增強蛋白和肽抗原免疫原性的Fc融合蛋白的製作方法

2023-09-19 01:45:45

專利名稱：增強蛋白和肽抗原免疫原性的Fc融合蛋白的製作方法
本申請要求申請日為1999年7月21日，申請號為60/144,965的專利申請的優先權，該申請所公開的內容在此引用作為參考。
發明的技術領域一般來說，本發明涉及在哺乳動物中增強預選蛋白或肽抗原的免疫原性的組合物和方法。更具體地說，本發明涉及編碼包括免疫球蛋白重鏈恆定區和預選抗原的融合蛋白的核酸和胺基酸序列，與單獨的預選抗原相比融合蛋白中的預選抗原能夠在哺乳動物中誘導更強的免疫應答。
背景技術：
傳統的疫苗研製著重於生產能夠中和感染抗原的防禦抗體。目前，用作疫苗的抗原典型地包括滅活或減毒的微生物(例如細菌或病毒)，它們的產物(例如毒素)或純化抗原。隨著現代分子生物學和基因克隆方法學的到來，使製備更純，特異性更明顯的疫苗成為可能。免疫系統分子水平上的知識使人們能分離和描述由感染抗原刺激的免疫應答。據認為對成功地產生免疫應答至關重要的兩個免疫系統組分包括調節和細胞毒性T細胞的關鍵作用；和通過抗原呈遞細胞(APC)向這些細胞呈遞抗原的方式。參見實施例，W.E.Paul，編(1993)免疫學基礎，Raven出版有限公司，紐約。
典型地，從APC細胞外部接受的蛋白或多肽抗原(外源抗原)在APC細胞的胞吞囊或核內體中被降解。於是所得的肽片斷與主要組織相容性複合體(MHC)II類蛋白形成複合物。所得的複合物移動到細胞表面並呈現於與該APC鄰近的免疫細胞。肽片斷與MHC分子形成的溝相匹配，並且該複合物可由表達對該複合物具有結合特異性的T細胞受體的T細胞所識別。肽結合的MHC II類分子與在本領域內稱為CD4 T細胞的輔助性T細胞之間的相互作用可通過另一相互作用，即MHC II類分子自身與T細胞表面的CD4+受體之間的相互作用予以進一步穩定。這樣在APC細胞內加工的外源抗原通過MHC II類分子呈遞到細胞表面。當MHC II類複合物呈現於CD4+T細胞表面時，可導致CD4+輔助細胞分泌細胞因子，該細胞因子刺激B細胞產生針對該肽的抗體。參見Paul，supra.
用外源抗原接種疫苗典型地導致CD4細胞-介導的T細胞應答，這種應答一般導致抗體產生。細胞毒性T細胞(CTL)典型地不由這種途徑所刺激。顯然地，CTL是由下述情況所刺激的，即其中的抗原源於APC自身內部(內源抗原)，例如在病毒感染細胞中產生的病毒蛋白或在癌細胞中產生的癌症特異性蛋白。事實上在許多病毒性疾病中，認為CTL細胞的產生是去除病毒感染細胞的關鍵，由此使感染得以恢復。
研究表明內源抗原和外源抗原是經過不同加工的。在新生多肽形成過程中，部分多肽由一種稱為proteosome的細胞內部結構降解。通過這一加工得到的片斷與新合成的MHC I類分子而非MHC II類分子形成複合物，所得的含MHCI類分子複合物的抗原轉運到細胞表面。再一次，對特異肽片段具有特異性的T細胞與T細胞結合，但在此種情況下，所需的共同受體相互作用出現在MHC I類分子和CD8分子之間。由此APC細胞表面的內源抗體呈現於CD8+T細胞。儘管有一部分CD8+T細胞不是細胞毒性的，但CD8+T細胞構成CTL的主要部分。
據此，顯然對能誘導CTL應答的疫苗的設計，需要抗原分子(一般為蛋白)或是在細胞內產生或是運送到合適的細胞區室以進入MHC加工途徑。一種策略是將編碼所需蛋白或肽的基因摻入到病毒中，然後用該基因工程病毒作為疫苗(Lorenz等(1999)人類基因治療(HUM.GENETHER.)10623-631)。另一種策略是將編碼蛋白的DNA載體注射到細胞中，再將該細胞施與動物或病人使其從細胞內部表達，再通過MHCI類分子呈遞到細胞表面。(Donnelly等(1997)免疫學年評(ANNU.REV.IMMUNOL.)15617)。已經公開了一種將DNA載體直接注入肌肉或皮膚的簡單技術，由此誘導對幾種抗原的CTL和/或抗體應答(Lai等(1988)免疫學CRIT.綜述(CRIT.REV.IMMUNOL.)18449-84和美國專利5,589,466)。研究結果表明抗原由APC攝入並加工由此呈現於免疫系統(Lai等，見上)。
將外源的肽或蛋白運送到MHC I類途徑已通過使用化學佐劑，例如弗氏佐劑、角鯊烯與去汙劑的混合物(Hilgers等(1999)疫苗17219-228)，及最近通過使用可被巨噬細胞吞噬並通過一種供選擇的MHCI類途徑誘導CTL應答的抗原包被小珠(De Bruijn等(1995)歐洲免疫學雜誌(EUR.J.IMMUNOL.)251274-1285)獲得了部分的成功。而且其它增強對抗原免疫應答的方法可包括將化學佐劑與重組免疫刺激細胞因子，例如IL-2，IL-12，GM-CSF等結合使用。例如一種方法是用抗半抗原抗體與IL-2融合作為將這一細胞因子與蛋白抗原相連接的途徑，該蛋白抗原已與該半抗原發生過化學反應。(Harvill等(1996)免疫學雜誌1573165)。
另一種技術通過將免疫球蛋白可變區的一部分區域用肽抗原替換開發出「抗原化」抗體。一旦重組抗體通過與APC細胞表面的Fc受體之間的相互作用結合於APC，雜合分子的肽抗原即呈遞於APC(Lanza等(1993)美國國家科學院彙編(PROC.NATL.ACAD.Sci.USA)9011683-11687)。這種方法的一種擴展是將編碼「抗原化的」免疫球蛋白重鏈的質粒DNA進行脾臟注射，此後當提供免疫球蛋白輕鏈部分時，脾臟衍生的B細胞可分泌重組抗體。
抗體呈遞系統的免疫原性是現代疫苗開發中的主要技術障礙之一。接種疫苗的目的是引起強免疫應答。但由於宿主的免疫系統已演化為對抗細菌和病毒，因而當用細菌或病毒作為載體時，信息將與信息載體一起遭到破壞。而且對某一病毒載體，例如牛痘和腺病毒的強免疫應答限制了它們的應用，可以理解在用細菌毒素作為蛋白載體時也會出現類似的問題。同樣應用可變區的抗體衍生的「蛋白載體」由其特有的性質不被免疫系統視為「自體」，因而具有潛在地致免疫性。可以預見這些載體分子的多種應用均可以誘導抗獨特型應答，因此妨礙了它們的有效應用。據此，本發明的一個目的是提供一種疫苗，其可產生針對預選蛋白或肽抗原強且持久的免疫。
發明簡述本發明部分地基於下述發現，即可以通過將預選抗原與免疫球蛋白重鏈恆定區相融合在哺乳動物中增強預選肽或蛋白抗原的免疫原性。所得的融合蛋白(這裡也指「Fc-抗原融合蛋白」或「抗原融合蛋白」)或編碼融合蛋白的核酸序列以疫苗的形式施用於哺乳動物以引起針對預選抗原的免疫應答。而且發現所引起的針對預選抗原的免疫應答的強度和類型可以通過將特定的佐劑和Fc-融合蛋白或編碼Fc-融合蛋白的核酸序列一起使用得以調節。
據此本發明提供一種在哺乳動物中增強預選抗原的免疫原性的方法。一方面，該方法包括對哺乳動物施用足以引發免疫應答的量的Fc-抗原融合蛋白，該融合蛋白包括通過多肽鍵和預選抗原相連接的免疫球蛋白重鏈恆定區。另一方面，該方法包括對哺乳動物施用一種核酸序列，例如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，該核酸序列編碼包含融合於上述預選抗原的免疫球蛋白重鏈恆定區的Fc-抗原融合蛋白。在哺乳動物中與相當的(例如通過重量或分子數)單獨預選抗原，即不與免疫球蛋白重鏈恆定區相融合的預選抗原相比，當該預選抗原作為Fc-抗原融合蛋白的一部分時以能夠引發更強的免疫應答為特徵。
而且，Fc-抗原融合蛋白所引發的針對預選抗原的免疫應答可以通過將一種佐劑與Fc抗原融合蛋白一起施用來進行增強或調控。儘管多種佐劑，例如化學佐劑如弗氏完全佐劑，或含非甲基化CpG序列的寡核苷酸均可用於實現本發明，目前優選的與Fc融合蛋白一起使用的佐劑包含一種第二Fc融合蛋白(此處指「Fc佐劑融合蛋白」或「佐劑融合蛋白」)或編碼這樣的Fc融合蛋白的核酸序列。優選的Fc佐劑融合蛋白包含通過多肽鍵和一種佐劑蛋白，如細胞因子相連接的免疫球蛋白重鏈恆定區。優選的用於構建Fc-佐劑融合蛋白的細胞因子包括，例如幹擾素(IFN-y)白細胞介素-2(IL-2)，白細胞介素-4(IL-4)白細胞介素-12(IL-12)IL-8，腫瘤壞死因子(TNF)，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)。另一類Fc-佐劑融合蛋白包括與一種佐劑組成成分相融合的免疫球蛋白重鏈恆定區，該佐劑組成成分相當於通常部分或專門與膜結合的蛋白的細胞外結構域。例如CD40配基與Fc組分相融合以用作增強的佐劑蛋白。
以共同地或一個接一個地方式共施用的Fc抗原和Fc佐劑融合蛋白(例如Fc-佐劑接著Fc-抗原或Fc-抗原接著Fc-佐劑)可以用於調控所引發的針對預選抗原的免疫應答的類型。稱作Th1和Th2的兩類免疫應答由不同的刺激物起始且包含不同的細胞因子。Th1介導的免疫應答本質上是典型的細胞免疫，而Th1介導的免疫應答本質上是典型的體液免疫。因此Th1應答可用於攻擊變化的細胞，例如癌細胞或病毒感染細胞，而Th2應答可用於攻擊細胞外抗原，如寄生蟲。通常將細胞因子融合於免疫球蛋白重鏈恆定區對刺激普通的免疫應答或者起始或調節特異的Th1或Th2應答都是有用的。
例如包括通過肽鍵和GMCSF相連的免疫球蛋白重鏈恆定區的融合蛋白是對包括Th1和Th2應答再內的免疫反應的有效通用激活劑。一種包含IL-12或INFγ的Fc-佐劑融合蛋白可共施用以刺激初級細胞的或Th1介導的免疫應答。另外的，一種包括IL-4的Fc-佐劑融合蛋白可以用於刺激初級體液的或Th2介導的免疫應答。
而且，對存在於Fc-佐劑融合蛋白的特定細胞因子的選擇可以影響針對Fc-抗原融合蛋白中的預選抗原所產生的抗體的類型。例如包含IL-12的Fc-佐劑融合蛋白可以刺激輔助T細胞，並產生IgG2a類抗體。而含IL-4的佐劑融合蛋白可以刺激IgE類抗體的產生。
正如前面所討論的，在一個優選實施例中，該方法包括將Fc-抗原融合蛋白或編碼該Fc-抗原融合蛋白的核酸序列與Fc-佐劑融合蛋白一起施用。通過應用各自都包含免疫球蛋白重鏈恆定區的兩種融合蛋白可以將預選抗原和佐劑蛋白(例如，細胞因子)共同定位於哺乳動物中的相同或相似細胞類型中。例如，在其表面表達Fc受體的巨噬細胞，B細胞，粒細胞和樹狀細胞。
據此，通過共同施用Fc-抗原和能與Fc受體結合的Fc佐劑融合蛋白可以將抗原融合蛋白中的抗原和佐劑融合蛋白中的佐劑共同定位於相同的細胞類型中。該佐劑能夠刺激，增強或調節在預選抗原附近的免疫應答。
在這一優選實施例中，使用了兩種不同的定位和濃度形式。首先，本發明使用了一種與抗原和佐劑都能融合的共同組分，它集中於體內特定的區域。在這種方式中，該佐劑附近抗原的有效局部濃度得以提高。
第二，本發明將該抗原靶向抗原加工和呈遞系統。第一個濃縮步驟可通過將抗原和佐劑蛋白融合為一個組成成分並使其濃縮於機體中接近免疫系統的某一部分而進行。第二個靶向步驟是通過將抗原蛋白與任意可以增強向該抗原呈遞系統遞送或由該抗原呈遞系統加工的組成成分相融合來進行的。
據此，本發明通過兩種可供選擇的方法達到這些濃縮效果。一種方法是構建和使用兩種不同的融合蛋白，一種抗原定位蛋白融合體和一種佐劑-定位蛋白融合體。第二種方法是構建和施用一種包括所述抗原，佐劑和定位蛋白的融合體。Fc組成成分是定位蛋白的例子。
上述免疫球蛋白重鏈恆定區不同於該Fc抗原融合蛋白中的預選抗原的一個重要的特徵是，其在預期的受體中優選的是無免疫原性或弱免疫原性的。換句話說，在Fc-抗原融合蛋白中，將預選抗原設計為比該免疫球蛋白重鏈恆定區在受體中免疫原性強。
類似地，可以理解Fc-佐劑融合蛋白在預期的受體中也應當是非或弱免疫原性的。可以通過使用來自或相似於那些預期受體的物種中的免疫球蛋白重鏈恆定區來降低，在特定的情況下甚至消除免疫球蛋白重鏈恆定區的免疫原性。例如用優選人源的免疫球蛋白重鏈恆定區用於生產施用於人的融合蛋白。類似地，當預期受體是人時Fc-佐劑融合蛋白中的佐劑蛋白也優選人源的。通過選擇合適的定義免疫球蛋白重鏈恆定區和佐劑蛋白的胺基酸序列，可以儘可能完善針對預選抗原的初級免疫應答。
