醫用膠原蛋白海綿及其製造工藝的製作方法
2023-09-18 23:46:00
專利名稱：醫用膠原蛋白海綿及其製造工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬醫療器械敷料類，具體地說就是以膠原蛋白製成海綿狀物，應用於臨床用以止血和促進傷口癒合。
膠原蛋白是生物體內最豐富，廣泛存在的一種結構蛋白質，它存在於結締組織中，是皮膚、骨骼、肌腱的主要組成成份。各種組織中分離出來的膠原蛋白的分子量約為283000，它由二個相同的含1056個α-胺基酸殘基的α1亞基和一個含1029個α-胺基酸殘基的α2亞基所組成，構成三螺旋的基本結構，它們在組織中以纖維狀態存在，起著支架作用。在進化上，膠原蛋白是十分保守的，種屬間差異很小，因而免疫源性極低。所以從動物組織中(如牛跟腱)提取出來的膠原蛋白可作為被人體接受的植入原料。利用膠原蛋白的理化特性，生物學特性、免疫學特性及機械物理方面的特性；利用它的易被修飾和可塑性；製造成膠原蛋白海綿，應用於臨床醫療。
目前以膠原蛋白為基楚的醫療產品研究和開發正方興未艾。近十餘年來膠原蛋白在生物醫學上的運用已經進入一個新時代，隨著科學的進步膠原蛋白材料在醫學上潛在的功能和作用不斷被發現，必將加速膠原蛋白在醫藥科學方面的發展。我查閱和檢索了四十年至今的膠原蛋白國內外研究文獻和發明專利，供鑑前人經驗，積多年知識積累，完成本專利的研製。
在臨床止血材料的研究中，曾有以多糖類、膠原蛋白等為主要原料，製成各種形式膜，或者海綿狀物，作為止血材料。或將膠原蛋白經過浸泡止血劑，以增強止血作用(US-4.606910)。可由牛或豬來源的生物材料，經過酸、鹼分離純化，溶脹、粉碎、稀釋和冷凍乾燥生產細孔的膠原蛋白海綿應用於臨床止血。(DE-3203-957)。有用酸處理的動物結締組織(真皮、肌腱)再經冷凍乾燥製造出多孔的膠原片材料。(US-4,412,947)90年代初開始分別以酸，鹼處理，濃縮，洗滌、脫水乾燥等方法生產具有天然結構的醫藥膠原膜。具有止血、保護創面、促進傷口癒合功效。(US-5,028,695)。提取膠原蛋白的原材料由動物的結締組織進展到人體組織上來，利用胎盤、胎膜、臍帶提取人體膠原蛋白製成膜，更降低了免疫源性，增加了臨床應用的安全性(JP特開平5-56987)。近幾年來膠原蛋白提取製備技術趨向完善，經酸、鹼、鹽、酶解、冷凍乾燥技術處理製成海綿狀物，廣泛應用於臨床。(RU-2039766)。94年進入我國醫藥市場的歐洲科研大藥廠生產的解爾分恩片(GELIX)就屬上述類型產品。國內關於膠原蛋白製備技術也有報導，將膠原蛋白製備成膜，用以止備和覆蓋燒傷創面，已收到一定療效，(醫用膠原蛋白和膠原膜研製及臨床應用。中華創傷雜誌95.11(3)-149-150)。
本發明的目的在於公布一種醫用膠原蛋白海綿及其製造工藝。本發明的醫用膠原蛋白海綿具有良好的止血效果，尤其對組織滲血，實質臟器出血效果更佳。它能促進纖維母細胞、毛細血管的生長，具有促進傷口癒合的作用，用膠原蛋白海綿覆蓋燒傷創面有防止感染，減少分泌物，減少疤痕組織作用，有促進皮膚潰爛、瘻管、竇道及褥瘡癒合作用。
現將本
發明內容
說明如下1．從肉聯廠購買新鮮牛跟腱，剔出跟腱外殼，肌肉、脂肪組織及其他雜質，自來水衝洗三遍，去離子水衝洗三遍。
2．75％酒精浸泡5分鐘消毒處理，再用無菌水衝洗後冷凍8小時，然後取出切成厚為1mm片或勻漿。
3．將牛跟腱片(或勻漿液)以50～60倍體積，稀鹼液(NaOH、KOH、NaHCO3、CaCO3)PH8.5浸泡過液，充分溶脹。在10℃條件下，用鹼性蛋白酶水解96小時，酶量按1∶500～1000加入，將酶解液離心4000rpm 20分鐘，保留沉澱1，收集上清夜1，向上清液中加入有機溶劑0.25～25％(W/W)(甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇)混勻過夜，離心12000rpm 30分鐘，棄上清液2，保留沉澱2(即膠原蛋白)。
4．將上述沉澱用無菌水稀釋5倍，用酸調PH至2.0±0.5(甲酸、乙酸、丙二酸、檸檬酸)，加蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶)按1∶500～1000(V/V)，在10℃條件下水解96小時，離心4000rpm 20分鐘，棄沉澱3留取上清夜3，加入有機溶劑0.25～25％(V/V)，(甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇)充分混勻。離心12000rpm 30分鐘，棄上清液4，留取沉澱4(即膠原蛋白)。
5．將兩次沉澱(膠原蛋白)裝入透析袋透析至無有機溶劑為止。
6．收集透析後的膠原蛋白，以0.05～15％(V/V)的交聯劑(甲醛、乙醛、戊二醛)交聯2小時，加入凝血酶。
