一種豬細小病毒檢測試劑盒及其應用的製作方法

2023-09-19 02:27:50 1

專利名稱：一種豬細小病毒檢測試劑盒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種豬細小病毒檢測試劑盒及其應用。
背景技術：
豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起豬繁殖障礙的重要病原體之一，主 要表現為母豬流產、不孕、產死胎、木乃伊胎及弱子等特徵，此外PPV還與非化膿性心肌炎、 皮炎、腸炎及病毒血症等有關，PPV能加重豬圓環病毒(Porcine circovirus, PCV)引起的 斷奶仔豬多系統衰竭症候群(PMWS)。近年來，隨著養豬業的發展，大型集約化豬場的相繼出 現，該病的發生呈上升趨勢，給養豬業造成巨大的經濟損失，嚴重影響養豬業的發展。1966年Mary和Mahnel首次於豬瘟病毒組織中分離到該病毒並證實了其病原作 用。此後在歐、美、亞、非及大洋洲很多國家均有報導。我國於1982年由中國獸藥監察所分 離到該病毒，此後在上海、黑龍江、吉林、四川、浙江等地均分離到該病毒，雖然各地分離的 PPV來源不同，名稱各異，但均為同一型，血清學上無差別。隨著研究的深入，國內外眾多的 科研工作者已從多方面對此病毒進行了不同層次的研究。目前，PPV的診斷方法主要有病原學診斷方法、血清學診斷方法、分子生物學診 斷方法。病原學診斷方法是PPV最確切的一種實驗室診斷方法，但從流產胎兒組織接種細 胞分離病原操作複雜、耗時耗力。血清學診斷方法主要包括血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗 (HI)、血清中和試驗(SN)、間接螢光抗體試驗(IFA)和酶聯免疫吸附試驗作(ELLISA)。血 清學試驗相對簡單，但是其靈敏性較低，易出現非特異反應，在感染初期，由於低水平抗體 效價的影響，尤其是對隱性感染動物往往漏檢，從而造成了本病的流行和蔓延。分子生物學 診斷方法主要是各種PCR技術和核酸探針雜交，這些方法具有高特異性和高靈敏度，引物 與探針可以大量合成並長期保存，檢測速度快、結果可靠，避免散毒等優點，在畜禽傳染病 的檢測、鑑別診斷方面已得到了廣泛應用。但PCR技術也存在其缺陷，最主要的問題是成本 較高，技術性較強，操作煩瑣，設備昂貴，樣品檢測費用較高，故不適合於基層診斷和大規模 流行病學調查。