在一個優選實施例中，Fc-抗原融合蛋白的免疫球蛋白重鏈恆定區包括免疫球蛋白鉸鏈區，和選自以下的一種可選擇的免疫球蛋白重鏈恆定區結構域CH2結構域，CH3結構域和CH4結構域，或其組合。所述的免疫球蛋白重鏈恆定區優選地至少缺少CH1結構域。而且本發明的Fc-融合蛋白，優選地缺少免疫球蛋白重鏈可變區結構域(VH)。當將該融合蛋白施用於人時，所述免疫球蛋白重鏈恆定區優選地包含鉸鏈區，和CH2結構域或CH3結構域，最優選包含鉸鏈區，CH2結構域和CH3結構域。可以理解對本發明有用的免疫球蛋白重鏈恆定區結構域可以來自在本領域中被稱為IgA(Iga)，IgD(Ig5)，IgE(Igs)，IgG(Igy)，和IgM(Igp)的五種免疫球蛋白中的任意一種。但源於IgG類的免疫球蛋白重鏈恆定區是優選的。
可以理解任何所需的預選抗原均可包含在本發明的Fc-抗原融合蛋白中。在一個優選實施例中，預選抗原選自下面的組，該組包括前列腺特異性膜抗原，細胞因子受體的胞外結構域，病毒蛋白和癌症或腫瘤特異性抗原。
具有多種構型的Fc-抗原融合蛋白對實施本發明可能是有用的。例如，預選抗原的N-末端可以通過多肽鍵與免疫球蛋白重鏈恆定區的C-末端相連。或者預選抗原的C-末端可以通過多肽鍵與免疫球蛋白重鏈恆定區的N-末端相連。而且可以理解Fc-抗原融合蛋白可以包括多種一個或多個預選抗原，其中的一個或多個可以直接或通過多肽接頭彼此連接或與免疫球蛋白重鏈恆定區相連接。而且兩個或更多的Fc-抗原融合蛋白可以非共價地或共價地，例如通過一個或多個二硫鍵連接在一起形成二聚體或多聚體組合物。可以理解在二聚體或多聚體構建體中的Fc抗原融合蛋白可以彼此相同或不同。例如，即便兩個Fc抗原融合蛋白可能包含相同的免疫球蛋白重鏈恆定區，其預選抗原可能不同。可以理解Fc-佐劑融合蛋白也可以應用類似的構型。
而且，編碼Fc融合蛋白的多種核酸序列對於實現本發明都是有用的。例如，該核酸序列可以沿5』到3』的方向編碼免疫球蛋白重鏈恆定區和預選抗原或預選抗原和免疫球蛋白重鏈恆定區。而且該核酸序列還可以任選地包括基於例如與免疫球蛋白重鏈恆定區的鉸鏈直接相融合的免疫球蛋白輕鏈序列的「前導」或「信號」序列。在一優選實施例中，當Fc區域基於IgG序列時，該Fc區域沿5』到3』的方向編碼至少包括免疫球蛋白鉸鏈區(即鉸鏈區包含至少一個能與第二種免疫球蛋白鉸鏈區序列形成二硫鍵的半胱氨酸)，免疫球蛋白CH2結構域和CH3結構域。而其編碼Fc抗原融合蛋白的胺基酸序列還可以整合到可複製的表達載體中，該表達載體可以在例如細菌宿主，預期受體或以上兩者中表達Fc融合蛋白。
可以將編碼Fc-抗原融合蛋白的核酸序列單獨或與編碼Fc-佐劑融合蛋白的核酸序列一起注射可以引起細胞免疫應答，體液免疫應答或以上兩者。與單獨應用核酸或蛋白所引起的免疫相比，將基於核酸或基於蛋白的免疫相結合(例如在施用編碼Fc-抗原融合蛋白的核酸之前，之後或過程中施用Fc-抗原融合蛋白)可以產生彼此的協同作用進而引發針對預選抗原更強的免疫應答。
本發明的上述和其它目的，特徵和優點將通過下述的詳細描述附圖和權利要求顯得更為清晰。
附圖的簡要說明本發明的上述和其它目的，特徵和優點和該發明本身可以通過下述優選實施例的詳細描述並結合附圖得到更加完全的理解，其中附

圖1A-1G是用於實施本發明的Fc融合蛋白示例的圖示介紹。圖1A表示Fc-抗原融合蛋白或Fc-佐劑融合蛋白，其中免疫球蛋白重鏈恆定區1連接在抗原或佐劑2的N末端。圖1B表示Fc-抗原融合蛋白或Fc-佐劑融合蛋白，其中免疫球蛋白重鏈恆定區1連接在抗原或佐劑2的C末端。圖1C和圖1D表示一種二聚體蛋白，其中兩條多肽鏈之一或兩者都包含Fc-抗原融合蛋白或Fc-佐劑融合蛋白。在圖1C中在至少一條多肽鏈中連接到抗原或佐劑2的N末端，在圖1D中免疫球蛋白重鏈恆定區1連接到抗原或佐劑2的C-末端。圖1E表示一種蛋白二聚體，其中的多肽鏈之一或兩者都包含Fc-抗原-抗原，Fc-佐劑-佐劑，Fc-抗原-佐劑或Fc-佐劑-抗原融合蛋白。圖1F表示一種二聚體蛋白其中的多肽鏈之一或兩者都包含抗原-Fc-佐劑或佐劑-Fc-抗原融合蛋白。圖1G表示一種二聚體蛋白，其中的多肽鏈之一或兩者都包含抗原-佐劑-Fc或佐劑-抗原-Fc融合蛋白。
圖2A-2B以圖示的方式表示實施本發明所用到的DNA序列。圖2A表示人Fc融合蛋白表達載體。圖2B表示表達小鼠IgG 2a Fc融合蛋白的基因融合體。
圖3A-3F的曲線圖表明化學和Fc-細胞因子佐劑對用Fc-抗原融合蛋白，小鼠Fc人IL-4受體胞外結構域(Fc-IL-4R)融合蛋白免疫的小鼠所產生的抗體的效果。在圖3A中，用Fc-IL-4R和弗氏完全佐劑(CFA)中的Fc-IL-2免疫小鼠。在圖3B中用磷酸鹽緩衝液(PBS)中的Fc-IL-4R免疫小鼠。在圖3C中用FCA中的Fc-IL-4R免疫小鼠。
在圖3D中用PBS中的Fc-IL-4R和Fc-IL-2免疫小鼠。在圖3E中用CFA中的Fc-IL-4R和Fc-GMCSF免疫小鼠。在圖3F中用PBS中的Fc-IL-4R和Fc-GMCSF免疫小鼠。在圖3A-3F中，方塊，菱形和三角代表來自三隻不同小鼠的數據。用ELISA檢測針對一種抗原的抗體水平；Y軸代表由ELISA讀出的光密度。
圖4A-4D的曲線圖表明用人癌抗原，PSMA以Fc-抗原融合蛋白的形式以多種用量的Fc-GMCSF為佐劑免疫小鼠的效果。在圖4A中，單獨用50μg的Fc-PSMA融合蛋白免疫小鼠。在圖4B中，以0.05μg的Fc-GMCSF作為佐劑用50μg的Fc-PSMA免疫小鼠。在圖4C中用50μg Fc-GMCSF和0.5μg的Fc-GMCSF作為佐劑免疫小鼠。在圖4D中，以5μg的Fc-GMCSF作為佐劑用50μg的Fc-PSMA免疫小鼠。在圖4A-4D中方塊，菱形和三角代表來自三隻不同小鼠的數據。
圖5A-5F是比較作為天然蛋白(5A-5C)或作為小鼠Fc-PSMA融合蛋白施用的PSMA抗原的特異抗體應答的曲線圖。在圖5A中，用50μg的PSMA作為抗原免疫小鼠。在圖5B中，用50μg的PSMA作為抗原和0.2μg GMCSF為佐劑免疫小鼠。在圖5C中，用50μg PSMA作為抗原，0.5μg Fc-GMCSF作為佐劑免疫小鼠。在圖5D中，用50μg Fc-PSMA作為抗原免疫小鼠。在圖5E中，用50μg Fc-PSMA作為抗原，0.2μg GMCSF作為佐劑免疫小鼠。在圖5F中，用50μg的Fc-PSMA作為抗原，0.5μg的Fc-GMCSF作為佐劑免疫小鼠。在圖5A-5F中的方塊，菱形和三角代表來自三隻不同的小鼠的數據。用ELISA測定對每種抗原的抗體水平；Y軸代表ELISA讀出的光密度。
圖6是對針對抗人PSMA的抗體產生而言，與Fc-PSMA共同施用的Fc-GMCSF或Fc-F3L佐劑效果比較圖表。所有的供試動物均單獨或與作為佐劑的Fc-細胞因子結合施用50μg的Fc-PSMA。每組實驗中測試三隻小鼠。
圖7A-7B是表示單獨施用或與佐劑Fc-GMCSF結合施用的Fc-EpCAM融合蛋白在小鼠個體中免疫原性的曲線圖。圖7A和7B分別表示加強7天和14天後所測定的抗體滴度。在初級免疫的3周後給予加強。在兩幅圖中空心菱形代表單獨用10μg Fc-EpCAM以皮下方式免疫小鼠，實心三角代表以1μg Fc-GMCSF為佐劑，用10μg Fc-EpCAM以皮下的方式免疫小鼠。用ELISA測定針對某種抗原的抗體水平；Y軸代表ELISA讀出的光密度。
圖8A-8B是表示單獨施用或與佐劑融合蛋白Fc-GMCSF結合施用的EpCAM-Fc(Fc區域和抗原的反方向)融合蛋白在小鼠個體中免疫原性的曲線圖。圖8A和8B分別表示免疫14天和21天(即加強後7天)後所測定的抗體滴度。在兩幅圖中空心的菱形代表用25μg EpCAM-Fc融合蛋白免疫的三隻小鼠的平均滴度，實心的三角代表用25μgEpCAM-Fc融合蛋白和2.5μg Fc-GMCSF為佐劑免疫的三隻小鼠的平均滴度。用ELISA測定相對於抗原的抗體水平；Y軸代表ELISA讀出的光密度。
圖9是構建編碼EpCAM-Fc-GMCSF融合蛋白的質粒載體的圖表。這種情況下，抗原EpCAM融於免疫球蛋白重鏈恆定區(Fc區域)的氨基末端，佐劑GMCSF融於Fc區域的羧基末端。
圖10A-10D是表明用PBS或25％(w/v)的蔗糖溶液作為運載工具注射編碼Fc-EpCAM融合蛋白的質粒載體的小鼠中抗體滴度的曲線圖。圖10A-10D分別代表開始注射後14天，27天，55天和69天後的抗體滴度。該圖中空心的菱形代表用PBS中的編碼Fc-EpCAM融合蛋白的質粒注射的個體小鼠中的抗體滴度，實心的三角代表用蔗糖中的編碼Fc-EpCAM融合蛋白的質粒注射的個體小鼠中的抗體滴度用ELISA測定相對於抗原的抗體水平；Y軸代表ELISA讀出的光密度。
圖11A-11B是3H-胸腺嘧啶摻入刺激的圖表，該刺激反應是對DNA接種或由蛋白注射免疫的小鼠中分離的脾細胞的抗原體外刺激的響應。圖11B是圖11A的下部數據的放大圖。在該幅圖中，實心的菱形代表從用100μg編碼CMV-Fc-EpCAM融合蛋白的質粒DNA免疫的小鼠中得到的脾細胞，圓圈代表從用100μg編碼CMV-EpCAM-Fc融合蛋白的質粒DNA免疫的小鼠中得到的脾細胞，十叉代表從用10μg編碼Fc-EpCAM蛋白免疫的小鼠中得到的脾細胞。脾是在用質粒DNA或蛋白注射70天，並在間隔3周加強注射兩次後的小鼠中去除的。
圖12A-B是用從質粒DNA或Fc-EpCAM蛋白免疫的小鼠的脾細胞作的細胞毒T淋巴細胞(CTL)的殺傷分析的曲線圖。圖12A是抗表達人EpCAM蛋白的抗小鼠CT26腫瘤細胞的脾細胞活性。圖12B是抗親代小鼠CT26腫瘤細胞的脾細胞活性。在以上兩幅圖中空心的菱形代表用帶有(CMV-啟動子)-EpCAM構建體的DNA免疫的小鼠的脾細胞。空心方塊代表用帶有(CMV-啟動子)-EpCAM融合構建體的DNA免疫的小鼠的脾細胞。空心的方塊代表(CMV-啟動子)-Fc-EpCAM融合構建體的DNA免疫的小鼠的脾細胞，空心的三角用帶有(CMV-啟動子)-EpCAM-Fc融合構建體的DNA免疫的小鼠的脾細胞，十叉代表用Fc-EpCAM融合蛋白免疫的小鼠的脾細胞。CTL分析是用以10U/ml的IL-2免疫後培養5天的小鼠的脾細胞進行的。標記的靶細胞與指示效應物混合併培養4小時。用放射性的釋放來計算特異裂解物的百分比。
圖13是通過皮下的方式單獨或以5μgFc-GMCSF作為佐劑用PBS緩衝液中的的50μg Fc-MCSP融合蛋白免疫的小鼠血清中的抗體滴度的曲線圖。實心的菱形代表正常血清中的抗體滴度，空心方塊代表單獨用Fc-MCSP融合蛋白免疫的小鼠血清中的抗體滴度，實心三角代表以Fc-GMCSF作為佐劑用Fc-MCSP融合蛋白免疫的小鼠血清中的抗體滴度。用ELISA檢測針對一種抗原的抗體水平；Y軸代表由ELISA讀出的光密度。
圖14A-B單獨或以Fc-細胞因子作為佐劑用Fc-gp41 pep626融合蛋白免疫的小鼠血清中的抗體滴度的曲線圖。圖14A和14B分別代表第二次加強後7天和33天後所達到的抗體滴度。該圖中，空心的菱形代表單獨由皮內注射25μg Fc-gp41pep626抗原免疫的小鼠中的抗體滴度，空心方塊代表以25μg Fc-GMCSF作為佐劑由皮內注射2.5μg Fc-gp41pep626抗原免疫的小鼠中的抗體滴度，實心三角代表以2.5μg Fc-IL-2作為佐劑由皮內注射25μg Fc-gp41pep626抗原免疫的小鼠中的抗體滴度。用ELISA檢測針對一種抗原的抗體水平；Y軸代表由ELISA讀出的光密度。
