一類在人類肝臟中表達的表達序列標籤的製作方法

2023-09-19 02:33:15 2

專利名稱：一類在人類肝臟中表達的表達序列標籤的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一類在人類肝臟中表達的表達序列標籤。
背景技術：
肝臟是人體內最大的消化腺。也是體內新陳代謝的中心站。據估計，在肝臟中發生的化學反應有500種以上，實驗證明，動物在完全摘除肝臟後即使給予相應的治療，最多也只能生存50多個小時。這說明肝臟是維持生命活動的一個必不可少的重要器官。肝臟的血流量極為豐富，約佔心輸出量的1/4。每分鐘進入肝臟的血流量為1000-1200ml。肝臟的主要功能是進行糖的分解、貯存糖原；參與蛋白質、脂肪、維生素、激素的代謝；解毒；分泌膽汁；吞噬、防禦機能；製造凝血因子；調節血容量及水電解質平衡；產生熱量等。在胚胎時期肝臟還有造血功能。
肝臟疫病分為肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌等。現代醫學實驗證明，肝病病毒侵入人體後，並不直接引起肝細胞的損害，只是在肝細胞內吸收營養賴以生存，並在肝細胞內複製、繁殖。其複製病毒的「零部件」如表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)釋放在肝細胞膜上，引起人體免疫系統對這些抗原物質產生免疫反應，這種反應造成肝細胞的損傷、壞死。免疫反應的強弱決定於肝臟受損程度及臨床症狀輕重。這場由病毒引發的、免疫系統對肝細胞的戰爭，使大約25％的患者的肝臟成為戰火連綿的戰場，肝臟的損傷由此加重。肝病的危害絕不僅僅限於肝臟本身，它還可以引起其它多種疾病。常見的有(1)糖尿病；(2)胰腺炎；(3)膽道感染；(4)功能性腎衰竭；(5)膽汗性腎病；(6)腎小球腎炎；(7)腎小管酸中毒；(8)溶血性貧血；(9)再生障礙性貧血；(10)心肌炎和心包炎；(11)結節性動脈炎；(12)消化性潰瘍；(13)自發性腹膜炎；(14)性激素代謝紊亂；(15)甲狀腺功能改變；(16)肝性骨病，等等。肝病不僅對患者的身體甚至生命造成危害，而且對患者心理上的打擊也是十分沉重的。無論是肝病患者還是病毒攜帶者，在生活、社交、求職、升學等方面都會受到嚴重影響。
生物基因組中可轉錄表達的序列(即基因)僅佔總序列的3-5％，對這部分序列進行測定，將直接導致新基因的發現，並獲取基因組中與產業化關係最為密切的信息。20世紀80年代，高通量的自動測序的出現，使從質粒互補脫氧核糖核酸(Complementary DNA，簡稱cDNA)文庫隨機選取許多cDNA克隆和決定來自非載體兩端的幾百個鹼基的DNA序列成為可能。這些短的DNA序列叫做「表達序列標籤」(Expressed Sequence Tags，簡稱ESTs)。表達序列標籤的概念最早是由Adams等在1992年提出來的(Nature，355，642-644)。1992年Sikela和Matsubara(Sikela，et al.Nucleic AcidsRes.19，1837-1843；Matsubara，et al.Nature Genetics，2，173-179)針對獲得大量信使核糖核酸(mRNA)序列的迫切需要，提出大規模互補脫氧核糖核酸(cDNA)測序的研究戰略。隨後Venter創立了大規模表達序列標籤技術。其基本特徵就是從以質粒為載體，構建完成的目的組織互補脫氧核糖核酸(Complementary DNA，簡稱cDNA)文庫中，隨機選擇許多cDNA克隆，利用質粒上攜帶的通用引物對cDNA兩端進行一輪脫氧核糖核酸序列測定，所獲得的來自3』端或5』端的幾百個鹼基的非載體短脫氧核糖核酸(DNA)序列。簡而言之，表達序列標籤是來自表達基因片段3』端或5』端的短脫氧核糖核酸序列，代表一個表達基因的部分轉錄片段。
表達序列標籤可用於新基因克隆、人類基因組圖譜繪製、基因組序列編碼區的確定等。如果一個表達序列標籤在基因組中只出現一次，那麼它可以作為序列標籤位點(STS)。由表達序列標籤構建的物理圖譜叫表達圖或轉錄圖(expression or transcript map)。利用表達序列標籤進行基因圖製作，可以加快序列標籤位點的製作和新基因的染色體定位。表達序列標籤可以作為基因特異性探針，對組織特異性基因表達的研究具有重要的作用。表達序列標籤還可以進行新基因的遺傳進化關係分析。表達序列標籤可以對所有動植物的基因作為一種資料庫，通過不同的序列比較可以獲得保守序列片段，從而獲得基因的遺傳進化圖譜。正因為表達序列標籤具有如此的優越性，因此表達序列標籤測序已經成為許多基因組研究機構的工作重點。
由於本發明人類肝臟特異表達基因與一些肝臟疾病相關，因此，研究人類肝臟中特異表達的表達序列標籤對探索肝臟疾病的發病機理及研製肝病的治療藥物具有重要意義。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一類在人類肝臟中表達的表達序列標籤。
