新的產生同質琥珀酸的工程微生物以及使用這此微生物製備同質琥珀酸的方法
2023-09-18 12:23:10 2
專利名稱：：新的產生同質琥珀酸的工程微生物以及使用這此微生物製備同質琥珀酸的方法
技術領域：
：本發明涉及一種產同質琥珀酸的瘤胃細菌突變體以及使用這些瘤胃細菌突變體製備同質琥珀酸的方法，具體涉及選自在厭氧條件下產生高濃度琥珀酸同時很少產生或者不產生其他有機酸的瘤胃細菌突變體，所述瘤胃細菌突變體通過使編碼乳酸脫氫酶的基因、編碼磷酸轉乙醯酶(phosphotransacetylase，的基因和編碼乙酸激酶(acA4)的基因斷裂但不使編碼丙酮酸甲酸裂解酶(//7)的基因斷裂而得到，還涉及使用這些瘤胃細菌突變體製備琥珀酸的方法。
背景技術：
：琥珀酸(HOOCCH2CH2COOH)，一種包括4個碳原子的二羧酸，是一種具有高度實用性的有機酸，其被廣泛用於藥物前體、食品、化妝品以及其他工業的化學產品(Zeikus等人，j/p/.Af/croWo/.5z'ofec/z"o/.,51:545,1999;Song等人，M,c油Wrec/mo/.,39:352,2006)。特別是，隨著最近石油價格暴漲，預期對於將琥珀酸作為生物降解大分子的主要來源的需要急劇增加(Willke等人，^//.MfcroWo/.5/Wec/mo/.，66:131,2004)。琥珀酸可通過化學合成法和發酵法生產。但是，用於工業應用的大部分琥珀酸目前由中國石化公司、日本石化公司和大的石化公司諸如BASF,DuPont,BP石化等使用來自石油的n-丁烷和乙炔作為原料通過化學合成法生產，僅僅少量用於專門用途諸如藥物等的琥珀酸是通過常規微生物發酵法來生產的。上面提到的化學合成法的問題是在琥珀酸生產過程中排出了大量產生的有害廢物、廢水和廢氣(例如co等)。特別是，極可能資源耗盡的礦物燃料被用作基本材料，因此迫切需要開發一種使用替代燃料諸如可再生資源代替礦物燃料來製備琥珀酸的方法。為了克服由製備琥珀酸的化學合成過程引起的這些問題，許多研究者己經就通過使用各種可再生資源進行微生物發酵產生琥珀酸方面進行了深入廣泛的研究。已經被用於琥珀酸生產的微生物有很多，但它們一般可被歸類為重組大腸桿菌(&c/zeWc/H》.Co//)和瘤胃細菌(放線桿菌，厭氧螺菌，類桿菌，Mannheimia，琥珀酸單胞菌，琥珀酸弧菌等)(Song等人，五w2^meM"/croZ>//Tec/mo/"39:352,2006)。在關於使用重組Eco//生產琥珀酸的研究中，試圖通過製備突變AFP111(ATCCNo.202021)增加琥珀酸的產量，所述突變AFP111由芝加哥大學研宄組通過其中葡萄糖轉運基因(ptsG)受到調控同時在E.coli中生產乳酸和蟻酸中涉及的基因(ldh和pfl)被剔除而得到(美國專利US5,770，435)。本發明的發明人在重組五.co//NZN111菌株中擴增了在琥珀酸產生中涉及的蘋果酸酶G/cJ)基因，從該菌株中剔除了ldh和pfl基因以抑制在NZNlll菌株的發酵過程中積累的丙酮酸，從而增加了琥珀酸的產量(Hong等人，5z'o^c/mo/.所oe"g.,74:89,2001)。而且，喬治亞大學領導的團隊的研究人員己經通過在AFPlll菌株中表達丙酮酸氧化酶(pyc)基因構建了AFPlll/pTrc99A-;;;c菌株，然後使用該菌株生產琥珀酸(Vemuri等人，《/.M/cro編.5/o&c/mo/"28:325,2001)。近來，為了誘導琥珀酸在厭氧條件下產生，RiceUniversity領導的團隊的研究人員報導了他們已經通過對糖酵解途徑，TCA循環和乙醛酸途徑中涉及的基因構建了重組E.coli菌株(Lin等人，￡"g.，7:116,2005;LinWa/"5/她c/mo/.90:775，2005)。已知作為瘤胃細菌的放線桿菌菌株、厭氧螺菌菌株和M朋"/^/m/"菌菌株是非常好的琥珀酸產生菌，於是對這些菌株進行了積極的研究。美國MichiganBiotechnologyInstitute(MBI)領導的團隊的研究人員發現了琥珀酸放線桿菌(爿c"wo6acz7/wwcc/"oge"es)130Z菌株(ATCCNo.55618)，使用傳統的化學誘變方法發展了用於生產琥珀酸的方法和構建的各種琥珀酸放線桿菌突變菌株，以便在發展用於生產並純化琥珀酸的工藝中使用(美國專利US5,521,075;美國專利US5,168,055;美國專利US5，143，843)。但是，迄今為止發展的使用微生物發酵的琥珀酸生產工藝具有不到2g/L/h的非常低的產量，尤其是其招致了極大的成本來分離並純化琥珀酸，因為在發酵過程中琥珀酸與在某些程度上作為副產品的大量各種有機酸和乙醇一起產生。雖然上述結果顯示在一些重組菌株中作為副產品的乳酸、蟻酸、醋酸和乙醇的影響減小，但沒有顯示它們完全被消除。