發明的詳細描述本發明涉及在哺乳動物體內有效地遞送蛋白或肽抗原以誘導體液(即基於抗體的)或Th2細胞介導的免疫應答，細胞或Th1細胞介導的免疫應答，以及某些情況下兩種免疫應答。已發現可以通過將預選抗原與免疫球蛋白重鏈恆定區相融合形成Fc-抗原融合蛋白來增強哺乳動物中蛋白或肽預選抗原的免疫原性。所得的Fc-抗原融合蛋白或編碼Fc-抗原融合蛋白的核酸序列可以疫苗的形式施用於哺乳動物，例如人中以引發針對預選抗原的免疫應答。
Fc-抗原融合蛋白選擇性地將該抗原靶向抗原呈遞細胞(APCs)。在不拘泥於理論的情況下，據信Fc-抗原融合蛋白與APCs的結合是通過表達於許多類型的免疫細胞如樹狀細胞；巨噬細胞；B細胞；和粒細胞上的Fc受體介導的。當Fc-抗原融合蛋白施用於哺乳動物後即與Fc-受體結合，然後被APCs吞噬。據認為被吞噬的包括預選抗原的融合蛋白降解為小肽後呈遞於細胞表面。所呈遞的肽從而介導體液和/或細胞免疫應答。所激發的具體免疫應答類型可以通過將Fc-抗原融合蛋白和一種佐劑，如佐劑融合蛋白共同施用而修飾。
在一種施用方式中，將Fc-抗原融合蛋白施用於受體。在另一種施用方式中，將編碼該Fc-抗原融合蛋白的核酸序列施用於受體。預選抗原或在所施用的Fc-抗原融合蛋白中，或由所施用的核酸表達均比單獨的抗原，即不通過多肽鍵與免疫球蛋白重鏈恆定區相連接的抗原，免疫原性高。而且在某些情況下順序施用融合蛋白後施用編碼相同融合蛋白的核酸，或反之，施用編碼融合蛋白的核酸後再施用相同的融合蛋白可以用於使預選抗原的免疫原性最大化。可以理解當融合蛋白的兩個組分均有活性時可以誘導出理想的免疫應答。換句話說，Fc-抗原融合蛋白中的預選抗原能夠引起免疫應答，而免疫球蛋白重鏈恆定區能夠與APCs表面的Fc受體相結合。
而且，正如所討論的，所誘導的免疫應答的類型和強度可以通過將特異的佐劑，Fc-抗原融合蛋白和/編碼Fc-抗原融合蛋白的核酸共同施用予以調節。儘管對於實施本發明而言，化學佐劑，例如明礬或弗氏完全或非完全佐劑在一定條件下如於獸醫方面應用中是有用的，其副作用如組織創傷，使得它們不適用於應用於人。據此，優選的佐劑包含一種第二Fc融合蛋白，其中的免疫球蛋白重鏈恆定區與一種佐劑蛋白相融合形成Fc-佐劑融合蛋白。與Fc-抗原融合蛋白一樣，若Fc佐劑融合蛋白的兩種組分均有活性則可以誘導理想的免疫應答。換句話說，在Fc佐劑融合蛋白中的佐劑可以調節免疫應答，其免疫球蛋白重鏈恆定區能與APCs表面的Fc受體相結合。
在本發明的一個優選實施例中，該抗原和佐劑均以Fc融合蛋白或編碼這樣的融合蛋白的核酸的形式施用。換句話說，所施用的抗原為Fc-抗原融合蛋白，所施用的佐劑為Fc-佐劑融合蛋白。對實施本發明有用的Fc融合蛋白的特定優選實施例如圖1A-1G所示。
圖1A中介紹了一種Fc融合蛋白示例，其中的免疫球蛋白重鏈恆定區1的C末端或直接或通過多肽接頭的方式與預選抗原或佐劑2的N末端相連接。此處所用到的術語「多肽接頭」是指將兩個蛋白連接在一起的包含一個或多個胺基酸殘基的序列。多肽接頭通常是長度約為10-15個殘基的一系列胺基酸，包括例如重複的甘氨酸和/或絲氨酸殘基。圖1B介紹了一種Fc融合蛋白的示例，其中預選抗原或佐劑2的C末端或直接或通過多肽接頭的方式與免疫球蛋白重鏈恆定區1的N末端相連接。
圖1C描述了一種包含通過二硫鍵共價連接在一起的兩個Fc融合蛋白的二聚體構建體。該二聚體構建體包括兩個Fc融合蛋白，其中每一個免疫球蛋白重鏈恆定區1的C末端均與預選抗原或佐劑2的N末端相連接。類似地，圖1D描述了一種包含通過兩個二硫鍵共價連接在一起的兩個Fc融合蛋白的二聚體構建體。該二聚體構建體包括兩個Fc融合蛋白，其中每一個預選抗原或佐劑2的C末端均與免疫球蛋白重鏈恆定區1的N末端相連接。
圖1E描述了通過兩個二硫鍵連接在一起的包括兩個Fc融合蛋白的二聚體構建體。其中每一個免疫球蛋白重鏈恆定區1的C末端均直接或通過一種多肽接頭與預選抗原或佐劑2的N末端相連接，其C末端還直接或通過一種多肽接頭與一種第二抗原或佐劑2』相連接。
圖1F也描述了包括通過兩個二硫鍵連接在一起的兩個Fc融合蛋白的二聚體構建體。其中每一個預選抗原或佐劑2的C末端均直接或通過一種多肽接頭與N免疫球蛋白重鏈恆定區1的N末端相連接，其C末端還直接或通過一種多肽接頭與一種不同的第二抗原或佐劑2』的N末端相連接。例如，這樣的融合蛋白由N到C末端方向可以包括預選抗原-免疫球蛋白重鏈恆定區-佐劑。
圖1G也描述了包括以兩個二硫鍵的方式連接在一起的兩個Fc融合蛋白的二聚體構建體。該二聚體構建體包括兩個Fc融合蛋白，其中的抗原或佐劑2的C末端直接或通過一種多肽接頭與一種不同的佐劑或抗原2』的N末端相連接，該佐劑或抗原2』的C末端直接或通過一種多肽接頭與免疫求蛋白重鏈恆定區1的N末端相連接。例如，這樣的融合蛋白由N-到C-末端的方向可以包括預選抗原-佐劑-免疫球蛋白重鏈恆定區。
在實施本發明時一般優選將Fc組分處在相對於佐劑組分的N末端位置。如果佐劑組分位於相對於Fc組分的N末端位置則佐劑-Fc融合蛋白可結合於免疫細胞的佐劑受體，且Fc組分將處於與抗體結合到細胞表面所採取的方向相同的方向。結果將導致ADCC或補體結合。但是，當Fc組分處在相對於佐劑組分的N末端位置時就不會產生ADCC或補體結合。
圖1C-1G所描述的構建體是通過臨近的鉸鏈區上的半胱氨酸之間形成的一對二硫鍵交聯成為二聚體的示例。在該圖中描述了二硫橋在這些分子具有天然形式的鉸鏈區將兩個免疫球蛋白重鏈恆定區部分連接起來。儘管在本發明中包括鉸鏈區是優選的，但可以理解如果需要也可以選擇在其它部位交聯。而且，在某些情況下，兩個或更多的單體可以非共價地相連形成對實施本發明有用的二聚體或多聚體。
此處所用到的術語「免疫球蛋白重鏈恆定區」可與術語「Fc區域」相互替換使用，可理解為是指能與Fc受體相結合的免疫球蛋白重鏈恆定區的羧基端、其類似物或其中的一部分。已知每一免疫球蛋白重鏈恆定區包括4或5個結構域。這些結構域依次命名為CH1-鉸鏈-CH2-CH3-(CH4)。CH4存在於IgM中，IgM中不存在鉸鏈區。對實施本發明有用的免疫球蛋白重鏈恆定區優選地包括免疫球蛋白鉸鏈區，且優選地還包括CH3結構域。該免疫球蛋白重鏈恆定區最優選地包括免疫球蛋白鉸鏈區，CH2結構域和CH3結構域。此處所用的術語免疫球蛋白「鉸鏈區」可理解為是指完整的免疫球蛋白鉸鏈區或至少足以與第二個免疫球蛋白鉸鏈區形成二硫鍵的免疫球蛋白鉸鏈區的一部分。
可以理解適合的免疫球蛋白重鏈恆定區可源於屬於IgA，IgD，IgE，IgG和IgM中的每一種類型的抗體，但源於IgG型抗體的免疫球蛋白重鏈恆定區是優選的。而且可以理解所述的免疫球蛋白重鏈恆定區也可以源於任意一種IgG抗體亞類即IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。
在各種免疫球蛋白類型中免疫球蛋白重鏈恆定區結構域具有交叉同源性。例如，IgG的CH2結構域與IgA和IgD的CH2結構域同源，且與IgM和IgE的CH3結構域同源。優選的免疫球蛋白重鏈恆定區結構域包括相應於IgG的CH2區域和CH3區域的蛋白結構域，或其功能部分或其衍生物。該免疫球蛋白重鏈恆定區結構域優選地至少缺少CH1結構域。而且，Fc-抗原或Fc-佐劑融合蛋白可任選地缺少免疫球蛋白可變區。在一個更優選的實施例中，該免疫球蛋白重鏈恆定區結構域按由N末端到C末端的方向包括免疫球蛋白鉸鏈區，CH2結構域和CH3結構域，且以上全部基於來自IgG分子的序列。在美國專利5,541,087和5,726,044中詳細討論了對合適的免疫球蛋白重鏈恆定區的選擇。從特定的免疫球蛋白類型和亞類中選擇合適的免疫球蛋白重鏈恆定區序列屬於本領域普通技術人員能力範圍內。
在某些情況下通過基因工程或其他方法對免疫球蛋白重鏈恆定區進行修飾例如突變，缺失或其它的改變可能有用，由此特定的活性，如補體結合，抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)的刺激可被減弱或消除。但是有必要保留免疫球蛋白重鏈恆定區與Fc受體相結合的能力。
對於實施本發明Fc-抗原融合蛋白和Fc-佐劑融合蛋白中的免疫球蛋白重鏈恆定區在預期受體中優選地為無免疫原性或弱免疫原性。如果免疫球蛋白重鏈恆定區不引起可檢測到的直接針對該免疫球蛋白重鏈恆定區的抗體應答則認為Fc區域是無或若免疫原性的。據此該免疫球蛋白重鏈恆定區域應源於與該融合蛋白的預期受體同種的生物體中的免疫球蛋白或基於與該融合蛋白的預選受體同種的生物體中的免疫球蛋白相應的胺基酸序列。換句話說，當Fc融合蛋白構建體(Fc抗原和/或Fc-佐劑融合蛋白)施用於人時，應當使用人免疫球蛋白重鏈恆定區序列。人Fc IgG的核酸和胺基酸序列已經公布，例如在Ellison等(1982)核酸研究104071-4079。同樣的當將Fc融合蛋白施用於小鼠時則應當使用鼠Fc序列。鼠Fc IgG2a的核酸和胺基酸序列已經公布，例如在Bourgois等(1974)歐洲生物化學雜誌43423-435。同理，當將Fc融合蛋白施用於其它的動物如貓，狗和牲畜如牛，馬時也應遵循同樣的規律。
此處所用到的術語「預選抗原」是指任何蛋白，或其中的片段或者多肽，其單獨或與其它試劑結合能在哺乳動物中誘導免疫應答。可以理解任何所需的預選抗原均可以包括在本發明的Fc-抗原融合蛋白中。在一個優選實施例中，該預選抗原選自下組，該組包括前列腺特異性的膜抗原(PSMA)；細胞因子受體的胞外結構域，例如人IL-4受體的胞外結構域；腫瘤特異性抗原(例如相對於正常細胞在腫瘤細胞中上調了或水平升高了的抗原)；和病毒蛋白，例如由人免疫缺陷病毒(HIV)基因組編碼的蛋白。
此處所用到的術語「佐劑」是指任何可以通過例如增強針對預選抗原免疫應答(體液或細胞)而作為免疫調節劑的物質。此處所用到的術語「體液」免疫是指由體液如血漿或淋巴中的抗體介導的免疫，而「細胞」免疫在本領域中也稱為「細胞介導的免疫」是指由T淋巴細胞引發、效應T淋巴細胞和/或巨噬細胞介導的免疫反應。
如上面所討論的，多種化學佐劑例如弗氏佐劑可用於免疫非人動物。儘管廣泛用於動物中以產生高滴度的抗體或顯著的細胞毒T淋巴細胞(CTL)應答，但其副作用例如組織創傷，使得它們不適合應用於人。因此，需要在注射部位不產生炎症的條件下誘導強免疫應答。使用本發明的Fc佐劑融合蛋白的一個突出的優點在於其無須使用如弗氏完全佐劑之類的化學佐劑即可誘導強免疫應答。
用於實施本發明的優選的佐劑包括一種Fc佐劑融合蛋白或編碼編碼該佐劑融合蛋白的核酸。優選的包含在佐劑融合蛋白中的佐劑蛋白包括細胞因子。此處所用到的術語「細胞因子」是指能夠修飾哺乳動物中的免疫細胞如T細胞；B細胞；巨噬細胞；中性粒細胞；嗜酸細胞；嗜鹼細胞；樹狀細胞；和它們的前體的活性的任何蛋白，蛋白類似物或其中的功能片段。優選的細胞因子包括，例如IFN-y，IL-2，IL-4，IL-12，IL-18，TNF，和GMCSF。CD40配體的胞外結構域也是與Fc融合構成Fc-佐劑的優選蛋白。與不加Fc佐劑融合蛋白單獨使用Fc抗原融合蛋白相比，與Fc佐劑共同施用的Fc抗原融合蛋白中的抗原可以引發更強的免疫應答。在某些情況下，僅用伴有Fc佐劑的Fc-抗原進行兩次免疫所達到的抗體水平即等同或高於利用弗氏佐劑所達到的抗體水平且沒有可觀察到的皮膚反應。
對具有免疫球蛋白重鏈恆定區的Fc-抗原融合蛋白或Fc-佐劑融合蛋白而言，在預期的受體中，該佐劑蛋白優選的為無或弱免疫原性。這可以通過用與從預期受體同種的生物體中分離的細胞因子相應胺基酸序列定義的細胞因子摻入Fc佐劑融合蛋白來完成。例如，當將Fc佐劑融合蛋白施用於人時，其中的佐劑蛋白(如細胞因子)優選人源的。
將Fc-抗原和Fc佐劑融合蛋白同時或先後共同施用可用於調節所刺激的針對預選抗原的免疫應答的類型。稱為Th1和Th2的兩類免疫應答由不同的感染所引起並包含不同的細胞因子。Th1介導的免疫應答本質上是典型的細胞型的，而Th2介導的免疫應答本質上是典型的體液型的。據此，Th1應答可用於攻擊可變細胞如腫瘤細胞或或病毒感染的細胞，而Th2應答可用於攻擊胞外物質如寄生蟲。通常將細胞因子與免疫球蛋白重鏈恆定區相融合用於激活普通的免疫應答或起始、調節特定的Th1或Th2應答。