本發明要解決的技術問題通過如下技術方案實現本發明提供了一類在人類肝臟中表達的表達序列標籤的序列，其包括(a)SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列；(b)SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列中每條序列的互補序列；(c)與SEQ ID No.1～SEQID No.50所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列，及(d)上述(a)～(c)中一條或數條的組合。
較佳地，所述序列包括具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列。
本發明還提供了一種探針分子，所述的探針分子含有上述序列中約8-100個連續的核苷酸。
由本發明的在人類肝臟中表達的表達序列標籤，可以方便的尋找出在人類肝臟中特異表達的表達序列標籤，從而尋找出人類肝臟疾病相關基因，從而在研究肝臟疾病的致病機理以及開發治療肝臟疾病的藥物中發揮重要作用。
具體實施例方式
下面結合附圖
對本發明作進一步詳細的說明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不是限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1人肝臟組織的mRNA的分離組織分離(Tissue isolation)肝臟來源於5個成年男性，在肝臟切除手術後，將肝臟組織立即置於液氮中冷凍保存。
mRNA的分離(mRNA isolation)取出肝臟組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩後，再移入玻璃勻漿器內，勻漿後移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量。用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。
實施例2cDNA文庫的構建(Constuct ion of cDNA library)以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA。補平末端後，加含EcoRI切點的接頭。磷酸化EcoRI末端後，用XhoI限制性內切酶消化1.5小時，再進行片斷分離。過柱篩選長度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉澱，無菌水溶解，連接至Uni-ZAP XR載體(Strategene，CA9203，USA)，以ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(Strategene，CA9203，USA)進行包裝，宿主菌使用XL 1 Blue MRF』(Strategene，CA9203，USA)細菌。塗板並測定滴度。
實施例3測序及資料庫建立(Seqencing and Database Constructing)挑選文庫中有外源片段插入的克隆，擴增後抽提質粒(QiagenGermany)，用T3和T7作為3』和5』端的通用引物，採用終止物螢光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行EST大規模測序。測序結果用FACTURA軟體去除載體序列，傳輸到SUN Ultra 450 Server上進行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟體包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟體搜索已有的資料庫(Genebank+EMBL)，將無同源性或同源性低於95％的序列視為新基因建立資料庫。
實施例4基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎上，進行cDNA全長克隆，分兩階段進行(1)「電子克隆」(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針搜尋dbEST資料庫，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達序列標籤(Expressed Sequence Tag，簡稱「EST」)序列認為同一序列(Consensus Sequence)，取出並用AUTOASSEMBLER軟體進行連接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟體分析被延伸的序列是否具有完整的開放閱讀框架(Open ReadingFrame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列的核苷酸和胺基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長完整性如何。通過電子克隆的方法，通常可獲取人肝臟相關基因的全長序列。