另外，在其他重組的突變菌株中，存在的一些情況是它們的生長速率變得很低，總琥珀酸產量並沒有增加。因此，迫切需要開發新的琥珀酸產生菌株，其具有高琥珀酸產量並防止副產品的產生(Hong等人,5涵c/mo/.22:871,2000)。為了開發新的琥珀酸產生菌來滿足上述需要，必須進行具有非常高的琥珀酸產量的菌株的分離，完成其基因組序列，理解其新陳代謝特性並建立對於構建重組菌株所需的遺傳操作技術。到目前為止，在具有高琥珀酸產量的細菌的情況下，完成了MTOCc/"/c^ra^ce"sMBEL55E菌株的全基因組序列，但是那些瘤胃細菌諸如放線桿菌，厭氧螺菌等仍未見報導。雖然已經報導了試圖通過在五.co//中擴增Awcc/"oge"w和Awcc/"/c^o^ce似的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pckA)基因的嘗試(Kim等人，J///.￡>rwyow.Af/croZn'o/.,70:1238,2004;丄az'vew/e^s等人，五"vzVo".M/croWo/.，63:2273,1997)，但沒有嘗試基於基因組序列開發重組琥珀酸產生菌。本發明的發明人己經報導了他們分離了來自韓國本土黃牛的高效產生琥珀酸的M;ywcc/m'"》a"o^ce似MBEL55E(KCTC0769BP)，完成了基因組序列並描述了菌株的新陳代謝特性(Hong等人A^z^5/o^/mo/.,22:1275，2004)。而且，本發明的發明人通過使作為瘤胃細菌的一種的A/.wcc/m'"jwoafwce"sMBEL55E中編碼乳酸脫氫酶(W/l4)的基因和編碼丙酮酸甲酸裂解酶te/)的基因斷裂以抑制乳酸和蚊酸的產生構建了細菌突變體Mswcc/"/":^o^ce"sLPK(KCTC10558BP)。除此之外，本發明通過在突變菌株Mwcc/m'c^w/McmsLPK中使編碼磷酸轉乙醯酶(Wfl)的基因和編碼乙酸激酶(flcLi)的基因斷裂以便抑制醋酸的產生構建了突變Mracc/m'"^o^ce似LPK7(KCTC1062BP)，以在厭氧條件下培養細菌突變體(WO05/052135Al;Lee等人，五"v/ra".M/croWo/.72:1939,2006)，從而增加琥珀酸。但是，在所述突變菌株的情況下，雖然副產品蟻酸和醋酸的產生在一定程度上受到抑制，但在發酵過程中大量的丙酮酸作為副產品積累，與野生菌相比其中絕大多數細菌的生長速率低致不能達到很高的琥珀酸產量。同時，據報導丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)基因參與丙酮酸到乙醯輔酶A(乙醯-CoA)的轉化，從而影響細胞的生長和丙酮酸的重新分布(Wolfe，AZ/cro6/a/.Afo/.醜z'o/.iev.，69:12,2005)。因此，本發明的發明人付出了極大的努力，通過將微生物生長率的降低最小化並完全抑制各種副產品包括丙酮酸的形成，構建了能夠高產量產生同質琥珀酸的突變微生物，並發展了其發酵方法，結果，他們通過在作為瘤胃細菌的一種的A/:wcc/"/c&ro^/ce";jMBEL55E中使編碼乳酸脫氫酶(W/2j)的基因、編碼磷酸轉乙醯酶(pto)的基因和編碼乙酸激酶(acLi)的基因斷裂但不使編碼丙酮酸甲酸裂解酶0^/7)的基因斷裂而構建了細菌突變體M.swcc/m'";^o^ce/wPALK(KCTC10973BP)，然後在厭氧條件下使用葡萄糖和甘油作為碳源發酵突變菌株，並確認突變菌株可高產量產生幾乎同質的琥珀酸，從而完成了本發明。
發明內容因此，本發明的一個目的在於提供突變微生物，其具有高生長率和琥珀酸產率並在厭氧發酵階段過程中僅僅以高產量產生琥珀酸同時產生很少其他有機酸或者不產生其他有機酸。本發明的另一目的在於提供通過使用葡萄糖和甘油作為碳源在厭氧條件下培養突變微生物產生同質琥珀酸而不積累其他副產品的方法。為了實現上述目的，本發明提供了產生琥珀酸微生物中缺乏乳酸脫氫酶(ldhA)基因、磷酸轉乙醯酶(;to)基因和乙酸激酶("c^A)基因而同時僅保持蟻酸裂解酶(pfl)基因的瘤胃細菌突變體，其具有在厭氧條件下僅僅高濃度產生琥珀酸同時很少產生或者不產生有機酸的特性。而且，本發明提供了在wcc/"/c^n^Mce"s中缺乏乳酸脫氫酶(ldhA)基因、磷酸轉乙醯酶(;to)基因和乙酸激酶(acA:A)基因而同時保持蟻酸裂解酶(pfl)基因的瘤胃細菌突變體Afo""/ze/m/aswcc/"/";pro^ce似PALK(KCTC10973BP)，其具有在厭氧條件下僅僅高濃度產生琥珀酸同時很少產生或者不產生有機酸的特性。