而且，對存在於Fc-佐劑融合蛋白中的特定的細胞因子的選擇可以影響針對Fc-抗原融合蛋白中的預選抗原所產生的抗體類型。例如，Fc-IL2通過刺激產生已知的Th1細胞因子如IFN-y，IL-2，和TNF激發輔助T細胞應答，上述的Th1細胞因子可促進有效的細胞免疫並產生IgG2a類抗體。相反，Fc-IL-4激發可促進體液免疫的Th2細胞因子例如IL-5，IL-6，IL-10和IL-4的產生。
如上所述，在一優選實施例中的方法包括將Fc-抗原融合蛋白或編碼Fc抗原融合蛋白的核酸與Fc佐劑融合蛋白一起施用。通過使用各自均包含免疫球蛋白重鏈恆定區的兩種融合蛋白，可以將預選抗原和佐劑蛋白(例如細胞因子)共定位(co-localize)於哺乳動物的相同或相似的細胞類型中。例如在其表面表達Fc受體的巨噬細胞，B細胞，粒細胞和樹狀細胞。據此，通過將Fc-抗原與能與Fc受體結合的Fc-佐劑融合蛋白共同施用，可將抗原-融合蛋白中的抗原和佐劑融合蛋白中的佐劑共定位於相同的APCs細胞區室。該佐劑可以增強或調節在該預選抗原附近的免疫應答。
Fc細胞因子的結合也可以一種協同的方式來刺激普通的免疫應答，並進而影響細胞(Th1)或體液(Th2)應答的出現。例如Fc-GMCSF是有效的常規免疫應答刺激物。但是為了調節進一步針對細胞或Th1介導的免疫應答，可以將如Fc-IL12或Fc-IFNy的佐劑蛋白與Fc-GMCSF共同施用。為進一步促進體液或Th2介導的應答可以將如Fc-IL4的佐劑蛋白與Fc-GMCSF共同施用以調節針對產生Th2細胞的應答。其它用於與Fc融合的Th1或Th2促進的細胞因子也可以依照所需生理應答的確切性質加以應用。可以理解這種常規的方法也可以通過使該應答針對特定抗原而非有害抗原而調節如自身免疫(一種Th1介導的疾病)和變態反應(一種Th2介導的疾病)等現存的致病應答，該調節過程是通過免疫一種新的相反Th類型的應答進行的。
某些環境下，當用Fc-抗原融合蛋白免疫動物時用核酸作為佐劑是有益的。核酸例如，包括富含胞嘧啶-磷酸二酯鍵連接-鳥嘌呤(CpG)序列的寡核苷酸偏向於Th1應答的免疫應答，也可選擇性的與其它佐劑如細胞因子(參見例如，Brazolot等.(1998)美國國家科學院彙編(PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.)9515553-8；Liu等(1998)血液923730-6；和Klinman等(1997)免疫學1583635-3639)結合使用。據此可以理解將含CpG的寡核苷酸與Fc抗原融合體共同施用可以增強或適當地調節免疫應答。這樣的核酸分子可以是任意的長度，但優選大於8個核苷酸。該核酸序列優選地包括CpG序列，更優選包括嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶，且CpG中間的胞嘧啶是非甲基化的。在佐劑DNA中該CpG二核苷酸的出現頻率優選至少約為5％，更優選約為10％。例如雙鏈形式的脫氧寡核苷酸TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ.ID NO.22)可以用作佐劑。依照所需的免疫應答的類型可以將該核酸序列與明礬結合使用。
本發明利用傳統的重組DNA方法學構建Fc融合蛋白用於實施本發明。該Fc融合構建體優選在DNA水平構建，將所得的DNAs整合到表達載體中使其表達以產生本發明的Fc-抗原或Fc-佐劑融合蛋白。此處所用到的術語「載體」是指任何包含能夠摻入到宿主細胞中並通過重組整合到宿主細胞基因組中或作為附加體進行自我複製的核酸序列。這樣的載體包括線性核酸，質粒，噬菌粒，粘粒，RNA載體，病毒載體等。病毒載體的非限定性的實例包括逆轉錄病毒，腺病毒和腺伴隨病毒。此處所用到的術語Fc融合蛋白的「基因表達」或「表達」是指DNA序列的轉錄，mRNA轉錄體的翻譯和Fc融合蛋白產物的分泌。分別包含IL2，CD26，Tat，Rev，OSF-2，bIG-H3，IgE受體，PSMA，或gpl20的Fc融合蛋白已用上述類型的表達載體進行表達。在美國專利5,541,087和5,726,044中討論了相同或相類似的表達構建體。
作為通過遺傳工程技術對蛋白進行融合的替代，也可以將傳統的化學交聯劑進行化學偶聯用於蛋白組分的融合。
用於實施本發明的基本載體包括一種選擇標記，例如由源於諸如SV40病毒的轉錄調節序列驅動的編碼二氫葉酸還原酶的基因(DHFR)，和用於選擇和維持該質粒在大腸桿菌中存在的細菌質粒序列。融合蛋白序列的表達由啟動子和可選擇的增強子序列驅動，例如巨細胞病毒(CMV)啟動子和增強子序列。
若將該Fc融合蛋白或編碼該融合蛋白的核酸施用於人，該Fc融合蛋白編碼序列沿5』-3』的方向優選地由衍生自例如抗體輕鏈(L)的「前導肽」起始並與優選源於人免疫球蛋白g1基因的Fcγ1區域的至少部分免疫球蛋白重鏈恆定區或其突變形式進行框內融合。該人免疫球蛋白Fcγ1基因的Fcγ1區域優選包括至少部分鉸鏈區和CH3結構域，更優選包括至少部分鉸鏈區，CH2結構域和CH3結構域。若將該Fc融合蛋白施用於小鼠，優選的編碼免疫球蛋白重鏈恆定區結構域的的核酸序列包括沿5』-3』的方向編碼源於小鼠IgG2a抗體鉸鏈區，CH2結構域和CH3結構域的核酸序列。如果需要免疫球蛋白重鏈恆定區的羧基端可以在核酸水平進行修飾，以將其與編碼預選抗原(對於Fc抗原融合蛋白的情況)或免疫激活因子(對於Fc-佐劑細胞因子的情況)進行框內連接。編碼分泌盒的DNA可以是其基因組構型也可以是其cDNA構型。
編碼信號序列的部分DNA優選編碼指導Fc融合蛋白分泌並進而從該Fc融合蛋白的剩餘部分中切除的的肽片段。本發明的信號序列是多核苷酸，其編碼一種胺基酸序列，該胺基酸序列引發蛋白穿越內質網膜的轉運。用於本發明的信號序列包括抗體輕鏈信號序列，例如抗體14.18(Gillies等(1989)免疫學方法雜誌125191)，抗體重鏈信號序列例如，MOPC141抗體重鏈信號序列(Sakano等(1980)自然2865774)和任何本領域所知的信號序列(參見例如，Watson(1984)核酸研究125145)。
已知在本領域中已被清楚描述的信號序列典型地包括16到30個胺基酸殘基，也可以包括更多或更少的胺基酸殘基。典型的信號肽序列包括3個區域鹼性的N末端區域，中間的疏水區域，和極性較強的C末端區域。中間的疏水區域包括4到12個疏水殘基，其在裸肽轉運過程中錨定該信號肽穿越脂雙層膜。在起始後信號肽通常在內質網腔中由稱為信號肽酶的細胞酶切除。信號肽中可能的切割位點一般遵循「(-3，-1)」規則。因而典型的信號肽在-1和-3位具有小的中性胺基酸殘基且在這一區域內缺乏脯氨酸殘基。該信號肽酶將切割-1和+1胺基酸之間的信號肽，這樣在分泌過程中信號序列可從融合蛋白的氨基端切除，從而導致融合蛋白分泌。對實施本發明有用的信號肽序列是本領域所公知的。參見例如von Heijne(1986)核酸研究144683。
需用常規的實驗來確定用於分泌盒的信號序列的適合性對本領域的技術人員來說是顯而易見的。這樣的實驗包括確定信號序列指導Fc融合蛋白分泌的能力和/或確定為使Fc融合蛋白有效分泌所用到的基因組或cDNA序列的理想構型。另外本領域的技術人員也可以由上述von Heijne的文獻中的方法構建合成的信號肽序列並通過常規的實驗檢測這樣的合成信號肽序列的效率。術語「信號序列」，「信號肽」，「前導序列」或「前導肽」在此處可以相互替換。
可見有許多不同的方式將Fc融合蛋白或編碼該融合蛋白的核酸序列用於免疫針對預選抗原的受體。本發明的兩種不同的應用可以用於產生CTL應答，一種是基於注射編碼Fc-抗原融合蛋白的DNA，另一種是基於施用能夠將該蛋白呈遞到I類MHC途徑的Fc抗原融合蛋白。
注射蛋白抗原典型地用於在哺乳動物中引發免疫應答。但本發明也提供通過DNA注射將抗原呈遞到APCs的方法。通常使用的技術是將編碼抗原蛋白的DNA表達載體注射到肌肉中。有報導顯示該蛋白抗原由肌肉細胞表達但該抗原不通過這些細胞呈遞到免疫系統。而據信特化的APCs，例如巨噬細胞和樹狀細胞遷移到注射位點，以目前尚不清楚的過程裹挾並呈遞該抗原。用Fc-抗原融合蛋白表達載體可使這一過程更加有效，因為所分泌的融合蛋白能比天然的抗原蛋白更有效地結合到APCs上。
DNA注射的方式的一個結果往往導致兼有體液和細胞免疫應答產生。典型地，外源施用的蛋白更難於進入呈遞到MHC I類分子的途徑。然而，施用本發明的Fc融合蛋白可能是通過MHC I類分子的呈遞的外源預選抗原增加了細胞毒性細胞的產生。DNA免疫與蛋白免疫相結合也可以在免疫系統中對初級免疫起協同作用並進而以抗體產生和細胞毒性細胞應答的形式增加應答水平。將Fc-佐劑融合蛋白例如Fc-IL-2，Fc-GMCSF，Fc-IL-12，和Fc-Flt3配體與Fc-抗原融合蛋白的共同施用確保該融合蛋白共定位於相同的APCs細胞區室，由此刺激針對預選抗原更有效的免疫應答。
本發明的組合物(即，Fc-抗原和/或Fc-佐劑融合蛋白，或編碼以上融合蛋白的核酸序列)可以通過任意合適的方式直接(例如局部地，如通過注射，植入或局部施用到組織位點)或全身的(例如非腸道的或口服)施用於動物。當該組合物以非腸道的方式提供時，例如由皮下的，眼睛的，腹膜內的，肌內的，口腔的，直腸的，陰道的，眼眶內的，經皮的，大腦內的，顱內的，脊柱內的，心室內的，鞘內的，腦池內的，囊內的，鼻內的或通過煙霧劑施用，該組合物優選包括部分含水的或生理上可接受的流體，懸浮液或溶液。這樣該載體或賦形劑是生理上可接受的因此除向患者運送所需的組合物外並不對病人的電解質和/或容積平衡產生不良影響。該試劑的流體介質可以包括正常的生理鹽水(例如含9.85％NaCl的水溶液0.15M，pH7-7.4)。
每次施用Fc-抗原融合蛋白的優選劑量在50ng/m2到1g/m2的範圍內，更優選5μg/m2到200mg/m2，最優選0.1mg/m2到50mg/m2。每次施用Fc-佐劑融合蛋白的優選劑量在1ng/m2到0.1g/m2的範圍內，更優選0.5μg/m2到20mg/m2，最優選10μg/m2到5mg/m2。每次施用編碼Fc-抗原融合蛋白或Fc-佐劑融合蛋白的核酸的優選劑量在1μg/m2到100mg/m2，更優選20μg/m2到10mg/m2，最優選400μg/m2到4mg/m2。
可以理解通過多次獨立的免疫可以達到最大限度的免疫，例如相隔約3周到6個月接種1到3次。而且，如上所述在特定的情況下通過交替施用Fc融合蛋白和編碼這樣的Fc融合蛋白的核酸可以獲得最大程度的免疫反應。Fc-抗原融合蛋白或編碼該融合蛋白的核酸可以在Fc佐劑融合蛋白或編碼該佐劑融合蛋白的核酸施用於哺乳動物之前，同時或之後施用於哺乳動物。本領域的技術人員在其能力範圍內可以通過常規的實驗來確定理想的給藥方式、劑量和加強方案。
通過下列非限定性的實施例對本發明作進一步介紹。
實施例實施例1.Fc-抗原和Fc-佐劑表達載體的構建用編碼小鼠IgG2a Fc區域的核酸構建了表達載體以在小鼠模型中檢驗Fc融合蛋白的免疫原性。這減少了每一Fc融合蛋白的Fc區域在該哺乳動物中誘導免疫應答的風險。而且將小鼠細胞因子用作Fc-佐劑融合構建體的融合組分，因為它們的生物活性具有很高的物種特異性。因而用編碼小鼠IgG2a Fc(美國專利5,726,044)的cDNA序列替換早先報導的載體(Lo等(1998)蛋白質工程11495-500)中的人IgG1的Fc序列，以對其進行修飾(參見圖2)。
