，以使所述樣品中含有的細胞保留在 所述膜上；b)將在步驟a)中的細胞用鹽酸胍和N-十二烷基-肌氨酸(NLS)在溶液中處理，
9獲得含有從所述細胞中釋放的核酸的細胞裂解物；c)將在步驟b)中獲得的細胞裂解物的核酸通過使所述裂解物通過所述膜或者另 一膜過濾而分離；d)將在步驟C)中由所述膜保留的核酸回收在水或者弱離子化溶液中；e)檢測在步驟d)中回收的核酸。所述檢測方法的步驟b)至d)優選相應於本發明的核酸提取和純化方法，即在上 述方法的步驟a)至c)進行的那些步驟。所述檢測方法的目的是計數液體介質如水或者氣體介質如空氣中存在的細胞、更 特別是微生物，同時儘可能地確定其特性(家族、種屬、物種等)。液體或者氣體介質是指能 通過施加壓力差而被過濾通過膜的任何液體，所述膜孔的平均直徑通常為0. 1-1. 5微米， 優選0. 15-0. 8微米，更優選0.2-0. 6微米。這種液體可由組成生產無菌產物一部分的純溶 液組成，也可以是複合溶液(飲用水、血清、尿液、羊水等)，或者也可以是氣體混合物如空 氣。本發明的方法可用於診斷領域，以分析源自動物或者患者的樣品。在所述檢測方 法的步驟a)中，細胞轉移通常在所謂的濾膜上進行，即可以使液體或者氣體介質透過的 膜，然而其平均孔徑使得保留至少80%、優選90%的尋求的細胞或者微生物。優選地，這種 膜主要由PVDF(聚偏氟乙烯)、纖維素或者聚苯碸組成。更優選地，其是由PVDF製成的、由 Millipore公司以Milliflex商標銷售的濾膜，以及提及的MXHVWP124或者RMHVMFX24。根據本發明的一個優選方面，用於在步驟C)中分離裂解組合物的核酸的膜與在 步驟a)中使用的膜不同。在步驟a)中使用的膜可另外置於與營養介質接觸，由此在步驟 a)與b)之間由所述膜保留的細胞或者微生物可以在其表面上生長。所述營養介質通常是 瓊脂糖介質，其營養成分通過毛細管作用到達細胞。在所述膜的表面上繁殖時，細胞形成小 菌落。本發明還提供了 Milliflex技術，這是可以計數膜上微生物的檢測步驟，其可以 在步驟b)中細胞裂解之前提前實施，例如通過在步驟a)與b)之間從細胞中提取ATP以及 使該ATP與包含螢光素和螢光素酶的生物發光試劑反應進行。根據本發明，提取的核酸由RNA和DNA組成，特別是由信使RNA和核糖體RNA以及 基因組DNA組成。本發明的方法具有能使用根據本發明的方法從細胞中提取的RNA以及 DNA的優勢。在步驟e)中檢測核酸優選通過使用能被特異性標記的引物或者探針特異性雜交 在步驟d)中回收的所有或者部分核酸進行。根據本發明，探針是指能識別並組合上述核酸類別之一的大分子，使得其可以標記。根據本發明，引物是指能識別並組合上述核酸類別之一的大分子，以起始所述核 酸的擴增反應。使用的探針或者引物通常是能與提取的核酸中存在的DNA或者RNA序列以一定 程度的特異性雜交的大分子。本發明展望了本領域技術人員已知的可以與核酸特異性 雜交任何類型的探針或者引物，所述核酸例如是簡單的寡核苷酸，2' 0-甲基-RNA型寡 核苷酸，PNA型探針或者引物(由嘌呤和嘧啶鹼基取代的多肽鏈組成的探針)[NielsenP. E. et al. Science(1991)254 :1497-1500]或者 LNA(包含一或多個 2' -0-4' -C-亞甲 基- β -D-核糖呋喃糖基(ribofuranosyl)單體的寡核苷酸)，如專利EP 1013661所述。擴增反應是指可以從所述核酸中合成大分子的酶反應，其存在可以通過標準方法 檢測，例如通過在瓊脂糖凝膠或者丙烯醯胺上層析、顯微測序或者螢光性。本發明的方法因此可以在步驟e)中包括擴增在步驟d)中回收的所有或者部分核 酸的步驟，通過本領域技術人員已知的技術之一進行，如PCR(聚合酶鏈反應)，或者根據本 領域技術人員熟知的技術進行等溫擴增反應，例如NASB[Compton，J.，Nature (1991) 350 91-92]、TMA 或者 LAMP 類型[Notomi T. ,Nucleic Acids Research (2000), 28 (12) :e63]擴
+飽
+曰ο這種擴增通過增加可用於檢測目的的核酸的數量而可用於優化微生物的檢測。如 果這個擴增步驟是高度特異性的，其還可以高選擇性鑑別微生物。根據本發明的方法獲得核酸製備物特別適於通過擴增檢測核酸。本發明還提供了提取核酸的試劑盒，特徵在於其包含膜，優選由纖維素或者 PVDF製成的膜；以及如前文所述裂解組合物。此外，這種試劑盒可有利地包含一或多種特 異性探針或者引物，以對提取的核酸進行檢測，特別是通過雜交或者通過PCR檢測。任選 地，這種試劑盒還可包含另一種膜以過濾液體或者氣體介質。這種試劑盒使得可以實施本 發明的方法。這種試劑盒可特別用於實施DNA的提取和純化方法，以及隨後在先前限定的條件 下鑑別所述細胞或者微生物。如下實施例用於補充本發明的描述，無任何限制本發明之意義。 實施例材料和方法檢測的微生物在後文描述的檢測檢驗中使用的微生物得自美國典型微生物保藏中心ATCC。菌株 的參考編號在表1中提供。表1:使用的微生物