另外，本發明提供了用於生產瘤胃細菌突變體的方法，所述方法包括下列步驟(a)使用同源重組法再琥珀酸產生瘤胃細菌的基因組中通過使乳酸脫氫酶(ldhA)基因斷裂得到缺乏編碼乳酸脫氫酶(ldhA)基因的瘤胃細菌突變體；和(b)通過同源重組從缺乏編碼乳酸脫氫酶(/^4)基因的瘤胃細菌突變體的基因組中使編碼磷酸轉乙醯酶(;to)的基因和編碼乙酸激酶(acLi)的基因斷裂得到缺乏編碼乳酸脫氫酶(W/l4)基因、編碼磷酸轉乙醯酶(^")的基因和編碼乙酸激酶("c^i)的基因的瘤胃細菌突變體。此外，本發明提供了用於生產琥珀酸的方法，所述方法包括下列步8驟在厭氧條件下培養瘤胃細菌突變體；並且從培養液中回收琥珀酸。通過下列詳細描述和所附的權利要求書，本發明的其他特徵和實施例將更加明顯。圖1是顯示根據本發明的在突變微生物中的琥珀酸產生途徑的示意圖。圖2顯示了通過同源重組構建用於斷裂W/l4(pMLKO-sacB)的置換載體的過程。圖3顯示了通過同源重組使Ma朋/2e/w/a^Mc"7n'ci^oi/wcewsMBEL55E中的ldhA基因斷裂構建細菌突變體(Mwcc/m'c^ro^cewLK)的過程。圖4顯示了通過同源重組構建用於斷裂W"和acL4(pPTA-sacB)的置換載體的過程。圖5顯示了通過同源重組使;ywcc/m'c^ra^ce似PALK中的W/^4和；to-^L4基因斷裂構建細菌突變體的過程。圖G使顯不M/"/";pro￡/wce"sPALK中的pto-acL4的斷裂的電泳照片，其中M代表lkb的標記物，第l-6道代表使用引物PAUl和SP1的PCR片段(l.lkb);A-F道代表使用引物SP2和PAD2的PCR片段(1.5kb)。圖7顯示了本發明的M.swcc/m'c/^0(iMce似PALK在C02飽和的厭氧條件下的培養特性。具體實施例方式在一個方面，本發明涉及產生琥珀酸微生物中缺乏乳酸脫氫酶(ldhA)基因、磷酸轉乙醯酶(;to)基因和乙酸激酶(fl^A)基因斷裂而同時僅保持蟻酸裂解酶(pfl)基因的瘤胃細菌突變體，其具有在厭氧條件下僅僅高濃度產生琥珀酸同時很少產生或者不產生有機酸的特性。在本發明中，產琥珀酸的微生物指的是與乙醇或者其他有機酸相比能夠產生超大量琥珀酸的微生物，其可通過發酵被用於琥珀酸生產的工業用途。典型的產琥珀酸微生物包括瘤胃細菌。通過部分遺傳信息(16srRNA)，酶分析，作為瘤胃細菌屬琥珀酸放線桿菌、厭氧螺菌和到目前為止已知的各種琥珀酸產生瘤胃細菌的發酵結果，發現在瘤胃細菌中用於通過碳源進行琥珀酸生產的主要生物合成途徑與作為瘤胃細菌屬的一種的Afo""/ze/附/asp中用於琥珀酸產生的合成途徑幾乎相同(表1;VanderWerf等人，爿rc/zM/cro6/o/.,167:332,1997;Laivenieks等人，乂///.M/mWo/"63:2273,1997;Samuelov等人，￡,>ow.Mc油.o/"65:2260,1999;Kim等人，￡謂.戰緣疏o/"70:1238，2004))。尤其是在琥珀酸生產中涉及的所有的瘤胃細菌在琥珀酸生產時使用C02固定酶將磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸、C3化合物轉化成草醯乙酸鹽和蘋果酸鹽、C4化合物，從而產生琥珀酸。另外，瘤胃細菌在厭氧條件下產生醋酸、蟻酸和乳酸作為發酵副產品，從而建議所有的瘤胃細菌包括Ma""/e/m/asp具有相同的琥珀酸生物合成途徑。表1tableseeoriginaldocumentpage11</table在本發明中，能夠高濃度產生琥珀酸同時很少或者不產生其他有機酸的具有高生長速率的產琥珀酸突變微生物通過操作產琥珀酸微生物的瘤胃細菌基因組構建。換言之，乳酸脫氫酶(ldhA)基因、磷酸轉乙醯酶(;m)基因和乙酸激酶("cAA)基因在Mracc/"/c^rafl^ce"sMBEL55E(KCTC0769BP)的基因組DNA中被斷裂，從而構建了細菌突變體Mwcc/"/ci^o^ce"sPALK(KCTC10973BP)，其顯示了高生長率並產生高濃度琥珀酸同時產生很少或者不產生其他有機酸。在本發明中，為了每個基因的斷裂，採用了通過同源重組置換基因使其失活的方法，但任何方法都可無限制地被使用，只要其為其中相應基因可被修飾或者剔除使不產生由相應基因編碼的酶的基因操作方法。在本發明中，瘤胃細菌選自由M"""/^m&屬、放線桿菌屬和厭氧螺菌屬所組成的組。在本發明中，突變微生物優選僅僅產生琥珀酸同時形成很少或者不形成其他有機酸副產品的同質發酵菌株，所產生的其他有機酸的量優選少於產生的琥珀酸量的lwt%，其他有機酸優選為任何一種或多種有機酸，其選自由乳酸、醋酸、蟻酸和丙酮酸所組成的組。在另一方面，本發明涉及在Mwcc/"/c^ro^ce似中缺乏乳酸脫氫酶(W/^)基因、磷酸轉乙醯酶(;to)基因和乙酸激酶OdtA)基因同時保持丙酮酸甲酸裂解酶fe/7)基因的瘤胃細菌突變體Mracc/m'c^ro^cewPALK(KCTC10973BP)，其具有在厭氧條件下高濃度產生琥珀酸同時很少產生或者不產生有機酸的特性。