從小鼠脾細胞庫中通過聚合酶鏈式反應(PCR)克隆小鼠IgG2a Fc序列。該PCR引物包含在5』端連接前導序列的接頭序列和在3』端連接編碼抗原或佐劑細胞因子序列的唯一的Sma I/Xma I酶切位點。使抗原或佐劑(細胞因子)序列的5』端為Sma I位點並保持Fc和抗原或佐劑蛋白之間的閱讀框，以及緊鄰於翻譯終止信號後的唯一的Xho I位點。所得的DNA構建體編碼與小鼠IgG2a H鏈直接融合的輕鏈前導序列以及接下來的小鼠IgG2a CH2和CH3外顯子和融合組分(抗原或佐劑細胞因子)。
轉錄由CMV啟動子/增強子驅動，其對DNA體內注射後在培養中的大多數細胞類型中以及肌肉中和其它細胞類型中的表達有用。與維持質粒DNA在大腸桿菌中穩定所需的序列一樣，每一載體均包括可選擇的二氫葉酸還原酶(DHFR)標記基因以便於選出穩定的轉染克隆。
下述是通過在所設計的載體中唯一的Sma I到Xho I位點之間插入合適的接頭序列而構建的Fc-抗原構建體pdCs-muFc的示例。其中的″mu″代表該Fc是鼠源的所述人IL4受體(IL-4R)的胞外結構域(細胞外部分)是通過PCR擴增從人外周血單核細胞(PBMC)中克隆得到的。所用引物分別為5′GTCCCGGGTATGAAGGTCTTGCAGGAGC(SEQ ID NO1)和5′CCCCTCGAGCTAGTGCTGCTCGAAGGGCTCCCTG(SEQ ID NO2)，其分別包括Sma I和Xho I位點，以便於插入pdCs-muFc載體中。PCR反應的條件和接下來的克隆步驟如下。Advantage KlenTaq和多聚酶Mix(Clontech，Palo Alto，加拿大)，和用於增所需基因所用的特定引物。在總共100ml體積的反應混合物中包括10mM Tris-HCI，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01％明膠(w/v)，每種dNTPs 0.2mM，和1.25單位的KlenTaq。進行了30個PCR循環。每一循環包括在94℃熱變性1分鐘，42℃下退火45秒，在72℃下進行引物擴增1分鐘。擴增產物亞克隆到SK載體上(Stratagene，San Diego，加拿大)，並通過標準的測序方法驗證DNA序列。
以5′AAGCTTAAATCCTCCAATGAAGC(SEQ ID NO3)和5′CTCGAGTTAGGCTACTTCACTCAAAG(SEQ ID NO4)，分別作為正義鏈和反義鏈的引物通過PCR由LnCAP前列腺癌細胞系(ATCCCRL1740)中克隆到人前列腺特異性膜抗原(PSMA)的胞外結構域。驗證了該DNA序列後將所得的PCR片段插入到pdCs-muFc載體中以構建了pdCs-muFc-PSMA融合構建體。
EpCAM(也是已知的KS抗原)的胞外結構域，在大部分癌細胞中上調的(upregulated)的上皮細胞表面蛋白，是分別以5′CCCCGGGTAAACAGGAAGAATGTGTCTGTG(SEQ IDNO5)，和5′CTCGAGTCATTTTAGACCCTGCATTGAG(SEQ IDNO6)作為正義鏈和反義鏈的引物，通過PCR由LnCAP細胞中克隆到的。通過標準的測序方法驗證了該DNA序列，然後將該PCR片段插入到載體pdCs-muFc中構建了pdCs-muFc-EpCAM融合構建體。用EpCAM胞外結構域作為N-末端融合組分構建了另一載體，在這種情況下該PCR產物包括EpCAM cDNA的天然前導部分和到跨膜結構域邊界的成熟胞外結構域。該PCR產物的3′末端包括一個基因工程化的Afl II位點以連接到小鼠Fc片段的5′Afl II位點。所用的PCR引物包括5′TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGC(SEQ ID NO7)和5′CCTTAAGCACCCTGCATTGAGAATTCAG(SEQ ID NO8).在該情況下小鼠Fc缺少插入到融合蛋白中的3′插入位點，但Fc編碼序列末端包含包含翻譯終止信號。
HIV gp41近膜區中相對保守的區域，即從Hind III位點到臨近跨膜區域的賴氨酸，作為Fc融合蛋白表達，其是短肽抗原抗原序列的一個例證。儘管使用了來自HIV IIIB菌株的蛋白序列，但通過用偏嗜高GC含量的密碼優化該編碼序列以便其在真核細胞中理想地表達。編碼第626位到669位胺基酸殘基的DNA具有下述序列C CCG GGA TCC CTG ATCCAC TCC CTG ATC GAG GAA TCC CAG AAC CAG CAA GAG AAGAAC GAG CAG GAG CTG CTG GAG CTC GAC AAG TGG GCC TCCCTG TGG AAC TGG TTC AAC ATC ACC AAT TGG CTG TGG TAC ATCAAG TGA CTC GAG(SEQ ID NO9)，其是通過化學方法合成的並連接到載體pdCs-muFc中。融合多肽的胺基酸序列為SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK(SEQID NO10)。
其它HIV蛋白編碼序列依照前述(美國專利5,541,087和5,726,044)用於構建Fc-抗原，其用小鼠IgG2a Fc而非人源的IgG1 Fc的融合蛋白。這些構建體代表本發明進一步的實施例。
用與Fc抗原融合蛋白相同的方式構建了一系列包括小鼠IgG2a Fc和幾個小鼠細胞因子的Fc-佐劑(細胞因子)融合蛋白。特定的細胞因子和克隆引物如下所述。
小鼠IL-2通過PCR用下列引物由小鼠外周血單核細胞(PBMCs)克隆得到的。PCR引物(有義)5′GGCCCGGGTAAAGCACCCACTTCAAGCTCC(SEQ ID NO11)，和(反義)5′CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG(SEQ ID NO12)。
小鼠GMCSF是用下列PCR引物通過PCR自小鼠PBMCs中克隆到的。PCR引物(有義)5′CCCGGGAAAAGCACCCGCCCGCTCACCC(SEQ ID NO13)，和(反義)5′CTCGAGTCATTTTTGGCTTGGTTTTTTGC(SEQ ID NO14)。
小鼠Flt3配體是用下列PCR引物通過PCR自小鼠胸腺中克隆到的。PCR引物(有義)5′CAAGCTTACACCTGACTGTTACTTCAGC(SEQID NO15)，和(反義)5′CTCGAGTCAAGGCTCTGGGAGCTCCGTGGC(SEQ ID NO16)。
小鼠IL-12p35是用下列PCR引物通過PCR自小鼠PBMCs中克隆到的。PCR引物(有義)5′CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG(SEQ ID NO17)，和(反義)5′CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC(SEQ ID NO18)。
小鼠IL12 p40是用下列PCR引物通過PCR自小鼠PBMCs中克隆到的。PCR引物(有義) 5′TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC(SEQ ID NO19)，和(反義)5℃TCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG(SEQ ID NO20)。
所有的PCR產物，除小鼠IL-12 p40外，均克隆了Sma I到Xho I片段，用標準的DNA測序方法進行分析後，連接到包含小鼠IgG2a的Fc作為其Fc區域的pdCs-muFc載體上。小鼠IL-12 p40 PCR在含有相同的CMV啟動子增強子，直接融合於成熟小鼠IL-12的亞單位p40上的輕鏈前導序列，和替代在pdCs-muFc載體中的DHFR選擇標記基因的新黴素抗性基因的載體中單獨表達(不作為Fc融合蛋白)。所得的載體稱為pNC-mp40，其中的″N″代表新黴素選擇基因。
所有的質粒構建體通過在人腎293細胞中的瞬間表達誘導特定融合蛋白的合成和分泌。簡要地說，質粒與磷酸鹽的共沉澱引入人腎單層膜細胞293中(Sambrook等(1989)分子克隆實驗操作手冊，冷泉港，紐約)。上述細胞放置過夜(16hr)，用PBS清洗，再加入新鮮細胞培養基(DMEM含10％胎牛血清(FBS))。2-3天後，用對小鼠IgG-Fc蛋白具有抗體特異性的Fc特異的ELISA(Gillies等(1989)免疫學方法雜誌125191)檢測培養培養基中所分泌的Fc融合蛋白。對於小鼠Fc-IL12，將Fc-p35和p40表達質粒DNAs在相同的細胞培養物中瞬間表達，以便異源二聚體細胞因子融合蛋白在分泌出細胞前進行組裝。(Gillies等(1998)免疫學雜誌1606195)。
因此，穩定轉染的表達多種Fc融合蛋白的細胞是通過標準的電穿孔技術將線性DNA引入小鼠NS/0骨髓瘤細胞所產生的。簡要地說，以107細胞/ml的濃度將細胞懸浮於Gene Pulser Cuvette(BioRad)中，0.5ml的懸浮與10μg DNA相混合，將混合物在冰上冷卻10分鐘。用設定為0.25V和500pF的Gene Pulser(BioRad)進行電穿孔。將細胞在冰上復甦10分鐘，隨後懸浮於生長培養基中並轉入96-孔板。從電穿孔後兩天開始，每2-3天用含0.1uM氨甲喋呤的生長培養基餵細胞。通過FcELISA方法檢測在96-孔板上生長的抗性克隆表達。
為表達小鼠Fc-IL12融合蛋白，如上所述用小鼠Fc-p35亞單位表達載體轉染已表達小鼠IL-12 p40亞單位的NS/0轉染細胞系。p40表達系是用pNC-mp40載體對NS/0進行電穿孔而獲得的，如上所述，在含新黴素類似物G418(生命科學技術)的培養基中篩選。第二次轉染後用FcELISA和小鼠IL-12 ELISA(Genzyme，Cambridge，MA)篩選存活的細胞克隆。
所得融合蛋白的結構完整性由SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗證。開始，融合蛋白結合於小體積(每ml培養基10-20μl)的蛋白A Sepharose(Repligen，Needham，MA)上。用含Tween-20(0.01％)的PBS洗滌結合物，然後在含SDS的凝膠緩衝液中洗脫，再在5％2-巰基乙醇存在下煮沸2分鐘。將還原蛋白在預先灌制的SDS-PAGE凝膠中電泳後用考馬斯蘭染色。依照生產商的說明用蛋白A Sepharose柱(Repligen，Needham，MA)從所得穩定克隆中進行大量的純化。
實施例2.Fc-抗原的免疫原性和化學或Fc-細胞因子佐劑對抗體產生的效果將在實施例1中製備的小鼠Fc-huIL-4Rα亞單位構建體用作抗原以檢測這些蛋白在動物模型中潛在的APC-靶向效果。IL-4Rα亞單位的胞外結構域代表物種間相當保守的分子，在人和小鼠間有高於50％的序列同一性。
用在PBS中或用弗氏完全佐劑(CFA)乳化的50μg Fc-抗原融合蛋白(Fc-IL-4R)以皮下的方式注射成組小鼠。其中一些組的小鼠還受到5μg劑量(與Fc-IL-4R混合)的Fc-IL2或Fc-GMCSF Fc-佐劑蛋白。兩周後，在小鼠的腹膜腔中注射同樣的混合物。該CFA形成產生微團，該微團形成緩釋-抗原源，對免疫系統形成連續地刺激。CFA中的分枝桿菌蛋白也通過細胞因子的刺激誘導強炎症性的應答，由此進一步加強免疫應答。但CFA，引起包括皮膚損傷的嚴重的副作用因此不適宜施用於人。但摻有含於PBS中的Fc-佐劑融合蛋白的混合物在任何動物中均不引起任何可見的皮膚反應也沒有任何明顯的毒性跡象。