(2)cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNAEnds，RACE)如果通過「電子克隆」方法仍未得到完整的cDNA全長，則在已有序列5』或3』端設計引物，在人類肝臟Marathon-Ready cDNA文庫(Clontech Lab，Inc，USA)中進行長距離PCR反應。然後對PCR產物克隆、測序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟體分析被延長的序列有無完整的ORF，如無，重複上述過程直至獲得全長。
(3)RT-PCR對於5』和3』端的已知的序列，如果中間有一段間隙(gap)無法從已有的公共資料庫或自身資料庫獲得，可考慮採用RT-PCR的方法。在序列5』端設計引物，3』端引物採用Oligo-dT，在肝臟總RNA庫中進行擴增。然後對產物進行克隆、測序。最後拼接便獲得全長。
通過組合使用上述3種方法，可獲得人肝臟相關蛋白的全長編碼序列。
序列表110上海人類基因組研究中心120在人類肝臟中表達的表達序列標籤130NP-10157160502101211467212DNA213Homo sapiens40011 gctctatttt caggaaaatt tctatcatat aaaagcttat ttcagttatt ataaaagtgc61 ttattctctg gttatttctt ctttttatat aatcttgtca tgtttcatag tagcagtatc121 ttctgctatc tctctgagta tattaattat actttatttc tacttcagct actgttttct181 acaggacata ctgcctctaa ttcttaaaca ggttctggag tatgaactgt cttgtttctc241 attgacacaa cactctccag tcacatgtat tcggctttcc catttctgcc agttcctcct301 ttacatcttc caaaagttgt gtctctttaa tatgttgctt cctcttcctt atgcctgtgg361 atttatatat tttttagtct tttgctcaaa atttttagtc ccttactagg aaggaacatg421 gaaaaacatg tgttcaatca cgaagtttaa ctggaagtct gctgtta2102211461212DNA213Homo sapiens40021 aaaaaataaa aatcatttat ttaaacaaaa atatacacac agtgtacaat gaatatggtt61 tacacagaac aataaaacaa aaatgatatc tcttaaatgc caacataaaa tgatctattt121 atgcctagaa aaaatttcta ggaatacaca ttattgattc atctaaaata catatataac181 ataaaaagaa aacaaatgcc aacctttcag atgagtacca caaaaaccta aaagttaaat241 gttagattaa ataaaattat aaaatatcca cacgagaagt atgtgtatac aaagtattgt301 atgtatgcag tgaaatgaga gtgcccatac agttatatgc aaacttttga aagtttcata
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權利要求
1.一類分離出的在人類肝臟中表達的表達序列標籤的序列，其特徵在於，包括(a)SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列；(b)SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列中每條序列的互補序列；(c)與SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列，及(d)上述(a)～(c)中一條或數條的組合。
2.根據權利要求1所述的一類分離出的在人類肝臟中表達的表達序列標籤的序列，其特徵在於所述序列包括具有SEQ ID No.1～SEQ IDNo.50所示的序列。
3.一種探針分子，其特徵在於所述的探針分子含有權利要求1中所述的序列中約8-100個連續的核苷酸。
全文摘要
本發明公開了一類在人類肝臟中表達的表達序列標籤的序列。利用本發明的在人類肝臟中表達的表達序列標籤，可以方便的尋找出在人類肝臟中特異表達的表達序列標籤，從而尋找出人類肝臟疾病相關基因，從而在研究肝臟疾病的致病機理以及開發治療肝臟疾病的藥物中發揮重要作用。
文檔編號C12Q1/68GK1970757SQ20051011059
公開日2007年5月30日 申請日期2005年11月22日 優先權日2005年11月22日
發明者韓澤廣, 黃健 申請人:上海人類基因組研究中心