通過使用在Mfl""/ze/m/fl屬的基因組中使編碼乳酸脫氫酶(W/l4)基因，丙酮酸甲酸裂解酶fe/)基因，磷酸轉乙醯酶(pto)基因和乙酸激酶(adA)基因斷裂構建的Mwcc/"/";^o^ce似LPK7(KCTC10626BP)以便將根據本發明的Afow"/^/m/aswcc/m'ci^ro<iwceraPALK(KCTC10973BP)的琥珀酸產率和生長率與傳統細菌突變體進行比較。這裡，細菌突變體M.swcc/m'c^^^wce似LPK7(KCTC10626BP)具有在根據本發明的Mswcc/m'c^n^wcewPALK(KCTC10973BP)中編碼丙酮酸甲酸裂解酶(p;7)的基因另外的斷裂(WO2005/052135;Lee等人，五m^o".M/c油'o/.72:1939,2006)。根據本發明的Ms"cc/"/"jwo^ce朋PALK(KCTC10973BP)具有高琥珀酸產率並產生很少或者不產生副產品諸如乳酸、醋酸、蟻酸和丙酮酸，從而與用於琥珀酸生產的野生型MTOCc/"/c&rai/wce";yMBEL55E(KCTC0769BP)和以前構建的細菌突變體Mwcc/"/c^Y^wce朋LPK7(KCTC10626BP)相比顯示了優異的性能，與以前構建的細菌突變體Mracc/"/")^ocfwce似LPK7(KCTC10626BP)相比通過防止丙酮酸積累，由12於其高生長率、高琥珀酸產率和同質琥珀酸產生從而可產生高濃度琥珀酸。在還一方面，本發明涉及用於構建瘤胃細菌突變體的方法，所述方法包括下列步驟(a)使用同源重組法在產琥珀酸瘤胃細菌的基因組中通過使乳酸脫氫酶(ldhA)基因斷裂得到缺乏編碼乳酸脫氫酶(ldhA)基因的瘤胃細菌突變體；和(b)通過同源重組從缺乏編碼乳酸脫氫酶(W/l4)基因的瘤胃細菌突變體的基因組中使編碼磷酸轉乙醯酶(pto)的基因和編碼乙酸激酶("d々的基因斷裂得到缺乏編碼乳酸脫氫酶(W/l4)基因、編碼磷酸轉乙醯酶(;to)的基因和編碼乙酸激酶(flcLi)的基因的瘤胃細菌突變體。在本發明中，同源重組步驟(a)優選使用含有斷裂的ldhA的基因交換載體進行，同源重組步驟(b)優選使用含有斷裂的pta-ackA的基因交換載體進行。在本發明中，含有斷裂的ldhA的基因交換載體優選pMLKO-sacB，含有斷裂的pta-ackA的基因交換載體優選pMPKO-sacB。本發明還提供了用於生產琥珀酸的方法，所述方法包括下列步驟在厭氧條件下培養上述突變微生物；並且從培養液中回收琥珀酸。在本發明中，對於培養而言，葡萄糖和甘油優選被用作碳源，作為副產品的其他有機酸的量優選小於所產生的琥珀酸的量的lwt%。在又一方面，本發明涉及製備琥珀酸的方法，所述方法包括下列步驟在厭氧條件下培養瘤胃細菌突變體；並且從培養液中回收琥珀酸。根據本發明的產琥珀酸突變微生物的培養和琥珀酸的回收過程可通過常規發酵過程中已知的培養方法和分離並純化琥珀酸的方法來進行。在本發明中，對於培養而言，葡萄糖和甘油優選被用作碳源，作為副產品的其他有機酸的量優選小於所產生的琥珀酸的量的lwt%。13實施例此後將通過實施例進一步詳細描述本發明。但是，對本領域技術人員來說顯而易見的是，這些實施例僅僅用於解釋的目的而提供，本發明不限於這些實施例或者不由這些實施例限制。特別是，下面的例子僅僅示出了作為產琥珀酸微生物的Afo""/^m^印.作為宿主菌以便根據本發明剔除基因。但是，對本領域技術人員來說顯而易見的是，即便是使用其他種類的產琥珀酸微生物，也可獲得產生同質琥珀酸的突變微生物。實施例1:W^4斷裂載體(pMLKO-sacB)的構建為了通過同源重組使產琥珀酸微生物的基因組中的乳酸脫氫酶基因(ldhA)斷裂，按照下列方式構建了基因交換載體。首先，以M^cc/"/c&^^wce似MBEL55E(KCTC0769BP)作為模板使用在下面的序列號1和序列號2中闡明的引物進行PCR，然後將得到的含有ldhA-同源區1(Ll)的PCR片段用&cI和PWl酶切並引入到pUC18載體中(NewEnglandBiolabs,Inc.,USA),從而構建pUC18-Ll。序列號1:5，-CAGTGAAGGAGCTCCGTAACGCATCCGCCG序列號2:5，-CTTTATCGAATCTGCAGGCGGTTTCCAAAA另外，Ms"cc/m'c/^o^ce似MBEL55E(KCTC0769BP)的基因組DNA作為模板使用在下面的序列號3和序列號4中闡明的引物進行PCR，然後將得到的含有ldhA-同源區2(L2)的PCR片段用屍M和酶切並引入到pUC18載體中，從而構建pUC18-Ll-L2。