加強兩周後(即第一次注射後28天)，採集動物血液並將全部的血液在微離心管中凝集製備血清，研磨細胞將塊狀物以12000 RPM高速離心5分鐘，收集上清液。將所得血清用分析緩衝液(含0.01％Tween-20的PBS)稀釋並用人IL-4R檢測抗體反應。用人Fc-huIL-4R包被的96-孔培養板進行抗原特異的ELISA，該培養板每孔加入100μl含於PBS的5μg/ml人Fc-huIL-4R，在4℃下培養(過夜)。使用前用封閉緩衝液(1％BSA，0.01％Tween-20 PBS)清洗並封閉該培養板。室溫下使孔中的供試抗原稀釋物溫育2小時，然後用分析緩衝液對孔清洗8次。加入第二抗-小鼠Fc-特異性的辣根過氧化物酶連接的抗體(1∶2000稀釋，Jackson免疫研究)，將培養板再溫育1小時。在用分析緩衝液清洗8次後，加入含25mM檸檬酸，50mM Na2HPO4，pH5的鄰苯二胺二氫氯化物(OPD)溶液並加入0.03％的新鮮H2O2。反應30分鐘後加入100μL of4N H2SO4終止反應。所得平皿在讀數儀上490nm讀數，該讀數儀可自動去除在650nm下讀出的背景值。將所得結果繪製成光密度和抗血清稀釋度之間的關係圖。通過在光密度降到一個設定值例如1O.D.單位前所需稀釋的抗體量來確定相對抗體滴度。
免疫方法的結果如圖3所示。通過這種方法單獨注射含於PBS中的Fc-IL-4R融合蛋白僅在一隻小鼠中引起抗體應答(圖3B)。但添加了CFA可引起較多的小鼠產生應答而滴度與單獨用含於PBS中的Fc-IL-4R融合蛋白注射時基本相同(圖3C)。將小鼠Fc-IL2佐劑與含於PBS的Fc-IL4R共同施用可以在所有的動物中誘導應答，但所產生的抗體的量有所不同(圖3D)。與單獨使用任意一種試劑相比，將CFA與小鼠Fc-IL2佐劑共同施用(圖3A)可誘導出較高的抗體滴度(圖3C和3D)。將含於PBS中的小鼠Fc-GMCSF佐劑共同施用可誘導出在所有組中最強的免疫應答(圖3E)，包括用Fc-GMCSF佐劑和CFA共同施用所免疫的組(圖3F)。換句話說，含於PBS中的小鼠Fc-GMCSF佐劑當與小鼠Fc-IL4R抗原共同施用時無需使用CFA。因而這樣的方法更適合應用於人。
實施例3.對在Fc-PSMA融合蛋白中的癌症抗原，PSMA所產生的抗體的Fc-GMCSF佐劑劑量的效果此處PSMA基於其有限的正常組織分布代表一種有吸引力的人類腫瘤相關靶抗原。目前PMSA作為腫瘤疫苗侯選物正在進行臨床實驗。在這一實施例中對Fc-PMSA融合蛋白中的PMSA抗原進行了評估。
按照實施例1中所討論的方法製備小鼠Fc-PSMA融合蛋白。對成組的小鼠以皮下方式注射50μg含於PBS中的小鼠Fc-PSMA，並輔以各種濃度的Fc-佐劑融合蛋白Fc-GMCSF，並在14天後以腹膜內注射的方式加強免疫。如實施例2中對Fc-IL4R融合蛋白的描述通過Fc-PSMA抗原俘獲ELISA測定抗體滴度。結果繪製成圖4中的抗體滴度(在OD值還原為1時的稀釋度)和第一次免疫後的時間的關係圖。
缺乏Fc-GMCSF時，小鼠針對PSMA的抗體滴度範圍在1000到約20,000(圖4A)。在與少到0.05μgFc-GMCSF共同施用時所得的抗體滴度範圍在30,000 to 140,000(圖4B)。Fc-GMCSF 10倍的增加進一步刺激針對這一癌症抗原的抗體滴度(圖4C和4D)。所給出的最高劑量(每隻小鼠5μg Fc-GMCSF融合蛋白)仍僅代表每注射劑量約2μg GMCSF-對小鼠的皮膚或所免疫動物的任何系統標記沒有明顯的影響(參見圖4D)。而且與CFA不同的是也沒有明顯的脾增大。
實施例4.免疫抗體應答相關的Fc-介導的PSMA呈遞效果通過比較在注射了該融合蛋白，非融合抗原或佐劑蛋白或前述混合物的小鼠中所誘導的免疫應答來檢測Fc-抗原和Fc-佐劑融合蛋白中Fc組分的特異影響。人PSMA系統用於這一目的。
依照製造商的介紹用纖溶酶通過蛋白水解消化Fc-PSMA融合蛋白(Lo等(1998)蛋白質工程11495-500)製備非融合的PSMA。通過蛋白A Sepharose(Repligen，Needham，MA)的吸收去除所釋放的Fc和未消化的Fc-PSMA。
成組的小鼠(n＝3)以皮下方式單獨(圖5A)或與注射50μg劑量PSMA，或與0.2μg游離的GMCSF(圖5B)或0.5μg Fc-GMCSF(圖5C)(0.5μg含約0.2μg GMCSF的Fc-GMCSF)結合施用。另一組小鼠中，每隻小鼠以皮下的方式單獨注射了50μg劑量的Fc-PSMA融合蛋白(圖5D)，或與0.2μg游離的GMCSF(圖5E)或0.5μg Fc-GMCSF(圖5F)結合使用。所有的注射均在不含化學佐劑的PBS中進行。免疫後14天測定抗體與小鼠Fc-PSMA的反應性。
當用無化學佐劑的PBS配製注射動物時Fc-PSMA中Fc-抗原的對PSMA的免疫原性的重要性是明顯的。其本質上沒有針對於PBS中施用的PSMA的初級免疫應答(圖5A)。添加GMCSF或Fc-GMCSF除在一隻動物中有微弱的應答外(圖5B)對免疫只有非常微小的影響(圖5B和5C)。相反單獨用Fc-PSMA注射動物在所有的情況下均產生強的免疫應答(圖5D)。向加強的Fc-GMCSF中添加游離的GMCSF只有微弱的影響(圖5E)，但將抗原和作為Fc融合蛋白的細胞因子共同施用給出最高水平的應答(圖5F)。
這些結果表明將Fc-抗原和Fc-佐劑相結合對產生免疫應答非常有用，並且對該抗原和在體內的刺激細胞的共定位，假定是對APCs，有明顯的益處。
實施例5比較融合蛋白Fc-GMCSF或Fc-Flt3L的佐劑效果Flt3的配體在本領域中也指Flt3配體(Flt3)，已表明其在樹狀細胞(Soligo等BR.J.HAEMATOL.101352-63)的產生和成熟過程中起關鍵的作用。據認為，樹狀細胞和組織巨噬細胞是最重要的APC。在小鼠中的研究表明連續10天每天注射可以增強從淋巴組織和脾中收集的樹狀細胞的數量和APC活性，而且這些細胞對向CD4+和CD8+T細胞呈遞抗原極為有效。據信皮膚的朗氏細胞(Langerhans cells)代表一種能在攝入後呈遞抗原並轉移到局部淋巴結的樹狀細胞。因為認為大多數樹狀細胞不表達在巨噬細胞(例如FcyRI)上典型的Fc受體陣列，因此不能預知Fc融合蛋白的共定位效果是否包含這一APC系。
為驗證Flt-3L能否用作佐劑，將小鼠Fc-PSMA和小鼠Fc-FLt31而非小鼠Fc-GMCSF融合蛋白(巨噬細胞和粒細胞的有效刺激劑)注射成組的小鼠。在這種情況下，可以預期通過樹狀細胞的激活和攝入所介導任何佐劑效果，其最終導致針對PMSA的抗體應答。結果概括於圖6中。
這一研究表明小鼠Fc-Flt3L是能夠刺激抗-PSMA抗體的強有力的佐劑，即便不優於也至少等同於等量的Fc-GMCSF。這一結果支持了所觀察到的Fc-抗原和Fc-佐劑的結合可以特別有效地誘導免疫應答。這一結果還表明樹狀的APC顯然與巨噬APC一樣能被Fc-抗原和Fc-細胞因子靶定，這表明至少一種形式的Fc受體存在於這些細胞表面。
實施例6.對Fc-EpCAM和EpCAM-Fc融合蛋白的免疫應答用實施例1中的方法和質粒將另一種潛在的重要人癌抗原EpCAM(也稱為KSA和17-1 A抗原)與小鼠IgG2a Fc區域構建融合蛋白，單獨施用或與作為佐劑的Fc-GMCSF共同施用。小鼠通過皮下注射，並在3周後用含於PBS的10μg Fc-EpCAM 1μg Fc-GMCSF加強。對照小鼠不接受Fc-GMCSF。在加強後7天(圖7A)和14天(圖7B)後測定直接針對EpCAM的抗體滴度。該結果顯示當單獨使用Fc-EpCAM時，其是有效的免疫原(空心菱形)，而Fc-GMCSF可進一步增加對這一抗原的應答(閉合三角)。
此外，EpCAM抗原可以作為EpCAM-muFc(參見實施例1，圖1B)，即相對於Fc片段的反方向表達。將這一分子通過皮下注射免疫TBalb/c小鼠。使用了更高劑量的EpCAM-Fc融合蛋白用於(25μg每劑)，佐劑的量也得以增加(2.5μg Fc-GMCSF)。在免疫14天(圖8A)和21天(圖8B)後檢測針對的抗體滴度。不存在Fc-GMCSF(圖8A和8B，(空心菱形))下單獨的EpCAM-Fc蛋白是完全致免疫的。添加了The addition ofthe Fc-細胞因子後抗體滴度增加了3倍(圖8A和8B，(實心三角))。
為檢測對EpCAM的免疫應答能否防止哺乳動物中表達這一抗原的腫瘤細胞，對非免疫小鼠或那些由EpCAM-Fc融合蛋白(某些情況下是Fc-細胞因子)免疫的小鼠由尾靜脈注射105CT26由人EpCAM(Gillies等(1998)J.免疫學1606195)轉染的小鼠癌細胞克隆。21天後，將動物處死並通過通過下述方法估計肺轉移瘤的範圍(1)根據肺表面有效區進行腫瘤分類；(2)通過稱重和與正常動物肺的比較確定由於腫塊所導致的不同重量增加。結果概述於表1，其表明與對照小鼠相比所有的經免疫小鼠均表現出在統計學上顯著的腫瘤還原酶減小，包括單獨用EpCAM-Fc免疫的動物。用Fc-EpCAM作為抗原也出現類似的結果。
表1

用下列等級表示基於肺表面的肺有效區域的腫瘤還原酶值1＝1-25％有效區域；2＝26-50％有效區域；3＝51-75％有效區域；and 4＝76-100％有效區域。
實施例7.在單一的融合蛋白中抗原-Fc和細胞因子佐劑相結合實施例6中所描述的蛋白，EpCAM-Fc，是與作為羧基蛋白結構域的免疫球蛋白Fc區域相連接的N-末端抗原的示例。這一蛋白或與其它與之相似的蛋白與Fc-佐劑融合蛋白例如Fc-細胞因子共同施用以增加針對該抗原所產生免疫應答。另外，該抗原免疫球蛋白重鏈恆定區域和佐劑蛋白(例如細胞因子)可以作為單一的融合蛋白生產，例如EpCAM-Fc-GMCSF融合蛋白。
用小鼠IgG2a Fc和GM-CSF序列構建該蛋白的表達質粒以使該構建體能在小鼠模型中進行評價。將從原始的EpCAM-Fc表達載體(實施例1)獲得的包含前導-EpCAM-Fc編碼序列的Xba I到Sma I小片段連接到Fc-GMCSF表達載體(圖9)中的Sma I到Xba I大片段上。
用氯化鈣沉澱法將所得載體，pdCs-EpCAM-Fc-GMCSF，引入293細胞以瞬時表達，通過電穿孔法引入NS/0細胞以穩定表達。在含氨甲喋呤(0.1μM)的培養基中培養上述細胞以篩選穩定的轉染子。Fc通過ELISA(參見實施例1)驗證表達克隆並將高水平表達的產生菌在培養基上塗開。由條件培養基通過結合併洗脫自蛋白A Sepharose(Repligen，Needham，MA)對蛋白EpCAM-Fc-GMCSF進行純化，由SDS-PAGE分析其結構完整性，其後由2-巰基乙醇還原。結果顯示該蛋白分子量約為90kD，作為預期的EpCAM，Fc和GMCSF單鏈融合蛋白。
為比較所結合的融合蛋白的相對免疫原性，將等劑量的EpCAM-Fc-GMCSF和在組合EpCAM-Fc和Fc-GMCSF中單獨的融合蛋白以皮下的方式注射於小鼠。14天後進行同樣的注射，並在加強7天後檢測血清樣本中相對於人EpCAM的特異抗體的活性。相同的方法也可以用於其它蛋白或多肽抗原以及其它刺激細胞因子，例如IL-2，IL-12和Flt3L。
實施例8.用Fc-抗原通過DNA注射免疫用於在哺乳動物細胞中轉染和生產小鼠FcEpCAM和EpCAM-Fc的相同表達載體(參見實施例1)作為「裸」質粒DNA注射到Balb/c組小鼠的後腿肌肉中。所注射的DNA含於PBS或25％(w/v)的蔗糖溶液中，濃度為0.5mg/ml總量100μg。注射每3周重複一次共3次。在不同的時間檢測抗體應答並用ELISA定量，在該定量過程中用人Fc-EpCAM包被的96-孔板進行俘獲，用HRP-連接的抗小鼠Fc特異多克隆抗體進行檢測(Jackson免疫研究)。圖10中所列的數據代表注射後14天(圖10A)，27天(圖10B)，55天(圖10C)和69天(圖10D)所記錄的抗體滴度。