發明內容
本發明的目的是提供一種豬細小病毒檢測試劑盒及其應用。本發明提供的試劑盒 基於環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術，可以快速 檢測豬細小病毒。本發明提供了檢測豬細小病毒的專用引物，由以下三對環介導等溫擴增所用引物 組成；一對引物是與豬細小病毒的基因組DNA (GenBank Accession Number NC-001718)中 NSl基因結合的內側引物對，一對引物是與豬細小病毒的基因組DNA (GenBankAccession Number NC-001718)中NSl基因結合的外側引物對，一對引物是與豬細小病毒的基因組 DNA(GenBank Accession Number NC-001718)中 NSl 基因結合的環形引物對。NSl 基因為 PPV全基因組中編碼非結構蛋白1的基因，如GenBank AccessionNumber NC-001718中自5，末端第292至2280位核苷酸所示。所述專用引物的靶序列具體可為豬細小病毒的基因組DNA (GenBank AccessionNumber NC-001718)中NSl基因的部分區域，該部分區域的核苷酸序列如序列表 的序列1所示。所述內側引物對由上遊引物FIP和下遊引物BIP組成，所述上遊引物FIP的核苷 酸序列具體可為序列表中的序列4，所述下遊引物BIP的核苷酸序列具體可為序列表中的 序列5 ；所述外側引物對由上遊引物F3和下遊引物B3組成，所述上遊引物F3的核苷酸序 列具體可為序列表中的序列2，所述下遊引物B3的核苷酸序列具體可為序列表中的序列3 ； 所述環形引物對由上遊引物LF和下遊引物LB組成，所述上遊引物LF的核苷酸序列具體可 為序列表中的序列6，所述下遊引物LB的核苷酸序列具體可為序列表中的序列7。F3 :5，-CAAGCAACAATGGCTAGCTATATG-3，(序列表的序列 2)；B3 5' -GTTGGTGTTGTTGGCTCGC-3『(序列表的序列 3)；FIP :5，-GTATTTATTGGGGTTTGCATTTTTTTATCATTGGGGAAATGTACCTGAT-3，(序列表的 序列4)；BIP 5，-ACATCAGTGAAAACTTCGCCAGCTTTTGCTAAATCCAGGTCCTCCTGT-3，(序列表的 序列5)；LF :5，-GCTCCTCCCATTTTTCTGAC-3，(序列表的序列 6)；LB :5，-ACAACAACTACGCAGCAACTC-3，(序列表的序列 7)。應用所述專用引物檢測豬細小病毒的原理如下根據豬細小病毒的基因組DNA (GenBank Accession Number NC-001718)中 NSl 基 因的部分區域(GenBank Accession Number NC-001718 自 5』末端第 1918-2144 位核苷酸； 序列表的序列1)設計一組用於環介導等溫擴增的引物，即內側引物對(內側上遊引物FIP 和內側下遊引物BIP)、外側引物對(外側上遊引物F3和外側下遊引物B3)和環形引物對 (環形上遊引物LF和環形下遊引物LB)。三對引物和所述區域變異區域的八個特定區域的 序列完全配對(見表1)，可以確保反應的徹底進行，也保證了檢測方法的特異性。表1專用引物與豬細小病毒的基因組DNA的結合區域
權利要求
1.一種檢測豬細小病毒的專用引物，由以下三對環介導等溫擴增所用引物組成；一對 引物是與豬細小病毒的基因組DNA中NSl基因結合的內側引物對，一對引物是與豬細小病 毒的基因組DNA中NSl基因結合的外側引物對，一對引物是與豬細小病毒的基因組DNA中 NSl基因結合的環形引物對；所述NSl基因如GenBank Accession NumberNC-OO 1718中自 5，末端第292至2280位核苷酸所示。
2.如權利要求1所述的專用引物，其特徵在於所述內側引物對由上遊引物FIP和下 遊引物BIP組成，所述上遊引物FIP的核苷酸序列是序列表中的序列4，所述下遊引物BIP 的核苷酸序列是序列表中的序列5;所述外側引物對由上遊引物F3和下遊引物B3組成，所 述上遊引物F3的核苷酸序列是序列表中的序列2，所述下遊引物B3的核苷酸序列是序列表 中的序列3 ；所述環形引物對由上遊引物LF和下遊引物LB組成，所述上遊引物LF的核苷 酸序列是序列表中的序列6，所述下遊引物LB的核苷酸序列是序列表中的序列7。
3.權利要求1或2所述的專用引物在製備試劑盒中的應用；所述試劑盒用於檢測待測 樣本中是否含有豬細小病毒和/或輔助鑑定豬細小病毒。
4.一種含有權利要求1或2所述的專用引物的試劑盒；所述試劑盒用於檢測待測樣本 中是否含有豬細小病毒和/或輔助鑑定豬細小病毒。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包括溶液B；所述溶液B由溶 劑和溶質組成；所述溶劑為水；所述溶質及其濃度如下所述上遊引物F3為2. 4-3. 6pmol/ μ 1，所述下遊引物Β3為2. 4-3. 6pmol/μ 1，所述上遊引物FIP為20-28pmol/μ 1，所述下 遊引物BIP為20-28pmol/ μ 1，所述上遊引物LF為IO-Hpmol/ μ 1，所述下遊引物LB為 10-14pmol/y 1。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於所述溶液B中，所述上遊引物F3為3pmol/ μ 1，所述下遊引物Β3為3ρπι01/μ 1，所述上遊引物FIP為24ρπι01/μ 1，所述下遊引物BIP 為24ρπι01/μ 1，所述上遊引物LF為12pm0l/l·! 1，所述下遊引物LB為12pmol/y L·
7.如權利要求4或5或6所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒還包括溶液A；所述 溶液A由溶劑和溶質組成；所述溶劑為水；所述溶質及其濃度如下KC1為16. 67nmol/yl, MgSO4 · 7H20 為 13. 33nmol/y 1，(NH4)2SO4 為 16. 67nmol/y 1，鈣黃綠素為 0. 083nmol/y 1， MnCl2 · 4H20 為 lnmol/μ 1，四種脫氧核苷酸各 2. 33hmol/y 1，甜菜鹼為 0. 33ymol/y 1，IM pH8. 8Tris-HCl 為 33· 33nmol/y 1，Tween-20 為 0. (體積百分含量)，Bst DNA 聚合酶 為 0. 8υ/μ 1。
8.—種檢測來自死亡動物的樣品中是否攜帶豬細小病毒的方法，是用權利要求1或 2所述專用引物對來自死亡動物的樣品的總DNA進行環介導等溫擴增反應，檢測擴增產 物，確定來自死亡動物的樣品中是否攜帶豬細小病毒；所述環介導等溫擴增反應的條件為 60-65 °C、30-90min。
9.權利要求1或2所述專用引物或權利要求4至7中任一所述試劑盒在檢測待測樣本 中是否含有豬細小病毒中的應用。
10.權利要求1或2所述專用引物或權利要求4至7中任一所述試劑盒在輔助鑑定豬 細小病毒中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種豬細小病毒檢測試劑盒及其應用。本發明提供的試劑盒，包括三對引物，即與豬細小病毒的基因組DNA(GenBank Accession Number NC-001718)中NS1基因結合的內側引物對、外側引物對和環形引物對。本發明的豬細小病毒檢測試劑盒，檢測靈敏度高，最低可檢測出10個拷貝的靶DNA，操作簡單方便，特別適於基層現場進行的臨床醫學檢測及食品中可能汙染的豬細小病毒的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102002539SQ201010561158
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月23日 優先權日2010年11月23日
發明者吳文學, 李佳禾, 黃書林 申請人:中國農業大學