序列號3:5，-GTACTGTAAACTGCAGCTTTCATAGTTAGC序列號4:5，-GCCGAAAGTCAAGCTTGCCGTCGTTTAGTG為了將抗-卡那黴素基因作為選擇標記插入到pUC18-Ll-L2中，並用屍M酶切pUC4K載體(Pharmacia,Germany),將得到的抗-卡那黴素基因與用屍M酶切的pUC18-Ll-L2融合，從而構建pUC18-Ll-KmR-L2。將在序列號5中闡明的接頭插入到用Sacl酶切的pUC18-Ll-KmR-L2中，從而形成新的X6"I酶切位點。序列號5:5'-TCTAGAAGCT為了將^cB基因插入到其中己經被插入X6al酶切位點的pUC18-Ll-KmR-L2中，以pKmobsacB(Schafer等人，145:69，1994)作為模板使用在序列號6和7中闡明的引物進行PCR。然後得到的含有^cB的PCR片段用Z6"I酶切，並插入到其中已經插入了上述力al酶切位點的pUC18-Ll-KmR-L2的新JT6al限制酶位點中，從而構建用於斷裂W/^基因的交換載體pMLKO-sacB(圖2)。序列號6:5'-GCTCTAGACCTTCTATCGCCTTCTTGACG序列號7:5'-GCTCTAGAGGCTACAAAATCACGGGCGTC實施例2:M匿"'/i/c/jP/Wwce附LK菌株的構建通過使用在實施例1中構建的pMLKO-sacB作為斷裂ldhA基因的交換載體斷裂Mwcc/"/";^o^ce朋MBEL55E(KCTC0769BP)基因組中的ldhA基因構建突變菌株(圖3)。換言之，將Mwcc/m'c,聲o^ce似MBEL55E(KCTC0769BP)接種於(platedon)含有10g/L葡萄糖的LB-葡萄糖平板培養基中，並37'C培養36小時。形成的菌落接種到(inoculated)10mlLB-葡萄糖液體培養基中，並培養12小時。將已經充分生長的1%的培養液接種到100mlLB-葡萄糖液體培養基中並在搖床中以200rpm、在37'C下培養。當在4-5小時之後培養液的OD6o。達到大約0.3-0.4時，將其在4'C下以4500rpm離心20分鐘以收集細胞。然後，將細胞在4°C下懸浮於200ml10%甘油溶液中。將懸液在4°C下以5500rpm離心20分鐘，並收集細胞。以上面描述的過程相同的方式在一半的上述甘油溶液中懸浮並收集兩次之後，以l:1的體積比將細胞懸浮在甘油中，得到濃縮的細胞。將由此得到的濃縮細胞與在實施例1中構建的pMLKO-sacB基因交換載體混合，然後通過在1.8kV、25pF和200歐姆條件下電穿孔將pMLKO-sacB引入到培養的Mracc/m'")^oc/Mce"sMBEL55E(KCTC0769BP)中。將1mlLB-葡萄糖液體培養基加入到引入了pMLKO-sacB的菌株中，在37°C下以200rpm在搖床中預培養一小時。將培養液接種於含有抗生素卡那黴素(終濃度為25嗎/ml)的LB-葡萄糖固體培養基中並在37°C培養48小時或更長。為了選擇其中僅僅發生雙交換的菌落，將形成的菌落在含有卡那黴素(25嗎/ml)和100g/L蔗糖的LB-蔗糖固體培養基上劃線。24小時之後，形成的菌落在相同的培養基上再次劃線。將在培養基上形成的菌落(突變體)在含有抗生素的LB-葡萄糖液體培養基中培養，從培養的菌株中通過Rochelle等人描述的方法(Rochelle等人，F五MSM/cro6/o/.丄e仏，100:59,1992)分離基因組DNA。使用分離的突變體基因組DNA作為模板進行PCR，並且將PCR產物進行電泳以確認基因組DNA中的ldhA基因斷裂。為了確認ldhA基因的斷裂，按照下列方式進行兩次PCR。第一，突變體基因組DNA作為模板使用在序列號8和序列號9中闡明的引物進行PCR。序列號8:5'-GACGTTTCCCGTTGAATATGGC(KM1)序列號9:5'-CATTGAGGCGTATTATCAGGAAAC(LU1)然後，突變體基因組作為模板使用在序列號10和序列號11中闡明的引物進行PCR。序列號10:5'陽GCAGTTTCATTTGATGCTCGATG(KM2)序列號11:5，-CCTCTTACGATGACGCATCTTTCC(LD2)將兩次PCRs中得到的PCR片段進行凝膠電泳，通過它們的大小確認ldhA基因的斷裂。具有斷裂的ldhA基因的基因組DNA的PCR片段通過下列事實確認使用序列號8(KM1)和序列號9(LU1)引物的PCR得到的產物具有1.5kb的大小，同時使用序列號10(KM2)和序列號:11(LU2)引物的PCR得到的產物具有1.7kb的大小。每種引物的位置在圖3中顯示。突變菌株Mwcc/"/c0roflfwcewLK根據上述方法通過將Mj"c"'"/cz^w^ce"jMBEL55E的基因組中的W/^基因斷裂而構建。