圖10所列的結果表明兩種方案在第一個月中所誘導出低滴度的抗-EpCAM抗體(圖10A和10B)。在第55天獲得很高的抗體滴度(圖10C)，而到第69天獲得更高的抗體滴度(圖10D)。用表達EpCAM-Fc的載體進行DNA注射也獲得相似的結果，但滴度略低。這些數據表明表達為含蛋白抗原和免疫球蛋白Fc區域的融合分子的抗原能誘導免疫應答，當通過注射裸DNA引入時，持續的抗原暴露導致在大多數動物中的應答延遲。
通過培養來自DNA疫苗注射或蛋白免疫(注射70天後)並由不同濃度的Fc-EpCAM蛋白體外刺激的的小鼠的脾細胞以檢測細胞免疫應答。如圖11所示的數據(頂欄)表明對用Fc-EpCAM(十叉)蛋白免疫的或用CMV啟動子-EpCAM-Fc(空心圓圈)或CMV啟動子-Fc-EpCAM(閉合菱形)表達載體進行DNA疫苗注射所免疫的動物中的抗原的增殖應答(通過摻入3H-胸腺嘧啶檢測)。即便在很低的劑量下，該蛋白免疫的動物表現出對該抗原更強的免疫應答。DNA接種免疫的動物的免疫應答(也在圖11的底欄中不同部分示出)是劑量依賴的但在數量上低於蛋白注射的小鼠。這些應答以MHC II類限定的CD4+T細胞應答為特徵。
為檢測細胞毒性活性(一般表示MHC I類限定的T細胞應答)，將DNA或蛋白免疫的小鼠脾細胞培養物在約10U/ml IL-2存在下培養5天。效應細胞是所培養的脾細胞，靶細胞是標記的人EpCAM-表達CT26克隆癌細胞(Balb/c同系小鼠)或標記的親代的(非轉染的CT26細胞)。效應細胞和靶細胞以不同的比例混合，測定裂解的程度。在去汙劑存在下培養標記靶細胞可達到100％的裂解值，所釋放的標記物的量...檢測。
結果如圖12所示，其中圖12A表示抗表達人EpCAM的CT26細胞的脾細胞活性，圖12B表示抗親代CT26細胞的脾細胞活性。在兩幅圖中，空心的菱形代表從用帶有Fc-EpCAM構建體的DNA免疫的小鼠分離的脾細胞，空心的三角代表從用帶有EpCAM-Fc構建體的DNA免疫的小鼠分離的脾細胞，十叉代表從用Fc-EpCAM融合蛋白免疫的小鼠分離的脾細胞。
圖12說明儘管DNA疫苗注射產生針對兩種靶細胞弱的細胞毒性應答，在蛋白免疫的小鼠中可見顯著提高的細胞毒性。親代CT26腫瘤細胞和表達EpCAM的CT26腫瘤細胞在分析中均被殺死。所觀察到的針對親代CT26細胞的細胞毒性可能是因為這些細胞表達高水平的小鼠EpCAM同系物，該同系物與相應人源蛋白在胺基酸水平上具有81％的同一性。
然而，Fc-EpCAM蛋白免疫的確產生針對表達人EpCAM的CT26腫瘤細胞顯著的細胞毒性活性，由此解釋了實施例6中描述的腫瘤防禦活性。
實施例9.用包含蛋白癌抗原亞區域的Fc-融合蛋白的免疫。
儘管一些完全蛋白不用作免疫治療的抗原，其中一些小的蛋白亞區域卻可能十分有效。例如蛋白可以包括經翻譯後修飾的結構域使其免疫原性降低，由此減少實際的多肽組分的免疫活性。大蛋白可以誘導僅與抗原的非肽部分起反應的抗體，不介導抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)，即抗腫瘤免疫應答的潛在重要組分。人黑素瘤-特異的軟骨素硫酸酯蛋白多糖(MCSP)抗原是這種情況的一個很好的示例，其可在所有的黑素瘤和幾種類型的腦癌中表達。該蛋白高度糖基化並通過附加及條糖胺聚糖鏈得以進一步修飾。已知的抗體9.2.27(Bumol等(1982)美國國家科學院彙編791245-1249)，以高度親和性與這一蛋白相結合，但不介導任何效應子功能，ADCC或補體介導的細胞毒性(CDC)。甚至這種抗體的部分人源化(嵌合的)的形式也不能介導這一活性。
為了在這一大分子更理想的靶區域引起更集中的應答，驗證了該蛋白序列中的推定的聚糖附加位點。(Pluske等(1996)美國國家科學院彙編939710-9715)。篩選出了距細胞表面的跨膜序列不遠的亞區域和一些距聚糖結合位點很遠的序列。
肽序列如下QGATLRLDPTVLDAGELANRTGSVPRFRLLEGRHGRVVRVPRARTEPGGSQLVEQFTQQDLEDGRLGLEVGRPEGRAPGPAGD(SEQ ID NO21)是反向翻譯的，所得的DNA序列以化學方式合成，用與上述實施例中相同的酶切位點連接到pdCs-Fc-X表達載體中。將翻譯終止位點加到3』端編碼最後一個胺基酸的序列後，其後緊接著一個唯一的Xho I位點。最終的表達質粒以電穿孔的方式轉化到NS/0骨髓瘤細胞中，表達所需蛋白穩定的轉染子按實施例1中描述的方法獲得。
用蛋白A Sepharose層析(Repligen，Needham，MA)從培養物的上清液中純化Fc-MCSP蛋白。在以皮下方式將含於PBS中的50μg Fc-MCSP融合蛋白單獨或與5μg Fc-GMCSF佐劑相結合注射所免疫的Balb/c小鼠中以檢測抗體滴度。結果如圖13所示。實心的菱形代表正常血清中的抗體滴度，空心的方塊代表用Fc-MCSP免疫的小鼠血清中的抗體滴度，實心的三角代表用Fc-MCSP和佐劑Fc-GMCSF免疫的小鼠血清中的抗體滴度。
在第14天檢測到對這一MCSP的亞區域的特定免疫反應，以及在加強免疫後明顯升高。這一結果表明與單獨用Fc-MCSP(空心三角)免疫小鼠相比用Fc-GMCSF和Fc-MCSP免疫的小鼠刺激產生針對MCSP(實心三角)較高的抗體滴度。
實施例10.用含病毒抗原的Fc-融合蛋白進行免疫開發針對引起AIDS的人免疫缺陷病毒(HIV)的有效疫苗是疫苗研究的一個重要目標。最近，有幾篇報導顯示該病毒包膜的特定性質是在無關的表位引起免疫應答，由此屏蔽病毒顆粒重要的和潛在的中和區域。這些包括存在作為捕獲器的高度優勢免疫抗原性區域和廣泛的糖基化從而完全屏蔽和還原重要的表位的免疫原性(Wyatt等(1998)自然393705-11)。
一種可能的包圍該捕獲器的機制是表達病毒包膜基因的小區域以避免不予保護的優勢免疫應答並誘導中和應答。小亞單位疫苗的一個問題是還原的免疫原性或者作為合成肽或者是一小蛋白。一個方法已將該蛋白或肽結合到致免疫的載體蛋白例如匙孔嘁血藍蛋白(KLH)上。也由於該蛋白和多肽誘導對KLH的強免疫應答。另一方法是將Fc與如實施例1中所描述的例如gp41(病毒包膜錨定結構域gp 160)的外結構域的亞區域構成融合蛋白。與其它載體不同，該免疫球蛋白區域被視為「自身」由此將優勢免疫效果降到最低。
The Fc-gp41pep626融合構建體包括一融合於小鼠免疫球蛋白Fc區域的含44個胺基酸的多肽。HIV菌株IIIB在這一區域的序列包括N-連接糖基化信號，因此由293細胞通過瞬間表達或由NS/0骨髓瘤細胞通過穩定轉染所產生的Fcgp41pep626融合蛋白表現出在SDS-PAGE分析時遷移率的高度變化，由此說明糖基化程度的不均一性。
儘管這一病毒抗原很小(44胺基酸殘基)且是異源糖基化但可能在Balb/c小鼠(參見圖14)中引發免疫應答。此種情況下，以5隻小鼠為一組第一天以牙內地方式注射25μg Fc-gp41pep626，並在兩周期間再注射兩次，或單獨(空心菱形)或與25μg Fc-佐劑融合蛋白Fc-GMCSF(空心方塊)或Fc-IL2(實心三角)共同施用。圖14A和14B分別代表在第二次加強後7天和33天的抗體滴度。
該免疫應答更依賴於與Fc-細胞因子共同施用，花費較長時間以獲得高抗體滴度。可以理解用修飾這一不含糖基化信號的序列(事實上，許多菌株並不編碼這一位點)或通過酶學方法在體外去除糖鏈可以引發強免疫應答。
實施例11Fc-融合體的佐劑活性包含細胞表面分子胞外結構域的蛋白為構建Fc-佐劑融合蛋白，有時可以將Fc與膜結合蛋白胞外結構域相融合。例如CD40配體(CD40L)在N末端與Fc的C末端相融合。可選擇使用接頭。
CD40L是有用的因為其受體CD40，在B表面表達，而且起包括在由T細胞對B細胞的刺激過程中。類似於腫瘤壞死因子，CD40L是三聚體其可引起在細胞表面其受體的二聚體化或三聚體化。結果細胞間的受體結構域產生接觸和信號轉導。與TNF一樣，CD40L可能是膜結合的但也可能從細胞表面切除，類似於細胞因子的功能。
Fc-CD40L融合蛋白與Fc-抗原融合蛋白共同施用於動物。在對照實驗中，該Fc-CD40L蛋白和該Fc-抗原蛋白施用於不同組的動物。可以理解注射了兩種融合蛋白的動物比單獨施用一種融合蛋白的動物產生高的抗體滴度。
另外，單一的包含抗原和CD40L組分的Fc融合蛋白組分與可選擇的與位於Fc，CD40L，和抗原組分之間的接頭共同使用。該融合蛋白可能是N-末端到C-末端方向的Fc-(L)-抗原-(L)-CD40L，FC-(L)-CD40L-(L)-抗原，抗原)L)-CD40L-(L)-Fc，CD40L-(L)-抗原-(L)-Fc，抗原-(L)-Fc-(L)-CD40L，或CD40L-Fc-(L)-抗原-(L)。該包括Fc，抗原，和CD40L的融合蛋白注射到動物中並測定抗體滴度。將融合蛋白與CD40L和抗原共同注射小鼠所產生的抗體滴度比單獨注射僅包括Fc和抗原、或Fc和CD40L的融合蛋白所產生的抗體滴度高。
根據上述施用融合蛋白，可以通過靜脈，皮下或其它合適的方式注射動物。首次和加強施用抗體和/或佐劑免疫之間的時間以及測定抗體滴度的方法如前面的實施例所述。
可選擇的可以使用標準的劑量和分析策略。
等同聲明在不背離本發明的本質或基本特徵的前提下，本發明還包括其他特定的形式。上述的實施例可從各方面解釋本發明但並不作為對本發明的限定。本發明的範圍由附加的權利要求來界定，並非根據上述描述限定，但在與權利要求等同的含義和範圍內的所有變化均應視為包括在本發明的範圍內。
參考文獻上述的所有專利文獻和科學出版物的教導均包含於此作為參考。
序列表110S.D.吉利斯(Gillies，Stephen D.)勞健明(Lo，Kin-Ming)J.S.小維索洛夫斯基(Wesolowski，John)利思進藥品公司(Lexigen Pharmaceuticals Corp.)120增強蛋白和肽抗原免疫原性的Fc融合蛋白130LEX-007PC140141150US 60/144,9651511999-07-2116022170PatentIn Ver.2.0210121128212DNA213人工序列220223人工序列說明IL-4R引物4001gtcccgggta tgaaggtctt gcaggagc 28210221134212DNA213人工序列220223人工序列說明IL-4R引物4002cccctcgagc tagtgctgct cgaagggctc cctg 34210321123212DNA213人工序列220223人工序列說明PSMA引物4003aagcttaaat cctccaatga agc 23210421126212DNA213人工序列220223人工序列說明PSMA引物4004ctcgagttag gctacttcac tcaaag 26210521130212DNA213人工序列220223人工序列說明EpCAM引物4005ccccgggtaa acaggaagaa tgtgtctgtg 30210621128212DNA213人工序列220223人工序列說明EpCAM引物4006ctcgagtcat tttagaccct gcattgag 28210721124212DNA213人工序列220223人工序列說明EpCAM引物4007tctagagcag catggcgccc ccgc 24210821128212DNA213人工序列220223人工序列說明EpCAM引物4008ccttaagcac cctgcattga gaattcag 282109211148212DNA213人工序列220223人工序列說明編碼HIV IIIB gp41的胺基酸殘基626-669的DNA4009cccgggatcc ctgatccact ccctgatcga ggaatcccag aaccagcaag