權利要求
裂解組合物，特徵在於其包含鹽酸胍和N 十二烷基 肌氨酸(NLS)，其中包含的所述NLS濃度相對於所述組合物的總重量在0.1 1％之間。
2.權利要求1的裂解組合物，特徵在於包含的所述鹽酸胍濃度在3-8mol/l之間。
3.權利要求1或2的裂解組合物，特徵在於其還包含EDTA。
4.權利要求3的裂解組合物，特徵在於所述組合物包含的EDTA的濃度在0.1-lmmol/l 之間。
5.權利要求1-4任一項的裂解組合物，特徵在於其以溶液形式存在。
6.提取一或多種細胞的核酸的方法，特徵在於其包括如下步驟a)用鹽酸胍和N-十二烷基-肌氨酸(NLS)溶液處理所述細胞，使細胞裂解及釋放其包 含的核酸；b)經過膜過濾步驟a)中獲得的細胞裂解物而從所述裂解物中分離核酸；c)將通過所述膜保留的核酸回收在水溶液或者弱離子化水溶液中。
7.權利要求6的方法，特徵在於所述溶液中使用的NLS的濃度在0.1-1%之間。
8.權利要求6或7的方法，特徵在於鹽酸胍和NLS同時用於權利要求5的裂解組合物中。
9.權利要求6-8任一項的方法，特徵在於步驟b)中使用的從細胞裂解物中分離核酸的膜是纖維素膜。
10.權利要求6-9任一項的方法，特徵在於步驟b)中使用的膜的分子量標稱限制在 3，000-100, 000道爾頓之間，優選在50，000-100, 000道爾頓之間。
11.權利要求6-10任一項的方法，特徵在於在負壓或者正壓的作用下通過膜從細胞裂 解物中進行核酸分離。
12.權利要求6-10任一項的方法，特徵在於在離心作用下通過膜從細胞裂解物中進行 核酸分離。
13.權利要求6-12任一項的方法，特徵在於在步驟b)和c)之間進一步包括使用洗滌 溶液如水或者弱離子化水溶液洗滌由所述膜保留的核酸的步驟，這個洗滌溶液在經過所述 膜之後被清除。
14.權利要求6-13任一項的方法，特徵在於在步驟c)中，通過使所述水或者弱離子化 水溶液以與步驟b)中所用的方向相反的方向經過所述膜而回收所述核酸，優選在負壓或 正壓或者離心作用下進行。
15.檢測液體或者氣體介質中一或多種細胞的方法，特徵在於其包括如下步驟a)將所述液體或者氣體介質樣品通過膜過濾以使所述樣品中含有的細胞保留在膜上；b)將在步驟a)中保留的細胞用鹽酸胍和N-十二烷基-肌氨酸(NLS)溶液處理，以獲 得含有從所述細胞中釋放的核酸的細胞裂解物；c)通過所述膜或者通過另一膜過濾所述裂解物，從而從在步驟b)中獲得的細胞裂解 物中分離核酸；d)將在步驟c)中由所述膜保留的核酸回收在水或者弱離子化水溶液中；e)檢測在步驟d)中回收的核酸。
16.權利要求15的方法，特徵在於使用探針或者特異性標記的引物通過與在步驟d)中2回收的所有或者部分核酸進行特異性雜交而進行步驟e)中的核酸檢測。
17.權利要求15或16的方法，特徵在於步驟e)中核酸的檢測包括擴增在步驟d)中回 收的所有或者部分核酸的步驟。
18.權利要求17的方法，特徵在於所述擴增步驟包括聚合酶鏈反應(PCR)。
19.權利要求18的方法，特徵在於所述擴增步驟包括等溫擴增，如LAMP、NASBA或者 TMA型擴增。
20.權利要求15-19任一項的方法，特徵在於步驟e)中的核酸檢測包括RNA逆轉錄為 DNA的步驟。
21.權利要求15-20任一項的方法，特徵在於在步驟c)中用於分離裂解組合物的核酸 的膜與步驟a)中使用的膜不同。
22.權利要求15-21任一項的方法，特徵在於根據權利要求6-14任一項的方法的步驟 a)至c)進行步驟b)至d)。
23.權利要求15-22任一項的方法，特徵在於步驟a)中使用的膜置於與營養介質接觸， 由此在步驟a)和b)之間微生物可以在所述膜的表面上生長。
24.權利要求15-23任一項的方法，特徵在於通過使提取自微生物的ATP與生物發光試 劑反應在步驟a)和b)之間進行檢測步驟，所述檢測步驟使得可以計數微生物，所述生物發 光試劑如包含螢光素和螢光素酶的試劑。
25.提取核酸的試劑盒，特徵在於其包含-過濾膜，-權利要求1-5任一項的裂解組合物。
26.檢測微生物的試劑盒，特徵在於其包含-過濾膜，-權利要求1-5任一項的裂解組合物，-用於通過雜交或者通過PCR檢測提取的核酸的一或多種特異性引物。
全文摘要
本發明涉及在膜上提取和檢測核酸的方法，使得可以鑑別液體或者氣體介質中低濃度存在的微生物，本發明還涉及一種新的裂解組合物，其包含鹽酸胍以及0.1-1％的N-十二烷基-肌氨酸(NLS)，使得可以實施這種方法。
文檔編號C12N15/10GK101978058SQ200980110269
公開日2011年2月16日 申請日期2009年1月19日 優先權日2008年1月21日
發明者F·馬克, R·伊薩克 申請人:米利波爾公司