實施例3:用於斷裂nta和ackA的基因交換載體(pPTA-sacB)的構建為了通過同源重組斷裂Af.swcc/"/c;rofi^ce似LK菌株的基因組中的pta和ackA基因，按照下列方式構建基因交換載體。將含有^c5基因作為模板的pKmobsacB使用在序列號12和序列號13中闡明的引物進行PCR。得到的產物用屍M和5amHI酶切並插入到pUC19(StratageneCloningSystems.USA)中，從而構建pUC19-sacB(FIG.4)。序列號12:5'-AGCGGATCCCCTTCTATCGCCTTCTTGACG序列號13:5'-GTCCTGCAGGGCTACAAAATCACGGGCGTC同時，以M.wcc/m'c/^ofi^ce"sLK的基因組DNA作為模板使用在序列號14和序列號15中闡明的引物進行PCR，將得到的含有同源區1的PCR片段用Z6al和SamHI酶切。另外，M.^cc7'w'c^n^ce似LK的基因組DNA作為模板使用在序列號16和序列號17中闡明的引物進行PCR，將得到的含有；to-acL4同源區2的PCR片段用和Sacl酶切。然後，將這些片段插入到pUC19的&wHI和Sad位點，從而構建pUC19-PTA12。序歹U號14:5'-GCTCTAGATATCCGCAGTATCACTTTCTGCGC序列號15:5'-TCCGCAGTCGGATCCGGGTTAACCGCACAG序列號16:5'-GGGGAGCTCGCTAACTTAGCTTCTAAAGGCCATGTTTCC序列號17:5'-GCTCTAGATATCCGGGTCAATATCGCCGCAAC為了將作為選擇標記的抗-壯觀黴素基因(GenBankX02588;Sp及)插入到pUC19-PTA12中，將含有抗-壯觀黴素基因(GenBankX02588)作為模板的質粒pIC156(Steinmetz等人，142:79,1994)使用在序列號18和序列號19中闡明的引物進行PCR，並且將得到的含有Sp及基因的PCR片段用五coRV酶切並引入到pUC19-PTA12中，從而構建具有抗-壯觀黴素基因的pUC19-PTAlS2。將構建的pUC19-PTAlS2用Sacl和5"mHI酶切並引入到上述構建的pUC19-SacB中，從而構建交換載體(pPTA-sacB)用於斷裂pto和(圖4)。序歹傳18:5'陽GAATTCGAGCTCGCCCGGGGATCGATCCTC序列號19:5，-CCCGGGCCGACAGGCTTTGAAGCATGCAAATGTCAC實施例4:s"c"7ifWz;rtff/"cg附PALK菌株的構建通過使用在實施例3中構建的用於斷裂磷酸轉乙醯酶(內a)基因和醋酸激酶(ac￡4)基因的交換載體pPTA-sacB斷裂Mwcc/"/";pro^ce";yLK基因組中的/7to和acyL4基因(圖4)。換言之，將在實施例2中構建的Mwcc/m'";^o^cemLK接種於含有10g/L葡萄糖的LB-葡萄糖瓊脂培養基中並在37。C下培養36小時。形成的菌落接種到10mlLB-葡萄糖液體培養基中，並培養12小時。將已經充分生長的1%的培養液接種到100mlLB-葡萄糖液體培養基中並在搖床中以200rpm在37"C下培養。以與實施例2中描述的相同方式從得到的培養液中收集濃縮的細胞。將收集的濃縮細胞與在實施例3中構建的基因交換載體pPTA-sacB混合，然後通過在2.5kV、50pF和200歐姆條件下電穿孔將pPTA-sacB引入到Mswcc/"/c/^o血ceraLK中。將800mlLB-葡萄糖液體培養基加入到引入了pPTA-sacB的菌株中，並在最高37°C下培養一個半小時。為了誘導雙交換，將培養液接種到含有抗生素壯觀黴素(終濃度為50pg/ml)的TSB-蔗糖固體培養基(含有100g/L蔗糖的TrypticSoyBroth(Becton,DickinsonandCompany)固體培養基)中，並在37°C下培養48小時或者更長。為了選擇其中僅僅發生雙交換的菌落，將形成的菌落分別在含有50(ig/ml壯觀黴素的TSB蔗糖培養基和含有50pg/ml氨苄青黴素的TSB瓊脂培養基上劃線，並在37。C下培養12小時。然後，選擇在含有50ng/ml壯觀黴素的TSB蔗糖培養基上形成但不在含有50pg/ml氨苄青黴素的TSB培養基上形成的菌落並再次在含有50pg/ml壯觀黴素的TSB蔗糖培養基上劃線。使用含有壯觀黴素的培養基和氨苄青黴素的培養基再次篩選在這裡形成的菌落，然後最終選擇顯示所要求的結果的菌落。分離的突變體基因組DNA作為模板通過PCR擴增，將PCR產物電泳以確認/M-ac^4基因的斷裂。為了確認冉"-flcL4的斷裂，以下列方式進行兩次PCR。首選，以突變體基因組DNA作為模板使用在下面的序列號20和序列號21中闡明的引物進行PCR，然後將突變體基因組DNA作為模板使用在在下面的序列號22和序列號23中闡明的引物進行PCR。