agaagaacga 60gcaggagctg ctggagctcg acaagtgggc ctccctgtgg aactggttca acatcaccaa 120ttggctgtgg tacatcaagt gactcgag1482101021144212PRT213人工序列220223人工序列說明來自pdC-muFC載體的融合多肽40010Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys1 5 10 15Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn20 25 30Trp Phe Asn Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys35 402101121130212DNA213人工序列220223人工序列說明小鼠IL2引物40011ggcccgggta aagcacccac ttcaagctcc 302101221125212DNA213人工序列220223人工序列說明小鼠IL2引物40012ccctcgagtt attgagggct tgttg252101321128212DNA213人工序列220223人工序列說明小鼠GMCSF引物40013cccgggaaaa gcacccgccc gctcaccc 282101421129212DNA213人工序列220223人工序列說明小鼠GMCSF引物40014ctcgagtcat ttttggcttg gttttttgc 292101521128212DNA213人工序列220223人工序列說明小鼠Flt3配基引物40015caagcttaca cctgactgtt acttcagc 282101621130212DNA213人工序列220223人工序列說明小鼠Flt3配基引物40016ctcgagtcaa ggctctggga gctccgtggc 302101721128212DNA213人工序列220223人工序列說明小鼠IL-12p35引物40017ccccgggtag ggtcattcca gtctctgg 282101821126212DNA213人工序列220223人工序列說明小鼠IL-12p35引物40018ctcgagtcag gcggagctca gatagc262101921128212DNA213人工序列220223人工序列說明小鼠IL12 p40引物40019tctagaccat gtgtcctcag aagctaac 282102021125212DNA213人工序列220223人工序列說明小鼠IL12 p40引物40020ctcgagctag gatcggaccc tgcag 252102121183212PRT213人工序列220223人工序列說明MSCP肽40021Gln Gly Ala Thr Leu Arg Leu Asp Pro Thr Val Leu Asp Ala Gly Glu1 5 10 15Leu Ala Asn Arg Thr Gly Ser Val Pro Arg Phe Arg Leu Leu Glu Gly20 25 30Arg His Gly Arg Val Val Arg Val Pro Arg Ala Arg Thr Glu Pro Gly35 40 45Gly Ser Gln Leu Val Glu Gln Phe Thr Gln Gln Asp Leu Glu Asp Gly50 55 60Arg Leu Gly Leu Glu Val Gly Arg Pro Glu Gly Arg Ala Pro Gly Pro65 70 75 80Ala Gly Asp2102221120212DNA213人工序列220223人工序列說明可用作佐劑的寡聚脫氧核苷酸40022tccatgacgt tcctgacgtt 20
權利要求
1.一種在哺乳動物中增強預選抗原免疫原性的方法，該方法包括將一種包括通過多肽鍵連接到預選抗原上的免疫球蛋白重鏈恆定區的融合蛋白以肌內地，靜脈內地，經皮地或皮下地方式施用於哺乳動物，由此引發針對預選抗原的免疫應答，與單獨的預選抗原相比，融合蛋白中的預選抗原在哺乳動物中引起更強的免疫應答。
2.如權利要求1的方法，進一步包括將融合蛋白與佐劑結合使用，相對於不加佐劑時針對所施用的融合蛋白中的預選抗原所引起的免疫應答而言，該佐劑的用量足以增強針對融合蛋白中的預選抗原的免疫應答。
3.如權利要求2所述的方法，其中，融合蛋白和佐劑同時施用。
4.如權利要求2所述方法，其中，所述佐劑包括一種融合蛋白，該融合蛋白包含通過多肽鍵與佐劑蛋白相連接的免疫球蛋白重鏈恆定區。
5.權利要求1或4的方法，其中免疫球蛋白重鏈恆定區包括免疫球蛋白鉸鏈區。
6.權利要求5的方法，其中的免疫球蛋白重鏈恆定區包含選自以下的免疫球蛋白重鏈恆定區結構域CH2結構域，CH3結構域，和CH4結構域。
7.如權利要求5的方法，其中的免疫球蛋白重鏈恆定區包括CH2結構域和CH3結構域。
8.權利要求1或4的方法，其中免疫球蛋白重鏈恆定區由胺基酸序列定義，該胺基酸序列對應於定義存在於同種哺乳動物中的免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸序列。
9.如權利要求8所述的方法，其中定義免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸序列對應於人免疫球蛋白重鏈恆定區。
10.如權利要求1所述的方法，其中的預選抗原選自前列腺特異的膜抗原，細胞因子受體胞外結構域，病毒蛋白和腫瘤特異性蛋白。
11.如權利要求4的方法，其中的佐劑蛋白是細胞因子。
12.如權利要求11的方法，其中的細胞因子由胺基酸序列定義，該胺基酸序列對應於定義存在於同種哺乳動物中的細胞因子的胺基酸序列。
13.如權利要求12的方法，其中的細胞因子是人細胞因子。
14.如權利要求1的方法，其中的哺乳動物是人。
15.一種在哺乳動物中引發針對預選抗原的免疫應答的組合物，該組合物包含選自以下的以肌內地，靜脈內地，經皮地或皮下的方式施用的混合物(a)一種與佐劑相混合的抗原融合蛋白，該蛋白包含通過多肽鍵連接到預選抗原上的免疫球蛋白重鏈恆定區；和(b)與佐劑融合蛋白相混合的預選抗原，該佐劑融合蛋白包含通過多肽鍵連接到佐劑蛋白上的免疫球蛋白重鏈恆定區。
16.如權利要求15所述的組合物，其中(a)款中的佐劑包含一種融合蛋白，該融合蛋白包含通過多肽鍵連接到佐劑蛋白上的免疫球蛋白重鏈恆定區。
17.如權利要求15所述的組合物，其中(b)款中的預選抗原通過多肽鍵與免疫球蛋白重鏈恆定區相連接。
18.權利要求15，16或17所述的組合物，其中的免疫球蛋白重鏈恆定區包含免疫球蛋白鉸鏈區。
19.如權利要求18所述的組合物，其中的免疫球蛋白重鏈恆定區包含選自以下的免疫球蛋白重鏈恆定區結構域CH2結構域，CH3結構域，和CH4結構域。
20.如權利要求18的組合物，其中的免疫球蛋白重鏈恆定區包括CH2結構域和CH3結構域。
21.如權利要求15的組合物，其中(a)款中的佐劑包含CpG寡核苷酸序列。
22.如權利要求15的組合物，其中的預選抗原選自前列腺特異的膜抗原，細胞因子受體的胞外結構域，病毒蛋白和腫瘤特異性蛋白。
23.如權利要求15的組合物，其中(a)款中的抗原融合蛋白或(b)款中的佐劑融合蛋白通過二硫鍵與第二種免疫球蛋白重鏈恆定區相連接。
24.如權利要求15的組合物，其中(a)款中的佐劑或(b)款中的佐劑蛋白是細胞因子。
25.如權利要求24的組合物，其中的細胞因子是人細胞因子。
26.如權利要求15，16或17的組合物，其中的免疫球蛋白重鏈恆定區由與定義人免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸序列相應的胺基酸序列來定義。
27.一種在哺乳動物中增強預選抗原免疫原性的方法，該方法包括將一種編碼融合蛋白的核酸序列施用於哺乳動物，該融合蛋白包含連接到預選抗原上的免疫球蛋白重鏈恆定區，上述核酸序列在哺乳動物中表達即產生上述融合蛋白，與編碼該預選抗原的核酸序列表達的單獨預選抗原相比，該融合蛋白中的預選抗原引發更強免疫應答。
28.如權利要求27所述的方法，其中的核酸序列沿5』到3』的方向編碼免疫球蛋白重鏈恆定區和預選抗原。
29.如權利要求28所述的方法，其中的免疫球蛋白重鏈恆定區包含免疫球蛋白鉸鏈區。
30.如權利要求27或29所述的方法，其中的免疫球蛋白重鏈恆定區包含選自以下的免疫球蛋白重鏈結構域CH2結構域，CH3結構域，和CH4結構域。
31.如權利要求29所述的方法，其中的免疫球蛋白重鏈恆定區包括CH2結構域和CH3結構域。
32.如權利要求27所述的方法，其中的預選抗原選自前列腺特異的膜抗原，細胞因子受體的胞外結構域，病毒蛋白和腫瘤特異性蛋白。
33.如權利要求27所述的組合物，進一步包括該核酸序列與一種佐劑結合施用。
34.如權利要求33所述的方法，其中的佐劑包括一種編碼融合蛋白的核酸序列，上述融合蛋白包含和佐劑蛋白相連接的免疫球蛋白重鏈恆定區。
35.一種在哺乳動物中引發針對預選抗原的免疫應答的組合物，該組合物包括(a)編碼包含免疫球蛋白重鏈恆定區和預選抗原的融合蛋白的第一核酸序列，該核酸序列在哺乳動物中表達即產生上述融合蛋白，與編碼該預選抗原的核酸序列表達的單獨預選抗原相比，融合蛋白中的預選抗原引發更強免疫應答，(b)一種佐劑。
36.如權利要求35所述的組合物，其中的佐劑包括編碼一種融合蛋白的第二核酸序列，該融合蛋白包含通過肽鍵和佐劑蛋白相連接的免疫球蛋白重鏈恆定區。
37.如權利要求35或36所述的組合物，其中的免疫球蛋白重鏈恆定區包含免疫球蛋白鉸鏈區。
38.如權利要求35或36所述的組合物，其中的免疫球蛋白重鏈恆定區包含選自以下的免疫球蛋白重鏈結構域CH2結構域，CH3結構域，和CH4結構域。
39.如權利要求37所述的組合物，其中的免疫球蛋白重鏈恆定區包含選自以下的免疫球蛋白重鏈結構域CH2結構域，CH3結構域，和CH4結構域。
40.如權利要求35所述的組合物，其中的預選抗原選自前列腺特異的膜抗原，細胞因子受體的胞外結構域，病毒蛋白和癌特異性蛋白。
41.如權利要求36所述的組合物，其中的佐劑蛋白是細胞因子。
42.如權利要求35所述的組合物，其中的第一核酸序列以可操作的方式在可複製的表達載體內處理。
43.如權利要求36所述的組合物，其中的第二核酸序列以可操作的方式位於可複製的表達載體內。
44.一種在哺乳動物中增強預選抗原免疫原性的方法，該方法包括對一種哺乳動物同時或依次地施用包含抗原蛋白及定位蛋白的第一融合蛋白，和包含一種佐劑蛋白和上述定位蛋白的第二融合蛋白，所述的定位蛋白可在易受免疫系統影響的區域使第一和第二融合蛋白濃度提高。
45.一種在哺乳動物中增強預選抗原免疫原性的方法，該方法包括對哺乳動物施用包括一種抗原蛋白，一種佐劑蛋白和一種定位蛋白的融合蛋白，所述的定位蛋白可在易受免疫系統影響的區域使上述抗原和佐劑蛋白濃度提高。
全文摘要
本發明公開了在哺乳動物中增強預選蛋白或肽抗原免疫原性的組合物和方法。通過將預選抗原與免疫球蛋白重鏈恆定區相融合製備Fc－抗原融合蛋白以增強免疫原性。Fc－抗原融合蛋白與抗原呈遞細胞表面的Fc受體結合,由此將該抗原靶向哺乳動物中的抗原呈遞細胞。另外,還公開了佐劑家族,例如Fc－佐劑融合蛋白,其與Fc－抗原融合蛋白結合使用以增強或調節針對預選抗原的特定免疫應答。
文檔編號C07K14/705GK1374871SQ00813170
公開日2002年10月16日 申請日期2000年7月21日 優先權日1999年7月21日
發明者S·D·吉利斯, 勞健明, J·S·小維索洛夫斯基 申請人:利思進藥品公司