7．將交聯的膠原蛋白裝在特製的模型中，進行冷凍乾燥24～32小時，溫度變化-40℃～35℃，升溫1～2℃/小時，真空度6～4Pa。
8．最後將製得的膠原蛋白海綿包裝，用CO60照射後入庫。
本發明與現有的醫用膠原蛋白生產技術相比有如下優點1．現有的醫用膠原蛋白產品製造過程中，共同的缺點是缺少除脂肪工藝過程，所以在他們的產品中都含有一定量的脂肪。由於脂肪的存在大大降低了膠原蛋白的生物功能，影響膠原蛋白製品的保存時間。因為脂肪酸在氧分子的作用下產生酸敗反應，釋放超氧陰離子(過氧化脂質)，它對全身和局部傷口都將產生損害作用，而且這種酸敗反應隨著時同推移會加重。所以目前進口同類產品五年有效期是不夠安全的，(如歐洲科研大藥廠生產的解爾分思片[GELIX]中含有脂肪酸，有效期五年)，因為有效期長短決定於留樣觀察實驗，而留樣觀察實驗沒有注意到從分子水平上觀察膠原蛋白中所含脂肪酸的變化情況。本發明彌補了上述的不足，在製造過程中增加了除脂肪的工藝步驟。這樣本發明產品五年有效期內，相對比進口產品安全係數大。
2．本發明增添了凝血因子。所以凝血效果甚佳，並有良好的粘附性和組織相溶性，易被組織吸收，經動物實驗觀察證明四周後本發明醫用膠原蛋白海綿可被完全吸收。
3．本發明在提取膠原蛋白過程中是在低溫情況下，使用微量蛋白酶水解得到的膠原蛋白具有生物活性，因此製成醫用膠原蛋白海綿臨床應用效果顯著。
4．原材料廣泛、成本低，生產工藝先進，設備簡單。
本人認為實現本發明最好方式，最快捷徑是在原藥廠的基楚之上，有萬級潔淨區，有低溫高速冷凍離心機和冷凍乾燥機等主要設備就可以建立一條醫用膠原蛋白海綿生產線。
實例稱取牛跟腱5Kg，用自來水清洗，剔除跟腱外殼，脂肪，肌肉等雜質，自來水再衝洗三遍，去離子水衝洗三遍，浸泡在75％酒精5分鐘，取出用無菌水衝洗後冷凍8小時，取出切片厚度1mm，加無菌水300L配成稀鹼液PH8.5浸泡過夜，加入鹼性蛋白酶10g、在10℃條件下酶解反應96小時，取出反應液離心4000rpm 20分鐘，得沉澱約50L，(留作下步處理)上清夜約250L，丙酮20L，離心12000rpm 30分鐘，棄上清夜得膠原蛋白顯重約8Kg，將上步留下的50L沉澱，加無菌水250L，用丙二酸調PH至2.5，加木瓜蛋白酶20g水解96小時，離心4000rpm 20分鐘，棄沉澱，留上清夜約250L，加20L丙酮，靜置4小時後離心12000rpm 30分鐘。棄上清，得膠原蛋白8Kg，將兩次獲得膠原蛋白透析至中性。取出後用2.5％戊二醛交聯，裝模型5×5×0.4方盤中進行冷凍乾燥，可得1350片膠原蛋白海綿，經內外包裝後經CO60照射消毒即可入庫。
權利要求
1．醫用膠原蛋白海綿及其製造工藝，是以牛跟腱為原料，經過精選剔出雜質、脂肪和肌肉組織後清洗、消毒、經酶解、酸、鹼和有機溶劑處理，獲得膠原蛋白純品，經交聯劑交聯再經冷凍乾燥製成醫用膠原蛋白海綿，應用臨床有止血和促進傷口癒合的功效。
2．根據權利要求1所述醫用膠原蛋白海綿及其製造工藝特徵之一在於以牛跟腱為原料，因為牛跟腱中含膠原蛋白Ⅰ型，含量高易提純。
3．根據權利要求1所述醫用膠原蛋白海綿及其製造工藝特徵之四是鹼處理，要求保護使用鹼的種類NaOH、KOH、NaHCO3、Na2CO3。
4．根據權利要求1所述醫用膠原蛋白海綿及其製造工藝特徵之三是用酸處理，要求保護使用酸的種類甲酸、乙酸、丙二酸、檸檬酸。
5．根據權利要求1所述醫用膠原蛋白海綿及其製造工藝其特徵之二是以微量蛋白酶，低溫限制性水解牛跟腱的膠原蛋白、所獲膠原蛋白具有生物活性，要求保護酶的種類胃蛋白酶，木瓜蛋酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶及酶的用量1∶500-1000(v/v)。
6．根據權利要求1所述醫用膠原蛋白海綿及其製造工藝，特徵之五使用有機溶劑處理，要求保護有機溶劑種類甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、正丁醇及濃度0.25～25％(V/V)。
7．根據權利要求1所述醫用膠原蛋白海綿及其製造工藝特徵之六，使用交聯劑，要求保護交聯劑種類甲醛、乙醛戊二醛及濃度0.05～15％。
8．根據權利要求1所述醫用膠原蛋白海綿及其製造工藝特徵之七冷凍乾燥24～32小時，溫度變化-40℃～35℃，升溫1～2℃/小時，真空度6～4Pa。
全文摘要
醫用膠原蛋白海綿及其製造工藝,屬醫療器械敷科類,利用生物材料—牛跟腱提取膠原蛋白。經過酸、鹼、有機溶劑處理後獲得純淨膠原蛋白,再經交聯冷凍乾燥後製成細孔海綿狀物。臨床治療用以止血(滲血)和實質臟器出血,促進傷口癒合,覆蓋燒傷創面、防止感染、減少滲出、減少疤痕。用以治療慢性皮膚潰爛、褥瘡、瘻管、竇道等。
文檔編號A61L15/32GK1210019SQ9811776
公開日1999年3月10日 申請日期1998年9月10日 優先權日1998年9月10日
發明者戰麗芬 申請人:戰麗芬