序列號20:5，-CCTGCAGGCATGCAAGCTTGGGCTGCAGGTCGACTC(SP1)序列號21:5'-GCTGCCAAACAACCGAAAATACCGCAATAAACGGC(PAU1)序列號22:5，-GCATGTAACTTTACTGGATATAGCTAGAAAAGGCATCGGGGAG(SP2)序列號23:5，-GCAACGCGAGGGTCAATACCGAAGGATTTCGCCG(PAD2)將在兩種PCRs中得到的產物進行凝膠電泳，通過它們的大小確認Wa-"c￡4的斷裂(圖6)。j^fl-flc;b4的斷裂通過下列事實確認使用序列號20和序列號21(SP1引物和PAU1引物)得到的產物具有l.lkb的大小，同時使用序列號22和序列號23(SP2引物和PAD2引物)得到的產物的具有1.5kb的大小。每種引物的位置在圖5中顯示。通過如上述方法從7kf.wcc/m'";^oc/Mce朋LK的基因組中斷裂;to-flcL4構建的突變菌株，即通過從M.jwcc/m'c/pro^ce似的基因組中斷裂W/l4,W"和acW得到的突變菌株被命名為"M.swcc/m'c/^o^cewPALK"並在2006年7月26日以保藏號"KCTC10973BP"保藏於作為國際保藏單位的韓國典型菌種保藏中心(KCTC;52,Eoeun-dong，Yuseong-gu，Daejeon-si，R印ublicofKorea),韓國生命科學與生物技術研究所。實施例5:使用AT.SMCci'/i/c/prtfd"cgA^PALK生產同質琥珀酸將在實施例4中構建的Mwcc/"/">7n^wce";yPALK(KCTC10973BP)接種於含有5g/L葡萄糖的10ml合成培養基中，並在厭氧條件下39°C培養8小時，然後再次將它們轉移到含5g/L葡萄糖的250ml合成培養基並在39。C下培養。此時將50ng/ml壯觀黴素加入到培養基中作為抗生素。將250mlMswc"'m'c/pro^ce";yPALK培養液接種到含有2.25L合成培養基(lg/LNaCl，2g/L(NH4)2HP04,0.02g/LCaCl2'2H20，0.2g/LMgCl2'6H20，8.709g/LK2HP04,0.5g/L半胱氨酸，0.5g/L甲硫氨酸，0.5g/L甘氨酸，0.5g/L天冬醯胺，0.5g/L天冬氨酸，0.5g/L脯氨酸(praline),0.5g/L絲氨酸，0.005g/L煙酸，0.005g/L泛酸鈣，0.005g/L維生素B6HC1，0.005g/L維生素Bl，0.005g/L維生素C，和0.005g/L生物素)的生物反應器中，並在39。C下在第一葡萄糖濃度18.2g/L(100mM)，第—甘油濃度9.2g/L(100mM)條件下進行發酵。在發酵過程中，通過使用氨水將培養物的pH調節到6.5，並將50ng/ml壯觀黴素加入到培養基中作為抗生素。為了高濃度生產琥珀酸，當葡萄糖被完全耗盡時，通過加入濃縮的葡萄糖溶液將培養液的葡萄糖濃度調節到大約18.2g/L(100mM)。將M.wcc/"/";^o^ce似MBEL55E(KCTC0769BP)和產琥珀酸突變菌株Mwcc/"/c^wo^ce"sLPK7(KCTC10626BP)發酵，以上面描述的相同方式生產琥珀酸。培養液中的細胞濃度使用分光光度計測定，然後使用現有測定的分光光度計的光吸收和用於細胞乾重的驗證試驗進行計算。在發酵過程中，從生物反應器中有規律地收集樣品。收集的樣品以13000rpm離心10分鐘，然後通過使用高效液相色譜將上清液用於分析有機酸、葡萄糖和甘油的濃度。結果，當本發明的Mracc/"/":pro^ce附PALK(KCTC10973BP)與M認c/"/c—MBEL55E(KCTC0769BP)禾口MjMcc/"/"j^oc/wce似LPK7(KCTC10626BP)相比時，比M.swcc/m'"》rodwce似MBEL55E(KCTC0769BP)禾口Mracc/w'c^oc^ce;wLPK7(KCTC10626BP)顯示了更高的琥珀酸產率同時更少產生或者不產生其他有機酸副產品(如圖7和表2中所示)。雖然檢測到了0.45g/L的醋酸和0.24g/L的丙酮酸,對本領域技術人員來說顯而易見的是這些量對於細菌生長來說是產生的很少量的有機酸量，並且可以被忽略，因為與產生的琥珀酸相比它們產生的量不到其lwt%。表2Mwcc/"/"^o^ce似PALK(KCTC10973BP)的琥珀酸產率菌株MBEL55E(KCTC0769BP)LPK7(KCTC10626BP)PALK(KCTC10973BP)琥珀酸的終濃度(g/L)10.4913.4045.79葡萄糖消耗(g/L)22.5019.9853.00琥珀酸產率(琥珀酸g/葡萄糖g)0.470.670.86tableseeoriginaldocumentpage22工業實用性如同上面詳細描述的那樣，本發明提供了具有高生長率的產琥珀酸的突變微生物，其在厭氧條件下培養過程中產生高濃度的琥珀酸同時很少產生或者不產生其他有機酸，並提供了使用突變微生物生產琥珀酸的方法。與現有的產琥珀酸菌株相比，本發明的突變微生物具有高生長率和琥珀酸產率同時很少產生或者不產生有機酸的能力。因此，本發明的突變微生物對於生產琥珀酸的工業應用來說是有用的。雖然己經參照特定特徵對本發明進行了詳細描述，但對本領域技術人員來說顯而易見的是該描述僅僅用於優選實施方式，而不是限制本發明的範圍。因此，本發明的實際範圍將由所附的權利要求書及其等同物限定。序列表隨附電子版序列表。權利要求1、一種產生琥珀酸微生物中缺乏乳酸脫氫酶基因、磷酸轉乙醯酶基因和乙酸激酶基因而同時在產生琥珀酸微生物中僅供養蟻酸裂解酶基因的瘤胃細菌突變體，其具有在厭氧條件下僅僅高濃度產生琥珀酸同時很少產生或者不產生有機酸的特性。2、根據權利要求l所述的瘤胃細菌突變體，其特徵在於，瘤胃細菌選自由Afo""/^'m/fl菌屬、放線桿菌屬和厭氧螺桿菌屬所組成的組。3、根據權利要求l所述的瘤胃細菌突變體，其特徵在於，瘤胃細菌突變體為同質發酵菌株，其僅僅產生琥珀酸同時很少或者不產生其他有機酸副產品。4、根據權利要求l所述的瘤胃細菌突變體，其特徵在於，作為副產品產生的其他有機酸的量低於產生的琥珀酸的量的lwt%。5、根據權利要求l所述的瘤胃細菌突變體，其特徵在於，有機酸是選自下組的一種或多種有機酸，上述組由乳酸、醋酸、蟻酸和丙酮酸所組成。6、一種在Mwcc/"/ci^o^ce似中缺乏乳酸脫氫酶基因、磷酸轉乙醯酶基因和乙酸激酶基因同時在M^cc/"/c^woJwce附中供養蟻酸裂解酶基因的瘤胃細菌突變體AfawwAeiw/aswcc/m'ci^odMce似PALK，其具有在厭氧條件下僅僅高濃度產生琥珀酸同時很少產生或者不產生有機酸的特性。7、一種生產權利要求1所述的瘤胃細菌突變體的方法，所述方法包括下列步驟(a)使用同源重組法在琥珀酸產生瘤胃細菌基因組中通過使乳酸脫氫酶基因斷裂得到缺乏編碼乳酸脫氫酶基因的瘤胃細菌突變體；和(b)通過同源重組從缺乏編碼乳酸脫氫酶基因的瘤胃細菌突變體的基因組中使編碼磷酸轉乙醯酶的基因和編碼乙酸激酶的基因斷裂得到缺乏編碼乳酸脫氫酶基因、編碼磷酸轉乙醯酶的基因和編碼乙酸激酶的基因的瘤胃細菌突變體。8、根據權利要求7所述的生產瘤胃細菌突變體的方法，其特徵在於，同源重組步驟(a)優選使用含有斷裂的ldhA的基因交換載體進行。9、根據權利要求7所述的生產瘤胃細菌突變體的方法，其特徵在於，同源重組步驟(b)優選使用含有斷裂的pta-ackA的基因交換載體進行。10、根據權利要求8所述的生產瘤胃細菌突變體的方法，其特徵在於，含有斷裂的ldhA的基因交換載體為pMLKO-sacB。11、根據權利要求9所述的生產瘤胃細菌突變體的方法，其特徵在於，含有斷裂的pta-ackA的基因交換載體為pMPKO-sacB。12、一種生產琥珀酸的方法，所述方法包括下列步驟在厭氧條件下培養權利要求1-5中任意一個權利要求所述的瘤胃細菌突變體；並且從培養液中回收琥珀酸。13、根據權利要求12所述的方法，其特徵在於，葡萄糖和甘油優選被用作碳源用於培養。14、根據權利要求12所述的方法，其特徵在於，作為副產品的其他有機酸的量小於所產生的琥珀酸的量的lwt%。15、一種製備琥珀酸的方法，所述方法包括下列步驟在厭氧條件下培養瘤胃細菌突變體Maw7/ze/m/aSMCc/m'c&rofi^cewsPALK;並且從培養液中回收琥珀酸。16、根據權利要求15所述的方法，其特徵在於，葡萄糖和甘油優選被用作碳源用於培養。17、根據權利要求15所述的方法，其特徵在於，作為副產品的其他有機酸的量小於所產生的琥珀酸的量的lwt%。全文摘要本發明涉及一種產同質琥珀酸的瘤胃細菌突變體以及使用這些瘤胃細菌突變體製備同質琥珀酸的方法，具體涉及在厭氧條件下產生高濃度琥珀酸同時很少產生或者不產生其他有機酸的瘤胃細菌突變體，所述瘤胃細菌突變體通過使編碼乳酸脫氫酶(ldhA)的基因、編碼磷酸轉乙醯酶(pta)的基因和編碼乙酸激酶(ackA)的基因斷裂而不使編碼丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)的基因斷裂而得到，還涉及使用這些瘤胃細菌突變體製備琥珀酸的方法。與現有的產琥珀酸菌株相比，本發明的瘤胃細菌突變體具有高生長率和琥珀酸產率同時很少產生或者不產生有機酸的能力。因此，本發明的瘤胃細菌突變體對於生產琥珀酸的工業應用來說是有用的。文檔編號C12N1/21GK101636488SQ200780036066公開日2010年1月27日申請日期2007年7月25日優先權日2006年7月28日發明者宋孝學,李相燁,林成元申請人:韓國科學技術院